热休克反应和热休克转录因子1对LPS诱导的TNF-α和IL-15表达的影响

【目的】观察热休克反应(HSR)以及热休克转录因子1(HSFl)对LPS诱导的TNF-α和IL-15表达的影响。【方法】用200ng／ml LPS处理热休克或未热休克的小鼠RAW264．7巨噬细胞,抽提细胞的总RNA进行RT-PCR实验,观察TNF-α和IL-15 mRNA表达的情况;采用HSF1基因敲除小鼠经腹腔内注射LPS复制内毒素血症模型,抽提HSF1基因敲除小鼠(HSF1^--)和野生型小鼠(HSF1^ )肺组织的总RNA进行RT-PCR实验,观察TNF-α和IL-15 mRNA表达的情况。用TESS分析IL-15的启动子,寻找热休克元件(Heat shock element,HSE)。【结果】小鼠RAW264．7巨噬细胞受LPS刺激后,TNF-α和IL-15 mRNA的水平明显增加,而热休克抑制了LPS诱导的TNF-α和Il-15 mRNA的表达;腹腔注射LPS后,HSF1^--小鼠和HSF1^ 小鼠的肺组织中TNF-α和Il-15 mRNA的水平明显增加,HSF1^--小鼠的肺组织中TNF-α和IL-15 mRNA水平的增加明显高于HSF1^ 小鼠。经TESS软件分析发现IL-15的启动子区含有2个HSE。【结论】HSR、HSF1抑制了LPS诱导的TNF-α和IL-15的表达;HSF1可能通过与IL-15启动子区的HSE结合抑制LPS诱导的IL-15的表达。     

转染HSP70基因对过氧化氢所致RAW264.7细胞损伤的影响

[目的]观察HSP70基因过表达是否能减轻过氧化氢所致的RAW264.7巨噬细胞损伤.[方法]用脂质体包裹重组质粒pcDNA3.1-HSP70导入RAW264.7细胞株,经G418筛选阳性克隆,用Western blot方法检测HSP70的表达情况;通过测定细胞存活率、LDH释放率,观察了HSP70基因过表达对过氧化氢所致RAW264.7细胞损伤的影响.[结果]获得了HSP70过表达的RAW264.7细胞系;HSP70过表达组细胞的存活率及LDH释放率与对照组比有明显差异.[结论]转染HSP70基因对过氧化氢所致RAW264.7细胞损伤有明显的保护作用.     

诱导型热休克蛋白对小鼠缺血性急性肾衰的保护作用

目的采用HSF1基因敲除小鼠模型探讨诱导型热休克蛋白 (HSP)对小鼠缺血性急性肾衰的保护作用。方法野生型及HSF1基因敲除小鼠经钳夹左右两肾肾蒂 30min以阻断肾动脉血流 ,松开钳夹 2 4h后取血测定尿素氮 (BUN)及血清肌酐浓度 ;部分动物于肾缺血 -再灌注前 2 4h进行热休克处理 (肛温 42℃ ,15min)以诱导各种HSP的表达。结果肾缺血 -再灌注导致BUN及血清肌酐浓度明显升高 ,HSF1基因敲除导致二者上升更加明显。热休克预处理使野生型及杂合子小鼠肾组织中HSP70 ,HSP90α及HSP2 5表达明显升高 ,并明显减轻了肾缺血 -再灌注所致BUN及血清肌酐浓度的升高。HSF1基因敲除废除了热休克所致的HSP诱导表达及其对缺血性急性肾衰的保护作用。结论诱导型HSP在保护缺血所致的小鼠急性肾衰中发挥重要作用     

