康莱特注射液诱导肝癌细胞凋亡及其对凋亡蛋白procaspase-3和caspase-9表达的影响

目的:探讨康莱特注射液(Kanglaite)对人肝癌BEL-7404细胞的增殖抑制作用、凋亡诱导作用以及对凋亡蛋白procaspase-3和caspase-9表达的影响.方法:采用MTT法检测康莱特注射液和阳性对照顺铂(cisplatin ,DDP)对BEL-7404细胞的增殖抑制作用,Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核的情况,FCM检测细胞凋亡率,Western印迹法检测凋亡蛋白procaspase-3和caspase-9的表达.结果:MTT结果显示,经不同体积浓度康莱特注射液(10、20、40、80及160 μL/mL)作用BEL-7404细胞后,80 μL/mL康莱特注射液作用48 h时对肝癌BEL-7404细胞有明显的抑制增殖作用;Hoechst 33258染色可见细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变;FCM法检测结果提示,空白对照组、DDP 10 μg/mL组和康莱特注射液80 μL/mL组的凋亡率分别为(1.23±0.40)%、(32.53±0.65)%和(3.13±0.32)% (P＜0.01);Western印迹法检测结果提示,康莱特注射液及DDP作用48 h后 procaspase-3蛋白的表达量明显降低 (P＜0.01),caspase-9蛋白的表达量显著升高(P＜0.01).结论:康莱特注射液可抑制肝癌BEL-7404细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与凋亡相关蛋白procaspase-3表达下调及caspase-9表达上调有关.     

康莱特抑制肝癌细胞侵袭能力及其对相关基因MMP-9表达的影响

目的探讨康莱特（Kanglaite,KLT）对肝癌细胞株BEL-7404侵袭能力的抑制作用及其对相关基因MMP-9mRNA和蛋白表达水平的影响。方法据前期MTT实验结果选用A组（含KLT80μL/mL）、B组（含DDP10 mg/L）和C组（DMEM空白对照）对BEL-7404细胞进行48小时处理,用细胞迁移实验及Transwell小室法检测细胞的侵袭能力的变化,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot法检测各组BEL-7404细胞中MMP-9mRNA及蛋白的表达水平。结果对BEL-7404细胞作用48小时后,A、B两组细胞的迁移速率及侵袭穿膜细胞数、MMP-9 mRNA及蛋白表达水平均较C组明显降低,差异均有统计学意义（P〈0.001）;而A、B两组之间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 KLT可通过下调MMP-9表达而抑制肝癌BEL-7404细胞株的侵袭能力;同时对BEL-7404细胞侵袭能力的抑制,80μL/mL KLT与10 mg/L DDP显示同样的抑制效果与机制。     

姜黄素抑制结肠癌SW480细胞的增殖及其机制

目的:研究姜黄素对人结肠癌SW480细胞增殖以及survivin、caspase-3和p-Akt表达的影响。方法:用不同浓度姜黄素(5～40μmol/L)作用SW480细胞24、48和72 h,MTT法检测姜黄素对SW480细胞生长的抑制作用,Western blotting法检测SW480细胞中survivin、caspase-3和p-Akt蛋白的表达。结果:姜黄素以剂量(5～40μmol/L)和时间(24～72 h)依赖的方式抑制SW480细胞的增殖(P<0.01),40μmol/L姜黄素作用72 h对SW480细胞生长的抑制率可达(75.86±3.93)%。姜黄素抑制SW480细胞中p-Akt、survivin蛋白的表达、促进caspase-3蛋白的表达,均呈时间和剂量依赖性;40μmol/L姜黄素作用SW480细胞48 h后p-Akt和survivin蛋白表达显著减少[(0.204±0.025)vs(0.367±0.035),P<0.01;(0.208±0.014)vs(0.385±0.034),P<0.01],caspase-3蛋白表达显著增加[(0.371±0.028)vs(0.127±0.023),P<0.01]。结论:姜黄素抑制SW480细胞增殖,其机制可能与抑制Akt磷酸化、下调survivin和上调caspase-3蛋白的表达有关。     

