幽门螺杆菌标准株NCTC11639 CagA基因的克隆表达及其抗原性的鉴定

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是慢性消化道疾病的主要致病菌。本研究利用基因工程技术构建CagA基因并进行了表达，为CagA疫苗和诊断抗原的研究奠定基础。 一、材料和方法 1．菌株来源和质粒：Hp标准株NCTC11639由本校微生物教研室保存；E．coli DH5α和TOP10及表达载体pGEX-4T-1由本室保存。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位基因的克隆表达及免疫原性

幽门螺杆菌 (Ｈｐ)与胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃淋巴瘤等关系密切。Ｈｐ在我国普遍人群的感染率约 5 0 %～ 80 % ,可经口传播。如何预防和根除Ｈｐ感染是目前临床治疗的重点。免疫疗法有望成为预防和治疗该类感染性疾病的最有效方法之一[1] 。在Ｈｐ的免疫防治研究方面 ,应用细菌的超声粉碎抗原、纯化尿素酶 (Ｕｒｅ)、细胞空泡毒素和热休克蛋白 (Ｈｓｐ)等作为抗原免疫动物均取得了较好的免疫预防和治疗效果[2 4 ] 。但由于Ｈｐ属微需氧菌 ,培养条件要求高 ,难以获得大量天然来源的Ｕｒｅ及Ｈｓｐ等亚单位成分 ,我们对Ｈｐ重要的保护性抗…     

幽门螺杆菌virD4基因的克隆表达及其功能初探

目的研究幽门螺杆菌SBK临床分离株virD4的功能。方法通过T-A克隆获得virD4基因片段;构建pET-28a(+)-virD4原核表达载体,转化入Rosetta工程菌,IPTG诱导表达;KCl染色切胶纯化法获得重组蛋白质,SDS-PAGE法分析鉴定重组蛋白质;纯化的重组蛋白质免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA法检测效价,western blot法分析抗原反应特异性;重组蛋白质与GES-1细胞共培养,检测其对细胞炎症因子的表达及细胞增殖的影响。结果 virD4基因全长为1 728 bp,序列与Shi470菌株的virD4基因同源性较高;成功构建原核表达载体,经诱导及纯化获得相对分子质量为63 000的重组蛋白质;成功免疫小鼠制备多克隆抗体,效价为512 000,抗原抗体反应具有特异性;virD4能诱导GES-1细胞分泌炎症因子和增殖。结论成功克隆并表达virD4基因,制备多克隆抗体,其重组蛋白质能诱导细胞因子分泌及细胞增殖。     

幽门螺杆菌感染慢性胃炎患者血清抗幽门螺杆菌热休克蛋白60抗体表达的意义

目的 探讨幽门螺杆菌(Hp)感染患者血清抗幽门螺杆菌热休克蛋白60(Hsp60)抗体与慢性胃炎的关系.方法 选择慢性浅表性胃炎及慢性萎缩性胃炎患者作为研究对象,采用14C尿素呼气试验(14C-UBT)及活检组织病理染色检测Hp感染,采用间接固相免疫分析技术测定血清抗幽门螺杆菌Hsp60抗体表达情况,并对胃镜活检标本行病理检查了解胃黏膜炎症情况.结果 ①慢性浅表性胃炎患者血清抗幽门螺杆菌Hsp60抗体阳性表达阳性率为27.2%,慢性萎缩性胃炎为59.2%.Hp感染慢性萎缩性胃炎患者血清抗幽门螺杆菌Hsp60抗体阳性率明显高于慢性浅表性胃炎患者(P《0.01).②血清抗幽门螺杆菌Hsp60抗体阳性的慢性胃炎患者胃黏膜Hp密度及14C-UBT测定尿素酶活性均明显高于Hsp60抗体阴性者.③血清抗幽门螺杆菌Hsp60抗体阳性的慢性胃炎患者胃黏膜慢性炎症严重程度和活动性均明显高于Hsp60抗体阴性者.结论 血清抗幽门螺杆菌Hsp60抗体可能在幽门螺杆菌感染慢性胃炎的发生、发展中起重要作用.     

