当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的：研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养。MSC用20μl当归注射液／ml含10％胎牛血清的L—DMEM为预诱导条件，预诱导24h后用当归注射液100μl/ml不含胎牛血清的L—DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP性。结论:大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮干细胞

目的：探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮干细胞的可行性。方法：直接抽取成年健康志愿者骨髓，采用直接贴壁法培养获得较纯的人骨髓间充质干细胞；用免疫组织化学方法进行表面标志的检测、鉴定及培养扩增后，以HaCaT细胞培养上清液联合表皮生长因子（EGF）诱导分化，透射电镜下观察细胞形态的变化；并运用免疫组织化学方法检测K10，K19及β1整合素的表达。结果：诱导BMSCs1周后可见大量扁平的多角形细胞紧密连接成片，呈铺路石状排列生长，胞浆内可见丰富的角蛋白丝；大量细胞K19和β1整合素双染阳性，个别细胞K10染色阳性。结论：BMSCs在HaCaT细胞培养上清液联合EGF的体外培养条件下可诱导分化为表皮干细胞。     

龟板对脑缺血大鼠骨髓间充质干细胞移植后转分化为神经元的影响

自Prockop于1997年报道了骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)可以分化为神经细胞以来,MSC为中枢神经系统损伤的替代修复提供了诱人前景。但是,MSC进行在体移植时,其神经元的分化率较低,为此,从中药中寻找提高神经元分化率的有关药物成为我们的研究目标。     

益气汤含药血清诱导骨髓间充质干细胞干预大鼠骨性关节炎实验研究

目的:探讨益气汤含药血清诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对骨性关节炎大鼠的干预作用。方法:取SD大鼠骨髓,筛选、纯化并鉴定BMSCs,分别给予生理盐水与益气汤干预后获取血清。将实验动物分为对照组、生理盐水组、益气汤组。含药血清干预后观察大鼠毛色、食欲及活动情况等,同时测量大鼠体质量,治疗6周后取膝关节病理检查。结果:益气汤血清干预BMSCs电镜下观察细胞形态均一,边界清楚。生理盐水组膝关节炎程度退变明显。骨性关节炎模型大鼠运用益气汤含药血清干预BMSCs治疗后,原发病变缓解,关节组织滑膜病理检查均未见明显异常。结论:益气汤含药血清诱导下BMSCs能有效修复骨性关节炎大鼠软骨的退变和损伤。     

益气汤含药血清诱导骨髓间充质干细胞干预大鼠骨性关节炎实验研究

目的:探讨益气汤含药血清诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对骨性关节炎大鼠的干预作用。方法:取SD大鼠骨髓,筛选、纯化并鉴定BMSCs,分别给予生理盐水与益气汤干预后获取血清。将实验动物分为对照组、生理盐水组、益气汤组。含药血清干预后观察大鼠毛色、食欲及活动情况等,同时测量大鼠体质量,治疗6周后取膝关节病理检查。结果:益气汤血清干预BMSCs电镜下观察细胞形态均一,边界清楚。生理盐水组膝关节炎程度退变明显。骨性关节炎模型大鼠运用益气汤含药血清干预BMSCs治疗后,原发病变缓解,关节组织滑膜病理检查均未见明显异常。结论:益气汤含药血清诱导下BMSCs能有效修复骨性关节炎大鼠软骨的退变和损伤。     

大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的体外诱导分化

目的 通过体外药物诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化，进一步验证其多能分化特性。方法 分离培养大鼠MSCs，5－脱氧杂氮胞苷（5－Aza－cdR）作用24h后继续培养4wk，电镜超微结构观察，免疫细胞化学染色鉴定。结果 5－Aza-cdR诱导4wk后的部分大鼠骨髓间充质干细胞α-Actinin,Troponin T阳性表达，电镜观察可见横纹样结构形成，核呈卵圆形，位于细胞中央位置，胸质中可见富集的糖原颗粒及大量线粒体。结论 MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞，能在体外条件下经5－Aza-cdR诱导分化成心肌细胞。     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用，为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法体外培养MSCs至第5代后，分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs，诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数，对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较；诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态；BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长；BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰，而β-ME在诱导2h即达高峰，但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性，而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性；RT-PCR显示NSE、NFL，MAP-2的mRNA表达阳性，GFAP有较弱的表达；蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞．而且分化后细胞的存活时间长．有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导为胰岛样细胞体外实验