人参皂苷Rg3抑制肺癌NCI-H1650细胞增殖作用研究

[目的]研究人参皂苷Rg3对肺腺癌NCI-H 1650细胞增殖的抑制作用及对凋亡的影响.[方法]MTT法检测人参皂苷Rg3对NCI-H 1650细胞增殖的抑制作用,Annexin-V-FITC/PI法检测细胞凋亡.Western blot法检测caspase-3、Bcl-2、Bax、survivin蛋白表达的情况.[结果]不同浓度人参皂苷Rg3能有效抑制NCI-H1650细胞增殖,且呈时间剂量依赖性(P＜0.01).20μmol/L人参皂苷作用NCI-H1650细胞24、48h,细胞凋亡率明显增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).20μmol/L人参皂苷作用NCI-H1650细胞48h,Bcl-2、survivin蛋白表达降低、caspase-3、Bax蛋白表达增加,与对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.01).[结论]人参皂苷Rg3对肺腺癌NCI-H1650细胞增殖具有明显的抑制作用,呈时间剂量依赖关系,其机制可能与降低细胞Bcl-2、survivin蛋白表达,增加caspase-3、Bax蛋白表达,促进细胞凋亡有关.     

环氧合酶-2选择性抑制剂NS-398诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡及其机制探讨

目的:探讨环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)选择性抑制剂NS-398对人肝癌BEL-7402细胞凋亡及凋亡抑制蛋白survivin、XIAP和c-IAP1表达的调节作用.方法:用不同浓度的NS-398作用BEL-7402细胞后,MTT法测定细胞增殖抑制情况,FCM法和TUNEL法检测细胞凋亡情况,免疫细胞化学法检测COX-2、survivin、XIAP和c-IAP1蛋白的表达情况.结果:NS-398 可以显著抑制BEL-7402细胞的增殖,诱导其凋亡.免疫细胞化学法检测结果显示,与未处理组相比,NS-398作用可使BEL-7402细胞中COX-2、survivin、XIAP和c-IAP1蛋白的表达明显下调(P<0.01).结论:NS-398对人肝癌细胞株BEL-7402有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用,其机制可能与通过下调survivin、XIAP和c-IAP1的表达有关.     

二十二碳六烯酸联合顺铂对胃癌细胞MGC-803增殖及凋亡的影响

目的 研究二十二碳六烯酸（DHA）联合顺铂（DDP）对人胃癌MGC-803细胞增殖及凋亡的影响,并探讨机制。方法 MTT检测DHA联合DDP对MGC-803细胞增殖影响,计算IC50及Q值;DAPI染色观察细胞凋亡及形态;FCM检测细胞周期及凋亡率;细胞免疫组化法检测survivin、NF-κB蛋白的表达。结果 DHA对MGC-803细胞增殖呈时间剂量依赖性抑制作用,联合DDP后增殖抑制作用变强。Q>0.85,DHA协同增强DDP作用;DAPI染色后观察到细胞凋亡;DHA联合DDP较单药组凋亡率升高（P<0.05）;联合组G0/G1期细胞增多（P<0.01）,G2/M及S期细胞减少更明显（P=0.01）。联合组survivin、NF-κB蛋白表达水平低于单药组（P<0.05）。结论 DHA可协同抑制MGC803细胞体外增殖,可能与调控细胞周期及下调survivin、NF-κB蛋白的表达,诱导细胞凋亡、提高化疗敏感性有关。     

RNA干扰ATG16L1抑制人胃癌细胞BGC823自噬并促进顺铂诱导的细胞凋亡

摘 要：［目的］ 检测RNA干扰自噬相关基因16L1(autophagy-related gene 16L1,ATG16L1)表达后胃癌细胞的自噬活性,观察在ATG16L1敲减下顺铂（DDP）对胃癌细胞凋亡的影响。［方法］ 用ATG16L1 siRNA 技术构建ATG16L1 低表达的人胃癌BGC823 细胞株作为干扰组,转染阴性干扰的BGC823 细胞作为阴性转染组,未转染的BGC823 细胞作为对照组;Western blot 检测各组细胞中ATG16L1 的表达和自噬标志物微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3) 及死骨片蛋白1(sequestosome 1,P62)的表达;免疫荧光观察LC3II情况。CCK-8实验检测DDP处理后各组细胞增殖能力,计算IC50值。经DDP刺激后,流式细胞术检测细胞凋亡,再用Western blot 检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达。最后应用公共数据库Kaplan-Meier对多组胃癌患者mRNA 表达谱进行分析,预测ATG16L1 的表达水平对患者预后的影响。［结果］ ATG16L1 siRNA干扰组较对照组蛋白表达水平明显降低(P<0.001) ;LC3II水平下降(P<0.01),P62 水平上升(P<0.01),并且LC3荧光强度下降(P<0.05) 。经DDP诱导后,干扰组细胞增殖明显受抑（P<0.001）,细胞凋亡率明显增加(P<0.01) ;ATG16L1 干扰组中促凋亡分子cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达比对照组明显增加(P<0.001,P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 表达减少(P<0.001) 。公共数据库Kaplan-Meier表达谱芯片分析结果显示高表达ATG16L1组较低表达组预后差,差异有统计学意义 (P=0.001)。 ［结论］ RNA干扰ATG16L1抑制胃癌细胞自噬,并能够明显增强顺铂诱导人胃癌细胞的凋亡,提示靶向干扰ATG16L1抑制细胞自噬后可能通过调控细胞凋亡提高胃癌细胞对化疗药物的敏感性。     