幽门螺杆菌尿素酶基因的克隆及表达

目的构建幽门螺杆菌尿素酶基因B亚单位（ureB）的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法以幽门螺杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增尿素酶基因B亚单位,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接克隆载体并测序,构建重组原核表达载体。结果成功扩增出1710bp的目的基因,测序结果证实与预期一致,该基因在大肠杆菌表达系统中得到表达。结论在大肠杆菌中成功表达幽门螺杆菌尿素酶基因B亚单位蛋白,为幽门螺杆菌疫苗的研发奠定了基础。     

幽门螺杆菌热休克蛋白的研究进展

目前幽门螺杆菌（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ）作为慢性胃炎和消化性溃疡的最主要病因已经得到了国际医学界的首肯。近来的研究还证实幽门螺杆菌感染与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生密切相关〔１〕。１９９４年世界卫生组织已将其列为第一类生物致癌因子。Ｈｐ可能是最常见的人类慢性细菌性感染的病原菌,它的感染十分普遍,并且感染率随年龄增加〔２〕。在发达国家,人群的Ｈｐ感染率为２５～５０％,多数人在青年期感染。而在发展中国家,７０～９０％的人口为Ｈｐ感染者,而且几乎全部于１０岁前已感染。〔３〕。由于Ｈｐ在胃…     

幽门螺杆菌NCTC11637株Hp1501基因序列的测定与生物信息学分析

目的幽门螺杆菌NCTC11637菌株Hp1501基因进行序列测定,并运用生物信息学软件对其进行分析。方法用聚合酶链反应方法从幽门螺杆菌NCTC11637菌株基因组DNA扩增Hp1501基因,T-A克隆,鉴定后测序,将基因序列向GeneBank提交并申请登录号,用生物信息学软件分析其生物学特性。结果成功获取幽门螺杆菌NCTC11637株Hp1501基因序列,获得GeneBank登录号JF820815。软件分析表明,序列全长为1 164 bp,与幽门螺杆菌国际标准株26695和J99的基因序列一致性为96%～97%,氨基酸序列一致性为97%～98%;软件预测其编码的前59个氨基酸为信号肽,其编码的核心肽为幽门螺杆菌外膜蛋白。结论成功测定幽门螺杆菌NCTC11637菌株Hp1501基因序列并预测出其生物学特性,为进一步研究其功能,阐明其致病机制奠定了基础。     

骨肉瘤细胞热休克蛋白70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的从人的骨肉瘤细胞中钓取热休克蛋白70(HSP70)基因并在大肠杆菌中表达出热休克蛋白,为进行热休克蛋白的功能试验提供抗原。方法热休克人骨肉瘤细胞后,采用One-Step,RT-PCR方法从人骨肉瘤细胞中钓取HSP70基因,DNA测序正确的HSP70基因和表达载体pET28a连接后,构建成功了重组表达质粒pET28a-HSP70,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导蛋白表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果人骨肉瘤细胞HSP70基因的PCR产物约为1.9 kb,DNA序列测定结果证实,所获目的序列与文献报道的基本一致,仅有两个碱基的差异。构建的重组表达质粒pET28a-HSP70,能够在大肠杆菌中表达。结论从人骨肉瘤细胞中成功地钓取了HSP70基因并在大肠杆菌中表达出HSP70蛋白,为研究人骨肉瘤细胞HSP70的结构、功能与临床应用奠定了基础。     

幽门螺杆菌蛋白芯片检测的对比分析

目的:评估蛋白芯片检测幽门螺杆菌(HP)感染的可靠性。方法:对86例胃、十二指肠疾病患者,采取胃黏膜组织学、涂片革兰氏染色、快速尿素酶试验,以决定是否感染HP,并做蛋白芯片检测。结果:蛋白芯片检测的敏感性为94.2%,特异性为94.1%。86例患者中有3例假阴性,有2例假阳性。结论:蛋白芯片检测有高度敏感性和特异性。     