热休克因子在过氧化氢所致小鼠胚胎成纤维细胞损伤中的作用

[目的]探讨热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)对过氧化氢所致小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)损伤的影响.[方法]利用HSF1基因敲除(HSF1-/-)小鼠和转基因技术,通过稳定转染SV40大T抗原基因,建立缺失HSF1基因(HSF1-/-纯合子)和含有HSF1基因(HSF1 / 野生型)的永生化MEFs,并采用免疫印迹和基因组DNA PCR技术进行鉴定.向细胞培养基中加入终浓度为0.5 mmol/L的过氧化氢导致细胞损伤,采用甲苯胺兰染色和总蛋白合成能力分析方法来判定致细胞损伤程度(核仁的结构和功能改变).[结果]PCR产物电泳显示在各种基因型MEFs中均含有SV40大T抗原基因,在HSF1-/-MEFs中仅含有替代基因,在HSF1 / MEFs中仅含HSF1基因,在HSF1-/ MEFs中则含有替代基因和HSF1基因;免疫印迹显示热休克反应(heat shock response,HSR)不能诱导HSF1-/-MEFs中HSP70表达.甲苯胺兰染色和总蛋白合成能力分析显示0.5 mmol/L过氧化氢可引起HSF1 / MEFs及HSF1-/-MEFs核仁分离及蛋白质合成抑制,与正常对照组相比,P＜0.05;HSR能显著抑制过氧化氢所致HSF1 / MEFs核仁分离及蛋白质合成抑制,与单纯过氧化氢损伤组相比,P＜0.05,但HSR对过氧化氢所致HSF1-/-MEFs核仁分离及蛋白质合成抑制没有影响,与单纯过氧化氢损伤组相比,P＞0.05.[结论]HSR以一种HSF1依赖方式显著抑制过氧化氢所致细胞核仁结构与功能损伤.     

转录因子Foxp3对RAW264.7细胞表型及免疫抑制相关基因的影响

目的 应用过表达转录因子Foxp3的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞模型,探讨转录因子Foxp3对RAW264.7细胞表型及免疫抑制相关基因的影响,从而为移植排斥提供新的细胞治疗措施奠定基础.方法 采用脂质体转染重组质粒pIRES2-EGFP/mFoxp3及空载质粒pIRES2-EGFP至小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系,经G418筛选后,免疫荧光显微镜及流式细胞术检测GFP表达、RT-PCR检测Foxp3表达以鉴定表达效果;采用RT-PCR检测转染重组质粒pIRES2-EGFP/mFoxp3、空载质粒pIRES2-EGFP以及未转染质粒组的RAW264.7细胞表面分子CTLA-4、GITR及GITRL的表达水平;采用RT-qPCR的方法检测各组RAW264.7细胞iNOS及Arg1的表达水平.结果 成功建立稳定表达Foxp3的巨噬细胞RAW264.7细胞模型;与转染空载质粒pIRES2-EGFP和未转染质粒的RAW264.7细胞相比,转染重组质粒pIRES2-EGFP/mFoxp3的RAW264.7细胞的表面分子CTLA-4、GITR及GITRL 的mRNA表达水平明显升高（P〈0.01）,免疫抑制相关基因iNOS及Arg1的 mRNA表达水平也明显升高（P〈0.01）.结论 转录因子Foxp3能够使RAW264.7细胞表面分子及免疫抑制相关基因的表达水平明显升高,可能发挥抑制免疫应答的作用,从而在治疗移植排斥中发挥作用.     

HSF1与HMGB1和IL-10作用分子机制的体外研究及意义

目的:本研究以RAW264.7细胞系为研究对象,烧伤血清刺激建立烧伤细胞模型,在体外研究HSF1的抗炎症机制.方法:Western blot法检测烧伤血清刺激前后RAW264.7细胞中HSF1与NF-κB表达,凝胶阻滞法(EMSA)检测HSF1与炎症因子HMGB1和抗炎症因子IL-10基因启动子区相互作用,同时检测NF-κB是否参与上述的相互作用.结果:正常培养条件下的RAW264.7细胞几乎不表达HSF1,少量表达NF-κB,加入烧伤血清刺激后大量表达HSF1和NF-κB.HSF1与HMGB1和IL-10基因的启动子区HSE有相互作用.NF-κB不参与HSF1与HMGB1和IL-10基因启动子区HSE的结合.结论:HSF1与HMGB1和IL-10的启动子区HSE结合,抑制HMGB1的表达,促进IL-10的表达.在炎症反应中HMGB1和IL-10的表达不直接受NF-κB的调节.     