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）在不同葡萄糖浓度培养基中诱导效果的差异.方法：采用电镜观察细胞形态学变化、双硫腙（DTZ）染色鉴定胰岛素分泌细胞的存在;放射免疫分析法观察诱导后BMSCs细胞对葡萄糖刺激试验的反应;免疫细胞化学分析鉴定细胞内胰岛素分泌以及Real-timePCR鉴定胰岛β细胞相关基因mRNA表达水平.结果：电镜观察可见诱导后的细胞具备典型分泌细胞特点,DTZ染色显示各诱导组细胞团为棕红色,细胞浆中富含锌离子,而对照组则无染色,表明胰岛素分泌样细胞的存在.经不同浓度葡萄糖诱导后其吸光度值A值：低糖5.5mmol/L诱导组（4.75±1.87）,中糖11.1mmol/L诱导组（10.96±2.06）,高糖25mmol/L诱导组（12.53±2.04）,且各诱导组吸光度值A值随着培养基葡萄糖浓度的不断增加,A值也在不断增高.Real-timePCR定量分析结果显示,诱导后胰岛β细胞相关基因GK,PDX-1,ngn3,GLP-1mRNA的表达水平变化显著,差异具有统计学意义（P〈0.01）.胰岛素分泌量高糖25mmol/L诱导组（6.64±0.46）IU/L高于其他各组,差异具显著性（P〈0.01）.结论：培养基葡萄糖浓度对大鼠BMSCs诱导为胰岛样细胞具有一定影响,以高糖培养基的诱导效果较好.     

骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨大鼠骨髓间充质干细胞 ( rat mesenchymal stem cells,r MSCs)体外诱导分化成神经元的能力。方法 :用 0 .2 5、0 .5、1 .0 mmol· L-1IBMX诱导传代的 r MSCs,待细胞分化后进行形态学观察 ,并用免疫细胞化学方法进行细胞鉴定。结果 :0 .5 mmol· L-1IBMX诱导细胞效果最好 ,2 d即可见有神经元样细胞出现 ,6d神经元样细胞占细胞总数的 ( 2 3.2± 2 .3) %,NSE染色阳性。未分化细胞表达 nestin,诱导 3d,阳性细胞增多 ,6d减少。结论 :体外 r MSC能扩增、传代 ,并被诱导分化成神经元样细胞     

兔骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (bonemarrowmesenchymalstemcells ,BM -MSCs)向神经元定向诱导分化及分化前后体外培养的条件。方法 :无菌条件下收集兔股骨骨髓 ,用相对密度为 1 0 77的淋巴细胞分离液分离出白膜层细胞群 ,贴壁法筛检其中的MSCs ,用DMEM H条件培养基进行原代及传代培养。分别取 5和 10代的MSCs向神经元定向诱导。诱导后更换为神经培养基继续培养 ,并在 1～ 2 0d用免疫细胞化学方法检测分化细胞的特异性表面标志。结果 :兔骨髓MSCs在DMEM H条件培养基中建立高纯度的细胞培养 ,能够稳定地连续传代达 10代以上。不同代数的MSCs诱导后均表达巢蛋白 (nestin)和神经特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE)。诱导后NSCs在神经培养基中继续存活 2 0d以上 ,但未见扩增。结论 :兔骨髓MSCs能够诱导表达神经元特异性标志 ,且诱导前后的MSCs均可在体外培养条件下存活。     

龟板含药血清对大鼠骨髓间质干细胞体外增殖的影响

[目的]观察益肾中药龟板血清对大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)体外增殖的影响。[方法]使用密度梯度法分离大鼠骨髓间质干细胞进行培养,经5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记和CD44染色及两者双重染色鉴定后,分别从光学显微镜下的形态学特征、免疫细胞化学染色后的MSC表型特征、四甲基偶氯唑盐(MTT)染色后MSC的吸光值以及以Brdu、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色后MSC的阳性细胞数变化等角度观察在培养液中添加不同浓度龟板血清条件下MSC的生长变化。[结果]不同浓度的龟板血清均以浓度依赖方式促进MSC增殖活力和增加Brdu、PCNA阳性细胞数,与对照组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。[结论]龟板血清可促进MSC的增殖而有利于细胞脱氧核糖核酸(DNA)合成,推测这可能是龟板补肾的机理之一。     