幽门螺杆菌临床分离株尿素酶基因B的原核表达、纯化及免疫活性

目的:在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌临床分离株尿素酶B(UreB),纯化重组蛋白并分析其免疫活性.方法:将pGEX-4T-1-UreB重组菌BL21复舒,挑单菌落接种于含氨苄的LB培养基中.0.5 mmoL异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,使用纯化的重组蛋白免疫小鼠.ELISA检测血清抗体效价,并使用感染患者血清进行Western-blotting鉴定重组蛋白反应原性.结果:SDS-PAGE示在约87 kD相应分子量可见融合蛋白表达,产物主要在表达上清以可溶形式存在,纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性IgG效价为1:51 200.Western blotting示重组蛋白能被幽门螺杆菌感染患者血清识别.结论:UreB在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有较好的免疫原性及反应原性.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因克隆表达及临床应用

目的 获得重组表达的人幽门螺杆菌（Hp)尿素酶B亚单位蛋白（UreB),并将其运用于Hp感染的临床检测。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术从临床分离的Hp菌株基因组中扩增出编码UreB的基因（ureB),将其克隆于质粒PinPoint^TMXa-Ⅲ上进行序列分析和蛋白表达,通过亲和层析得到纯化的重组UreB蛋白并用于113例消化性溃疡患者Hp感染的酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测。结果 克隆的ureB基因核苷酸序列与GenBank公布的序列相比较,同源性为96.44%,推定氨基酸序列同源性为99.65%。纯化的重组UreB蛋白相对分子量约为66000,纯度为90%以上,并保持较好的免疫原性。应用纯化的重组UreB蛋白联合ELISA法检测113例消化性溃疡患者Hp感染的灵敏度和特异性分别为92.0%、98.5%。结论 重组UreB蛋白作为抗原用于ELISA法检测Hp感染,保持了较高的灵敏度和特异性,可用于Hp感染的临床检测与诊断、疗效判定及流行病学研究。     

结核分枝杆菌Rv3872基因的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌Rv3872蛋白。方法聚合酶链反应（PCR）技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv全基因组中扩增出的表达Rv3872基因序列，将其克隆到pMD18-T载体后，测序分析。亚克隆该目的基因到pET28a表达载体，最终转化至大肠杆菌BL21（DE3），获得正确的阳性克隆子后大量表达重组Rv3872蛋白，再经纯化、定量后，通过Western blot分析其抗原性。结果扩增Rv3872基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致，表达蛋白经SDS-PAGE分析，在约15000kD处有表达条带，纯化后的重组蛋白占总蛋白的90％以上。免疫印迹分析显示重组的Rv3872蛋白具有抗原性。结论成功表达结核分枝杆菌的Rv3872蛋白，为结核病血清学诊断候选抗原筛选和开发应用打下基础。     

pcDNA3.1-bFGF真核表达载体的构建及其在犬骨髓基质干细胞中的表达

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs)后的表达情况,并进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法:提取国人脑胶质瘤细胞BT325总RNA,RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段,构建重组载体pcDNA3.1-bFGF,重组载体经脂质体介导转染犬BMSCs,半定量RT-PCR及Western blot检测表达。结果:重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。bFGF在犬BMSCs中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-bFGF,此重组载体在犬BMSCs中能够表达。     

聚合酶链反应(PCR)检测幽门螺杆菌cag A基因

目的　探讨应用PCR直接测定胃粘膜标本中幽门螺杆菌cagA基因。方法　不需细菌培养 ,直接从胃粘膜标本中提取幽门螺杆菌DNA ,选择合适的引物及条件进行PCR ,通过琼脂糖电泳来确定标本中的cagA基因。结果　每例cagA阳性的标本在 191bp的位置有一条清晰的电泳带。 19例胃溃疡患者中cagA阳性 16例 ,阴性 3例。 15例健康人血清对照 ,cagA阳性 3例 ,阴性 12例。该法敏感性 84 .2 % ,特异性 80 %。同时进行快速尿素酶实验 ,发现 17例阳性标本中PCR方法 16例阳性 (94 .1% ) ,2例快速尿素酶实验阴性标本PCR阴性。二者没有显著差异 (χ2 =0 ,P >0 .0 5 )。结论　应用PCR直接测定胃粘膜标本中幽门螺杆菌cagA基因方法简单 ,快速 ,灵敏度和特异性较高。     