顺铂对肝癌细胞BEL-7404、BEL-7404/ADM 中hTERT表达的研究

目的 观察不同浓度及作用时间顺铂对BEL-7404、BEL-7404/ADM肝癌细胞hTERT-mRNA表达及影响。方法 以不同浓度顺铂处理BEL-7404细胞24h、48h、72h后,RT-PCR检测hTERT-mRNA表达。结果 不同浓度DDP处理48h、72h后,BEL-7404细胞hTERT-mRNA表达明显受抑,与对照组比较有显著性差异,对比BEL-7404/ADM细胞,随着DDP剂量和作用时间的增加,hTERT活性也呈减弱趋势。结论 顺铂可降低BEL-7404、BEL-7404/ADM细胞hTERT-mRNA表达,表现为明显的时间及浓度的依赖性。     

几种化疗药物对肝癌耐药细胞BEL7404/ADM端粒酶活性的影响

目的:研究顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、多柔比星(ADM)和长春新碱(VCR)4种化疗药物对人肝癌细胞株BEL-7404、耐阿霉素肝癌细胞株BEL-7404/ADM的细胞毒作用及其对端粒酶活性影响的关系。方法:采用MTT法测定常用4种(DDP、MMC、ADM和VCR)化疗药物对人肝癌细胞株BEL-7404、BEL-7404/ADM的体外抑制作用;以TRAP-PCR-ELISA法检测化疗药物作用后两种细胞端粒酶的活性。结果:DDP、MMC、ADM、VCR对BEL-7404均敏感,各种化疗药物IC50大小比较,DDP和ADM比VCR和MMC均小;而对BEL-7404/ADM这几种化疗药物敏感性均不同程度下降,其中以ADM及VCR尤其明显,耐药倍数分别为100·0倍、60·14倍。未加药前,肝癌亲本细胞BEL-7404和耐药细胞BEL-7404/ADM端粒酶活性均表达,加入化疗药物后,亲本细胞端粒酶活性下降明显,并呈现时间-剂量关系,而对于耐药细胞,只有高浓度的化疗药物才能抑制其端粒酶活性。结论:端粒酶活性的抑制与耐药细胞对药物敏感性存在一定关系,端粒酶可作为化疗敏感的潜在标志。     

IWP-2对人肝癌Hep3B细胞增殖和凋亡的影响及其机制探讨

目的:研究Wnt/β-catenin抑制剂IWP-2对体外培养的人肝癌细胞Hep3B细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:用终浓度分别为0、20、40、80、160、320μmol/L的IWP-2作用于人肝癌Hep3B细胞,采用CCK-8法检测细胞的增殖抑制率,FCM法检测细胞周期分布与细胞凋亡率,Western blot法检测细胞凋亡蛋白的表达,Western blot法检测细胞中Cyclin D1和survivin蛋白表达的变化,实时定量RT-PCR法检测Cyclin D1和survivin mRNA表达的变化。结果:20~320μmol/L的IWP-2对细胞的增殖均有抑制作用,其抑制作用随IWP-2浓度的升高和作用时间的增长而增强,各组与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。FCM检测结果显示,IWP-2(20~320μmol/L)能够导致G0/G1期细胞比例上升,S期细胞比例下降;同时诱导细胞凋亡,凋亡率随IWP-2浓度的升高而上升,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。IWP-2可引起caspase-3和caspase-7蛋白表达水平的升高,并且可下调肝癌细胞中Cyclin D1和survivin基因和蛋白的表达水平,呈明显的剂量依赖性。结论:IWP-2可抑制Hep3B细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制可能与抑制Cyclin D1和survivin的表达有关。     