热休克反应对HMGB1表达及LPS诱导的HMGB1释放的影响

【目的】观察热休克反应对高迁移率族蛋白 1(HMGB1)表达及内毒素(LPS)诱导的 HMGB1 释放和移位的影响。【方法】用500 ng/ml LPS处理小鼠RA)264.7巨噬细胞20 h,)estern blot分析HMGB1在胞核及其培养上清中的改变;热休克模型通过RA)264.7 细胞置 42.5℃水浴锅中孵育 1 h,然后在 37℃恢复12 h后制备;通过)estern blot分析,观察热休克反应对HMGB1表达及LPS诱导的HMGB1释放及其移位的影响。【结果】HMGB1蛋白表达水平在热休克反应 4 h后减少,8 h后明显减少,12 h后逐步恢复至正常水平;RA)264.7细胞受LPS处理20 h后,细胞培养基中HMGB1的水平明显增加,胞核HMGB1含量减少,而热休克预处理抑制了LPS诱导的HMGB1释放及胞核HMGB1减少。【结论】热休克能影响HMGB1的基因表达;热休克反应抑制LPS诱导的HMGB1释放及其移位。     

葛根素抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞表达诱导型一氧化氮合酶

目的观察葛根素对脂多糖（LPS）诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的影响。方法用脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,与不同浓度的葛根素进行培养,采用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）和免疫蛋白印迹法测定（Western blotting）方法分别检测RAW264.7巨噬细胞iNOS mRNA和蛋白质表达。结果随着葛根素的浓度的增加,RAW264.7细胞iNOS的mRNA及其蛋白质表达逐渐减少(P<0.01)。结论葛根素可以通过调节RAW264.7细胞表达iNOS发挥抗炎的作用。     

谷氨酰胺在体内/外对巨噬细胞炎症因子分泌的影响

目的 观察谷氨酰胺(Gln)在体内/外条件下对巨噬细胞炎症反应及热休克蛋白(HSP)表达的影响,探讨Gin在脓毒症时抑制体内炎症反应的机制.方法 实验 1:将培养的腹腔巨噬细胞株RAW264.7分为Gln 0、0.5和8 mmol/L 3组,分别于内毒素脂多糖(LPS)刺激后0、1、4、12和24 h收集细胞及上清液.实验2:45只昆明小鼠被随机均分为假手术(Sham)组、模型组、Gin组;采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备小鼠脓毒症模型,术后即刻从尾静脉注射Gin 0.75 g/kg(Gln组)或等量生理盐水(Sham组和模型组).6 h后采血,腹腔灌洗分离巨噬细胞.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液、血清、巨噬细胞裂解液中肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-10浓度;用蛋白质免疫印迹法检测巨噬细胞HSP72蛋白表达.结果 体外条件下Gin可显著促进RAW264.7细胞释放TNF-a,IL-6和IL-10,呈剂量和时间依赖性(P＜0.05或P＜0.01),LPS刺激4 h后,Gln 8 mmol/L组RAW264.7细胞HSP72表达显著增加(P均＜0.01).体内条件下,Gin组腹腔巨噬细胞TNF-a、IL-6含量均明显低于模型组(P＜0.01和P＜0.05),3组间IL-10含量比较差异无统计学意义;Gln组血清TNF-a浓度明显低于模型组(P＜0.05),两组血清IL-6、IL-10浓度差异无统计学意义;Gin组巨噬细胞HSP72表达较模型组和Sham组均显著升高(P均＜0.01).结论 Gin体外作用时可显著促进巨噬细胞释放TNF-a和IL-6,且该作用不能被HSP72表达所抑制.体内作用条件下Gln抑制腹腔巨噬细胞合成TNF-a和IL-6.体外和体内条件下Gln都可诱导巨噬细胞表达HSP72,提示HSP72表达可能不是Gln在脓毒症时抑制机体炎症反应的主要机制.     