龟甲提取物对骨髓间充质干细胞增殖过程中核受体的影响

【目的】观察龟甲(也称龟版或龟板)提取物对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖过程中核受体 (nuclear receptor,NR)表达的影响。【方法】采用密度梯度法分离大鼠MSC进行培养,经5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记和 CD44免疫组化染色鉴定后,分别以高、中、低剂量的龟甲提取物(3 333、333．3、33．33μg／mL)加入到体外培养的MSC中, 与龟甲提取物作用12、24、72、120 h后,采用免疫组化法和免疫荧光细胞化学法检测MSC的视黄酸受体(retinoic acid receptor-α,RARα)、维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)、雌激素受体(estrogen reeepror,ER)、糖皮质激素受体 (glucocorticoid receptor,GR)、甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor-α,TRα)和过氧化物酶体增殖物活化受体(peroxisome proliferator activated receptor-δ,PPARδ)的表达。【结果】高、中、低剂量龟甲提取物组的MSC的RARα、VDR表达阳性细胞均高于对照组(P<0．05或P<0．01),且呈剂量依赖性;作用24 h后RARα表达达峰值,作用72 h后VDR表达达峰值。未检测到ER、GR、PPARδ、TRα阳性反应细胞。【结论】视黄酸受体α和维生素D受体可能为龟甲提取物促MSC增殖的药理靶点。     

龟板对局灶性脑缺血后神经干细胞的作用

[目的]探讨补肾中药龟板对局灶性脑缺血后神经干细胞的作用。[方法]采用大脑中动脉线栓法造成局灶性脑缺血大鼠模型。应用免疫组织化学技术检测神经上皮干细胞蛋白（Nestin)的表达。[结论]提示补肾中药龟板可减轻神经损伤症状和对局灶性脑缺血后神经干细胞有促进增殖作用。     

三七总皂苷对骨髓间充质干细胞增殖和向心肌样细胞分化的影响

【目的】观察三七总皂苷(PNS)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖和体外诱导其分化为心肌样细胞的作用。【方法】采用骨髓细胞体外培养技术分离大鼠MSCs,以流式细胞仪检测细胞表面标志;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察PNS对MSCs增殖的影响;采用第8代MSCs进行体外心肌细胞诱导分化;采用相差显微镜、免疫组化及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)结果鉴定心肌细胞。【结果】大鼠MSCs细胞表面抗原CD44阳性,CD34阴性;经PNS作用后MSCs增长速度比空白对照组明显加快,体外诱导后细胞形态发生变化,其细胞免疫组化鉴定呈结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnI)阳性;RT-PCR结果显示诱导后细胞转录肌球蛋白重链mRNA水平增加。【结论】PNS能促进大鼠MSCs体外增殖并可诱导MSCs分化为心肌样细胞,这为细胞移植治疗心肌梗死提供了实验依据。     

杜仲对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

【目的】探讨杜仲对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响。【方法】分别取10日龄SD大鼠胫骨、股骨的骨髓,过滤离心后将所得BMSCs进行体外单层培养、扩增,采用DMEM培养基,37℃、体积分数5%CO2条件培养。在细胞达到80%～90%融合时,使用2.5 g/L胰酶消化传代。将传代细胞分别置于空白血清培养液(对照组)、杜仲水提取物含药血清及杜仲醇提取物含药血清培养液进行培养,观察细胞在3种条件下的形态、贴壁生长、增殖、集落等情况,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法绘制生长曲线,比较3种培养条件下达到100%融合的时间。【结果】杜仲水提取物组、杜仲醇提取物组对大鼠BMSCs增殖的影响显著高于空白血清对照组(P<0.05),且杜仲醇提取物组作用优于杜仲水提取物组(P<0.05)。【结论】杜仲对大鼠BMSCs增殖具有一定促进作用。     

人参总皂甙诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

【目的】观察人参总皂甙(GS)对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的诱导作用。【方法】取成年SD大鼠骨髓细胞,采用密度梯度分离法与贴壁法结合获取MSCs,进行原代培养和克隆培养;采用流式细胞仪检测细胞表面抗原 CD34和CD44以鉴定该法所获细胞是否为MSCs;对传至第8代的MSCs进行分组诱导,分别为GS组(终末浓度为 250 mg／L)、5-氮胞苷(5-aza)组(终末浓度为10μmoL／L)、GS 5-aza组(终末浓度分别为250 mg／L、10μmol／L),每组再分 3个亚组,分别对MSCs进行24、48、72 h诱导,并设空白对照组;采用共聚焦荧光显微镜观察细胞数及阳性细胞数,计算心肌样细胞转化率;采用免疫组化法检测分化的心肌样细胞的特异性蛋白结蛋白(Desmin)和肌钙蛋白(cTnI),采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测诱导前后心肌细胞特征性基因α-心肌肌球蛋白重链(α-MHC)和β-心肌肌球蛋白重链(β- MHC)的表达。【结果】分离培养后的细胞生长密集,形态呈纺锤状,表面抗原鉴定为CD44表达阳性,表明所获细胞为 MSCs;经GS、5-aza诱导后,MSCs分化成类心肌细胞,3组的心肌样细胞转化率无显著性差异(分别为38％、35％、39％); 免疫组化和RT-PCR检测结果显示Desmin、cTnI和MHC表达均阳性,阳性细胞呈梭形和成纤维细胞样形态,表明MSCs在 GS体外诱导下已向心肌样细胞转化,并具有心肌样细胞的特性。【结论】GS可体外诱导MSCs分化为心肌样细胞,为细胞移植治疗心肌梗死提供了实验依据。     