PPARgamma activator rosiglitazone inhibits cell migration via upregulation of PTEN in human hepatocarcinoma cell line BEL-7404

PPARgamma agonists were reported to be implicated in many biological functions in certain kinds of cells, however, little is known about the effects of PPARgamma on hepatocarcinoma cell. We explored the effects of rosiglitazone, a PPARgamma activator, on human hepatocarcinoma cell line BEL-7404 and its mechanism. After BEL-7404 was exposed to rosiglitazone, its migration was significantly inhibited, which associated with downregulation of the phosphorylation of Akt and FAK, while no significant change was detected in the phosphorylation of ERK after rosiglitazone treatment. It is now known that phosphorylated FAK is a substrate of PTEN and Akt phosphorylation can be regulated by PTEN via the PIP(3) level. We found rosiglitazone upregulated PTEN expression in a dose- and time-dependent manner, which was mediated by PPARgamma. Furthermore, PTEN overexpression resulted in inhibition of cell migration and PTEN knock-down blocked the effect of rosiglitazone on cell migration. It suggested that PTEN was required for rosiglitazone-induced inhibition of BEL-7404 cells migration. In conclusion, our results demonstrated that PTEN played a critical role in rosiglitazone inhibiting cell migration in BEL-7404.     

鲜壁虎活性组分对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨鲜壁虎活性组分对人肝癌BEL．7404细胞增殖及凋亡的影响。方法将鲜壁虎活性组分冻干粉配制为不同浓度的溶液,并作用于肝癌BEL-7400细胞。以MTT法检测不同浓度的鲜壁虎活性组分对肝癌BEL-7400细胞增殖的抑制作用,流式细胞术分析各组细胞的凋亡情况。结果不同浓度的鲜壁虎活性组分均对肝癌BEL-7404细胞的增殖有抑制作用,且呈剂量．时间依赖效应,实验组的抑制率均较对照组显著提高（P〈0．05）。不同浓度的鲜壁虎活性组分均能诱导肝癌BEL-7404细胞凋亡,高浓度组（2560p,g／m1）的作用更为明显（P〈O．05）。结论鲜壁虎活性组分可显著抑制BEL-7404细胞的增殖,并诱导其凋亡。     

两种儿茶素成分体外逆转人肝癌细胞 BEL-7404/ADR多药耐药性

背景与目的:儿茶素具有多种抗肿瘤的活性,目前,国内外尚未见儿茶素用于肝癌多药耐药性的研究.本研究拟探讨两种儿茶素成分表儿茶素没食子酸酯 (epicatechin gallate,ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯 (epigallocatechin gallate,EGCG)体外逆转人肝癌细胞多药耐药性的作用及可能的机制.方法: MTT法检测 ECG、 EGCG的细胞毒作用;荧光分光光度法检测细胞内化疗药物的含量; RT-PCR法检测 mdr1基因的表达.结果: ECG和 EGCG在 100 mg/L以下剂量时对耐药肝癌细胞株 BEL-7404/ADR的抑制率均小于 10%, 60 mg/L的 ECG和 14 mg/L的 EGCG分别与 0.8 mg/L的阿霉素 (adriamycin,ADM)合用能使 ADM对 BEL-7404/ADR的 IC50由 36 mg/L分别下降至 2.3 mg/L和 1.9 mg/L,增敏倍数分别为 15.8倍和 19.2倍,联合用药可使细胞内 ADM的浓度由 (0.76± 0.02)μ g/108cells～ (2.55± 0.17)μ g/108cells提高到 (2.04± 0.07)μ g/108cells～ (9.28± 0.59)μ g/108cells(P< 0.01),并使 mdr1表达与对照组相比分别下降了 27.6%及 41.3%,逆转肿瘤 MDR作用以 EGCG为强.结论: EGCG和 ECG具有体外逆转人肝癌细胞多 药耐药性的作用,可能与下调 mdr1表达、增加细胞内化疗药物的积累有关.     