Chilo suppressalis heat shock proteins are regulated by heat shock factor 1 during heat stress

Heat shock factor 1 (HSF1) functions to maintain cellular and organismal homeostasis by regulating the expression of target genes, including those encoding heat shock proteins (HSPs). In the present study, the gene encoding HSF1 was cloned from the rice pest Chilo suppressalis, and designated Cshsf1. The deduced protein product, CsHSF1, contained conserved domains typical of the HSF1 family, including a DNA-binding domain, two hydrophobic heptad repeat domains, and a C-terminal transactivation domain. Real-time quantitative PCR showed that Cshsf1 was highly expressed in hemocytes. Expression analysis in different developmental stages of C. suppressalis revealed that Cshsf1 was most highly expressed in male adults. RNAi-mediated silencing of Cshsf1 expression reduced C. suppressalis survival at high temperatures. To investigate the regulatory interactions between Cshsf1 and Cshsps, the promoters and expression patterns of 18 identified Cshsps in C. suppressalis were analysed; four types of heat shock elements (HSEs) were identified in promoter regions including canonical, tail–tail, head–head, and step/gap. The expression of Cshsp19.0, Cshsp21.7B, Cshsp60, Cshsp70 and Cshsp90 was positively regulated by Cshsf1; however, Cshsp22.8, Cshsp702, Cshsp705 and Cshsp706 gene expression was not altered. This study provides a foundation for future studies of HSF1 in insects during thermal stress.     

热休克及化疗刺激对人白血病细胞K562中HSP70 mRNA及MDR1 mRNA表达的影响

为了研究热休克、Adriamycin（ADM）化疗应激刺激下热休克蛋白70（HSP70）、多药耐药基因MDRl的表达情况，对K562细胞予以43℃高温热休克和（或）加以ADM化疗，然后采用免疫组织化学方法检测HSP70的表达，MTT法检测K562细胞的生长抑制率，RT—PCR检测HSP70 mRNA和MDRl mRNA的表达，流式细胞术检测P-糖蛋白（P—gP）的表达。结果显示：①HSP70蛋白的合成在43℃热作用后恢复37℃孵育2小时达到高峰并聚集在胞核和核仁内，呈“核内迁移”现象；3小时后HSP70表达开始降低，5小时后HSP70的合成逐渐降低至正常，并恢复以胞浆表达为主。②K562细胞在43℃高温热休克刺激下HSP70mRNA表达增加，随着37℃孵育时间的延长表达量有增多趋势并持续一段时间，MDRlmRNA的表达与之相似，二者在37℃孵育2小时分别增加4倍和5．8倍。③ADM化疗刺激后细胞内P—gP表达增加；ADM化疗、43℃热休克刺激后再加ADM化疗，K562细胞中HSP70 mRNA、MDRl mRNA表达均上调，且43℃热休克刺激处理后再加入ADM作用二者的表达要高于单加ADM化疗组。结论：热休克和ADM化疗刺激的K562细胞中HSP70和MDRl表达增加，有利于维护肿瘤细胞的稳定性，HSP70可能与耐药有关。     

热休克预处理对肠上皮细胞缺氧-再给氧损伤的保护作用及其机制

目的 :观察热休克预处理对肠上皮细胞 (IEC 6 )缺氧再给氧损伤的影响 ,并探讨热休克蛋白 70(HSP70 )的细胞保护作用。方法 :体外培养 IEC 6细胞 ,分为正常对照组、单纯缺氧再给氧组及热休克预处理组 ,观察缺氧再给氧后各组细胞 HSP70及 Bcl 2表达及细胞活力、乳酸脱氢酶 (L DH)漏出情况 ;用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果 :热休克预处理可诱导 HSP70产生 (P <0 .0 1) ,显著增加缺氧再给氧处理后IEC 6细胞活力 (P<0 .0 5 ) ,使 L DH漏出减少 (P<0 .0 5 ) ,凋亡相关基因 Bcl 2表达明显增加 (P<0 .0 1) ,细胞凋亡率明显降低 (P<0 .0 1)。结论 :热休克预处理可能通过诱导 HSP70表达来减轻肠上皮细胞缺氧再给氧损伤 ;增加细胞 Bcl 2基因表达并抑制肠上皮细胞缺氧再给氧后细胞凋亡可能是其保护作用机制之一。     