单纯疱疹病毒2型全长糖蛋白D抗原的原核表达及抗原性分析

目的:构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)全长糖蛋白D(gD)基因原核表达质粒,研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达,并鉴定重组蛋白的gD抗原性。方法:提取病毒DNA,PCR扩增出gD基因,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,并转化大肠杆菌BL21。PCR、双酶切及测序证实插入的gD基因序列正确后,IPTG诱导表达融合蛋白GST-gD,并进行免疫学鉴定。结果:获得了gDDNA。测序鉴定表明,该序列与Gen Bank中的序列一致,gD基因已正确插入到pGEX-4T-1中。重组融合蛋白表达载体pGEX-4T-gD经IPTG诱导后能在大肠杆菌中高效表达,Western Blotting证实,该蛋白具有天然gD抗原性。结论:成功构建了融合蛋白表达载体pGEX-4T-gD,在大肠杆菌中获得了有效表达,并证实融合蛋白具有gD免疫原性。为进一步研究gD蛋白的免疫学特性,制备gD亚单位疫苗和单克隆抗体奠定了基础。     

纳米金辅助不对称PCR扩增幽门螺杆菌23S rRNA基因的优化和建立

目的:建立纳米金辅助不对称PCR方法扩增幽门螺杆菌23S rRNA基因,为建立基因芯片法检测幽门螺杆菌耐药基因提供试验平台.方法:将幽门螺杆菌23S rRNA基因转化至感受态大肠杆菌JM109,小量抽提阳性构建质粒DNA,以质粒DNA为模板,设计引物对23S rRNA基因进行不对称PCR扩增.对PCR条件中引物浓度及浓度比例、纳米金浓度等进行优化.结果:限制性引物与非限制性引物浓度比例为1 ∶ 60,限制性引物与非限制性引物浓度分别为0.04 pmol/L、2.4 pmol/L时可获得理想的单链和双链DNA,纳米金浓度为0.8 nmol/L时非特异性产物最少,PCR的扩增效率最高.结论:通过对PCR扩增条件的优化,确立了扩增幽门螺杆菌23S rRNA基因纳米金辅助不对称PCR方法的最佳条件,为建立基因芯片法检测幽门螺杆菌耐药基因奠定基础.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a 382～443片段的原核表达及鉴定

目的对编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及青霉素结合蛋白2a(PBP2a)382~443位氨基酸的mecA基因片段进行克隆、表达及鉴定。方法根据基因文库登录的mecA基因的编码序列,针对编码PBP2a382~443位氨基酸的mecA基因片段,设计合成4条寡核苷酸片段,再将4条片段人工拼接成目的基因片段,然后克隆至PET-His载体,经酶切鉴定、测序正确后,转化E.coliBL21(DE3)plysS,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白以MRSA胶乳凝集试剂盒进行鉴定。结果构建了相应的PET-His克隆,经诱导表达和鉴定,证实成功表达出目的蛋白。结论成功表达出PBP2a382~443片段,为其进一步的纯化和应用奠定了基础。     

幽门螺杆菌动力在胃黏膜定植中的机制研究

幽门螺杆菌能在人类的胃定植并且在胃内存活数十年甚至一生,幽门螺杆菌有很多潜在的致病因子使其定植在胃的特殊环境中.动力是必须的定植因子,依据于幽门螺杆菌无动力突变株不能感染无菌乳猪,动力不能作为定植因子是因为在活体胃腔内幽门螺杆菌的动力很快失去,幽门螺杆菌动力的作用尚未清楚.本文的目的 是探讨对定植与幽门螺杆菌动力之间的关系.     

血小板生成素基因的克隆及其在真核细胞中的稳定表达

目的：为了得到重组人血小板生成素（ｒｈＴｐｏ），以治疗骨髓组织损伤造成的血小板减少与缺乏。方法：从人胚胎肝脏中分离ｍＲＮＡ，经逆转录、多聚酶链反应（ＰＣＲ）等步骤克隆出了Ｔｐｏ全基因。将Ｔｐｏ基因亚克隆至真核细胞稳定表达载体ＲＣ／ＣＭＶ中，构建成ＲＣ／ＣＭＶ／Ｔｐｏ重组质粒。结果：经转染中国仓鼠卵细胞（ＣＨＯ），得到了ｒｈＴｐｏ在真核细胞中的稳定表达。结论：实验得到的真核细胞稳定表达的ｒｈＴｐｏ可以增加体外小鼠巨核细胞克隆的形成。