肝癌耐药细胞株的建立及癌干细胞的特性

目的建立肝癌耐药细胞株,并观察耐药细胞株癌干细胞的相关生物学特性。方法采用阿霉素（ADM）浓度梯度递增法诱导建立耐药BEL-7404人肝癌细胞株,并对亲代与耐药肝癌细胞株进行癌细胞基本特性、癌于细胞相关细胞学特性进行检测,用计数法检测癌细胞生长曲线、倍增时间与MTT法测耐药倍数;单个细胞成株培养、平板克隆形成实验、“球囊”细胞培养实验。结果耐药BEL-7404人肝癌细胞与亲本细胞相似,呈上皮样生长方式,但其中梭状细胞略多,耐药倍数为292倍;生长曲线表明其增殖速度明显低于亲本BEL-7404人肝癌细胞,且倍增时间增加;耐药BEL-7404肝癌细胞克隆形成率、“球囊”细胞形成率均明显低于其亲本BEL-7404人肝癌细胞。结论低浓度阿霉素持续增量法可诱导形成耐药肝癌细胞株,但耐药肝癌细胞株的癌干细胞特征并不明显。     

黄芪多糖协同顺铂对BEL-7404人肝癌细胞的杀伤作用

目的探讨黄芪多糖对人肝癌细胞BEL-7404细胞株细胞周期的影响及与顺铂联合使用，对BEL-7404肝癌细胞的杀伤作用。方法通过四氮甲唑蓝(MTT)实验检测细胞的增殖抑制率，以观察黄芪多糖对肝癌细胞的增殖抑制作用；应用流式细胞仪检测细胞周期的改变及凋亡率。结果黄芪多糖可抑制肝癌BEL-7404细胞的生长、增殖；与顺铂联合应用对BEL-7404肝癌细胞杀伤作用强于2种药物单独使用。黄芪多糖处理后的BEL-7404细胞出现低于G1期DNA含量的亚二倍体凋亡峰，将细胞周期阻滞于G1期。结论黄芪多糖对肝癌BEL-7404细胞有杀伤作用；黄芪多糖与顺铂联合使用具有协同抗肿瘤作用。     

Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes.

Human liver carcinoma cells (BEL-7404) and human KB adenocarcinoma cells were selected by stepwise increases in cisplatin. Drug sensitivity assays indicated that the IC50 value for 7404-CP7.5 cells was 49 micrograms ml-1 cisplatin, 111-fold higher than for the parental hepatoma cells. The IC50 value for KB-CP10 cells was 38 micrograms ml-1 cisplatin, which is 1152-fold higher than for the parental KB cells. The 7404-CP7.5 cells were cross-resistant to methotrexate (39 x), 5-fluorouracil (23 x) and 6-mercaptopurine (13 x), but were sensitive to drugs which are known substrates for the multidrug transporter (P-glycoprotein), including colchicine, vinblastine and actinomycin D. Similar cross-resistance patterns were observed for KB-CP10 cells. No evidence of DNA amplification or expression of the MDR1 gene was found. One-dimensional sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis showed increases in 52 kDa protein(s) in both the soluble cytosolic and crude membrane fractions in 7404-CP(r) cells and in KB-CP(r) cells. The amount of 52 kDa protein was proportional to the degree of resistance of the 7404-CP(r) cells to cisplatin. Two-dimensional gel analysis demonstrated that two polypeptides of molecular mass 52 and 50 kDa were overexpressed in the membrane fractions in both 7404-CP20 and KB-CP20 cells. Using amino acid microsequencing and Western blotting, major 52 kDa protein was identified as the mitochondrial heat shock protein hsp60. Two-dimensional gels of [35S]methionine-labelled polypeptides showed many other changes, including reduction in soluble proteins of approximately 57 kDa molecular weight in KB-CP20 cells, and of 35 kDa in both 7404-CP20 and KB-CP20 cells. These results suggest that alterations of certain proteins occur commonly in cisplatin-resistant cells, particularly proteins of molecular weight 52 and 50 kDa.     

熊果酸联合顺铂抑制卵巢癌生长的实验研究

目的：探讨熊果酸（UA）对卵巢癌细胞株SKOV3及卵巢癌皮下移植瘤生长的抑制作用并探讨其机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法,检测UA对SKOV3细胞的增殖抑制效应;建立卵巢癌皮下移植瘤模型,观察UA对移植瘤的生长抑制作用;用免疫组化检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果：UA对体外培养的SKOV3细胞生长具有抑制作用,与DDP联合应用使SKOV3细胞生长进一步受到抑制。体内实验表明：各治疗组肿瘤的生长明显受到抑制,而联合治疗组抗瘤作用进一步增强。UA能下调肿瘤细胞中Bcl-2蛋白的表达,同时明显提高肿瘤细胞中Bax蛋白的表达。结论：UA可明显抑制卵巢癌细胞生长,并诱导细胞凋亡,其主要机制与调节Bcl-2和Bax的蛋白表达有关。