热休克预处理对严重烫伤大鼠胃黏膜氧自由基的作用

目的:观察热休克预处理对严重烫伤大鼠胃黏膜氧自由基及热休克蛋白(HSP)70表达的影响,探讨氧自由基在大鼠烫伤后急性胃黏膜损伤中的作用及热休克预处理对严重烫伤大鼠胃黏膜的保护作用机制。方法:将96只Wistar大鼠随机分为烫伤组(B组,n=48,其中8只大鼠作为正常对照)及热休克预处理后烫伤组(HB组,n=48,其中8只大鼠作为实验对照),观察各时相点两组大鼠胃黏膜损伤指数(UI)、胃黏膜丙二醛(MDA)及胃黏膜细胞SOD活性变化。应用免疫组化染色分析胃黏膜细胞中HSP 70表达变化。结果:大鼠严重烫伤后胃黏膜细胞SOD大量消耗,MDA显著增加,胃黏膜损害明显;热休克预处理能显著减轻大鼠严重烫伤后急性胃黏膜损害。HB组较B组大鼠胃黏膜HSP 70表达水平显著升高(P<0.05),热休克预处理能显著降低胃黏膜细胞SOD的消耗,减少MDA的产生。胃黏膜损伤指数(UI)与MDA呈显著正相关(r=0.695,P<0.01),与HSP 70呈显著负相关(r=-0.794,P<0.01);胃黏膜SOD与MDA呈显著负相关(r=-0.823,P<0.01),而与HSP 70呈显著正相关(r=0.527,P<0.05)。结论:严重烫伤大鼠胃黏膜存在氧自由基损伤;热休克预处理可显著减轻烫伤大鼠胃黏膜氧自由基损伤,保护机制与HSP 70保护抗氧化酶SOD活性密切相关。     

局部微波热疗对热休克蛋白表达的影响

目的探讨骨肉瘤术中热疗对热休克蛋白表达的影响。方法对61例骨肉瘤组织进行免疫组化染色,观察热休克蛋白HSP-60、HSP-70及GP-94的表达。结果骨肉瘤组织中GP-94表达最高,阳性率为100%,其次为HSP-60,阳性率为94.5%,HSP-70弱表达,阳性率41.8%。热疗后HSP均不同程度增多,以HSP-70较明显,阳性率上升到72%。体外骨肉瘤细胞株加热后热休克蛋白也明显增多。结论局部微波热疗后,3种热休克蛋白在骨肉瘤组织均有表达。     

热休克蛋白70在大鼠黑质多巴胺神经元损伤中的表达

目的 :探讨热休克蛋白 70 (HSP70 )在大鼠黑质多巴胺 (DA)神经元损伤中的表达以及在帕金森病 (PD)诊断中的意义。方法 :将 48只大鼠随机分为黑质DA神经元损毁组 (PD组 )和对照组各 2 4只。PD组注射 6 羟多巴胺 (6 OHDA)损毁大鼠黑质DA神经元 ,对照组仅注射 6 OHDA溶媒。于注射后 1、7、14及 2 1d采用免疫组织化学、尼氏染色、电镜手段动态观察HSP70在损毁的DA神经元中的表达以及DA神经元形态学变化。结果 :在 6 O HDA损毁黑质 1～ 2 1d ,对照组黑质HSP70表达和尼氏细胞计数差异无显著性 (P >0 .0 5 )。PD组HSP70表达在 1d最高 ,7d锐减 ,14和 2 1d则逐渐减少 ,分别为 2 5 %、74%、87%及 88% ;尼氏细胞计数在 4个时间点分别减少1%、13%、35 %及 48% ;超微结构损伤程度呈进行性加重。结论 :PD渐进性发病具有其形态学基础 ,HSP70可作为DA神经元存活的指标和早期诊断PD的指标。     