袁氏生脉成骨胶囊对激素诱导骨髓基质细胞成脂分化的拮抗作用

【目的】观察中药袁氏生脉成骨胶囊(主要由丹参、川芎、鸡血藤、黄芪组成)对激素诱导骨髓基质细胞成脂分化的拮抗作用,探讨袁氏生脉成骨胶囊防治激素性股骨头坏死的病理机制。【方法】采用骨髓细胞体外培养技术和血清药理学方法,分离培养大鼠骨髓基质细胞;地塞米松诱导骨髓基质细胞的成脂分化,以含中药血清作为拮抗剂。检测培养细胞的甘油三酯含量和碱性磷酸酶活性。【结果】分离细胞培养4d后可以观察到大量成骨细胞、成纤维细胞、破骨细胞;模型组加入地塞米松造模;成骨胶囊药物组地塞米松用法同模型组,同时加入含药血清。6d后,光镜下观察成骨胶囊药物组见少量脂肪细胞,模型组脂肪细胞明显增多。成骨胶囊药物组碱性磷酸酶活性高于模型组(P<0.05);甘油三酯含量低于模型组(P<0.01)。【结论】中药袁氏生脉成骨胶囊能够有效拮抗激素诱导骨髓基质细胞成脂分化。提示活血化瘀类中药防治股骨头坏死的机理不仅是改善了股骨头的微循环,而且抑制了骨髓基质细胞成脂分化,增加了成骨细胞的表达。     

成人脂肪来源干细胞定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

[目的] 诱导脂肪组织来源干细胞(ADSCs)定向分化为软骨细胞并进行鉴定,为软骨组织工程获取大量种子细胞做准备.[方法] 对患者抽脂术的脂质部分进行分离培养及传代,采用四氮唑复合物(MTT)法测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线,通过流式细胞仪将培养的细胞行干细胞鉴定,将第4代的ADSCs向软骨细胞定向诱导分化并行阿新蓝染色鉴定;免疫组化检测成软骨方向诱导后的ADSCsⅡ型胶原的表达.[结果] ADSCs体外增殖速度快,并且保持稳定的倍增率直至13～15代;流式细胞仪分析提示该细胞具有干细胞特性;通过定向分化技术,ADSCs可向软骨细胞分化,阿新蓝染色及Ⅱ型胶原表达均呈阳性,说明定向分化后的细胞具备正常软骨细胞的功能.[结论] 成功诱导ADSCs向软骨细胞定向分化,为软骨组织工程提供了可靠的种子细胞.     

5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及成肌分化的影响

[目的]观察5-氮杂胞苷(5-Aza)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖和成肌分化的影响.[方法]无菌条件下取SD大鼠骨髓组织,采用密度梯度离心法分离大鼠MSCs,传3代后的MSCs采用双标免疫组化法鉴定后,随机分为4组:浓度为5、10、15μmol/L的5-Aza组和空白对照组,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度5-Aza对MSCs生长增殖的影响;以含5、10、20μmol/L5-Aza的培养基诱导培养MSCs 24 h后,改用完全培养基继续培养,采用免疫组织染色法鉴定5-Aza诱导分化3、7、14d后细胞肌分化相关蛋白肌凝蛋白(myosin)和结蛋白(desmin)的表达情况.[结果]双标免疫组化染色结果显示:所培养细胞同时表达Brdu和CD44、CD54,表达率达96%,鉴定结果表明所培养细胞为MSCs;5、10μmol/L5-Aza对MSCs增殖无显著影响(P>0.05),15μmol/L5-Aza可显著抑制MSCs生长(P<0.05);不同浓度5-Aza诱导培养MSCs后第3天,部分细胞出现desmin阳性表达,诱导后14 d,部分细胞表达myosin,以10μmol/L5-Aza组作用为佳.[结论]高浓度5-Aza可抑制MSCs体外增殖;适宜浓度的5-Aza可诱导MSCs向成肌细胞定向分化.