热休克蛋白90α、70、27mRNA在急性白血病细胞中表达的研究

运用RNA分子杂交的方法,观察了热休克蛋白(heat shock protein,HSP)90α、70、27在22例白血病病人细胞,正常血细胞及K562红白血病细胞系中的表达。结果表明:16例白血病病人中,4例急性淋巴细胞白血病(ALL),6例急性非淋巴白血病(ANLL)、1例慢性粒细胞白血病急变期(慢粒急变)和2例骨髓增生异常综合征(MDS)血细胞呈现HSP27高水平表达,较正常血细胞显著增多,ALL(5例)与ANLL(7例)白血病细胞HSP27表达水平无明显改变。检测了7例白血病细胞HSP70的表达水平,除1例ALL及1例MDS明显升高外,其余5例(包括1例ALL,3例ANLL和1例慢粒急变)显著低于正常血细胞。17例白血病病人细胞(包括9例ANLL、5例ALL、2例慢粒急变和1例MDS)HSP90α表达水平均升高,明显高于正常。结果提示:白血病细胞HSP90α表达水平的升高可能与白血病细胞活跃异常增殖有关,而HSP27基因的高表达可能不是某种急性白血病的特殊标志。     

从K562细胞中提取热休克蛋白GP96及其对人树突状细胞分化和功能的影响

本研究旨在建立从K5 6 2细胞系中提取热休克蛋白GP96的方法 ,进而研究GP96对人树突状细胞分化和功能的影响。采用蛋白分离提纯技术 ,将K5 6 2细胞裂解 ,经饱和硫酸铵沉淀、亲和层析、离子交换层析后提纯出热休克蛋白GP96 ,用SDS PAGE凝胶电泳和Westernblot方法对其进行鉴定。将提纯的GP96加入从正常人外周血单个核细胞诱导培养的树突状细胞 (dendriticcell,DC)中 ,通过流式细胞术检测DC细胞表型变化 ,用MTT法测定混合淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)。结果表明 :从 1× 10 1 0 K5 6 2细胞中能提纯出热休克蛋白GP96 6 0 - 80 μg ;加入GP96制备的HSP DC ,其细胞表面标志CD83、CD86和HLA DR的表达率比常规培养DC明显升高 ,CD1a表达率降低 (P <0 .0 5 ) ;HSP DC比常规培养DC具有更强的刺激混合淋巴细胞反应的能力 (P <0 .0 5 )。结论 :从K5 6 2细胞中可以提取出热休克蛋白GP96 ;热休克蛋白GP96可以促进树突状细胞分化成熟 ,使其具有更强的刺激同种异体人T淋巴细胞增殖的能力     

放线菌素D诱导卵巢癌细胞凋亡中热休克蛋白(HSP)的作用的研究

目的探讨热休克蛋白(heat shock protein,HSP)在放线菌素D(actinomycin D,Act-D)诱导卵巢癌细胞A2780凋亡中的作用,为进一步探讨热休克蛋白抗凋亡机制及卵巢癌生物治疗提供实验依据。方法体外培养的卵巢癌细胞A2780于RPMI1640,10%(v/v)胎牛血清,5%(v/v)CO_2孵育,取指数生长期细胞1×10~5/ml接种反应板24h,分为非热休克组(NHS)和热休克组(HS),两组分别由不同浓度(5,10,20μg/ml)Act-D诱导,作用4h。采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)和~3H-TdR掺入试验检测肿瘤细胞凋亡指数(AI)及DNA合成情况。结果HS组比NHS组凋亡指数明显下降(P<0.01);cpm值明显升高(P<0.01),呈现剂量依赖效应。结论热休克反应对卵巢癌细胞A2780经Act-D诱导凋亡具有抑制作用,此作用与Act-D呈剂量依赖效应。