胃癌及其癌前病变相关新基因GP1的克隆

目的 比较胃癌、癌前病变和正常胃黏膜之间基因表达的差异,寻找与胃癌发生、发展相关的基因。方法 用荧光mRNA差异显示技术（FDD）分离差异表达的基因片段,进行PCR再扩增。将扩增的cDNA片段克隆后进行测序,测序结果提交GenBank,经BLAST软件检索进行同源性分析。差异条带经Northern杂交验证。应用SMART RACE（Rapid Amplication of cDNA Ends）技术扩增GP1的全长cDNA,并应用生物信息学技术预测该基因的生物学功能。结果 发现1个在胃癌及癌前病变组织中低表达的而且在GenBank数据库中未找到同源序列的cDNA片段,为新的基因片段,并获得GenBank登陆号CD454989。GP1的全长cDNA序列为1362bp,编码生物学功能未明的具有267氨基酸的蛋白质BAA91562.1。结论 发现了一个在胃癌、癌前病变及正常胃黏膜组织中差异表达的新基因,它可能参与了胃癌的发生、发展过程。     

肝癌组织差异表达基因cDNA序列的筛选与鉴定

目的：筛选并鉴定肝癌组织特异表达基因。方法：通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库，用PCR方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆，将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析，用Northern印迹方法对新的cDNA序列进行初步鉴定。结果：从消减文库中随机挑取的100个白色克隆中筛选出13个阳性克隆，DNA测序获得11个不同的cDNA序列；同源性比较分析表明，6个cDNA片段与在基因高度同源，5个cDNA片段为新的序列。其长度大于300bp的3个新序列，Norther印迹证实它都来源于肝癌组织。结论：用抑制消减杂交方法构建的肝癌差异表达基因消减cDNA文库富含肝癌特异表达基因，经验证的3个新的cDNA序列可能为肝癌特异的基因序列。     

肺腺癌同源正常组织中差异表达基因的克隆

目的 从与肺腺癌同源的正常组织中筛选差异表达基因，以期从分子水平阐明机体抑制肿瘤发生的机制。方法 利用抑制性消减杂交分别肺癌组织及肺腺癌同源正常组织cDNA片段，并建立相应的cDNA文库。用肺腺癌组织及与其同源的正常组织cDNA片段作为探针，分别进行逆向和正向斑点杂交，筛选与同源正常组织探针杂交而不与肺腺癌组织探针杂交的阳性克隆并测序，测序结果与GenBank中的序列进行同源性分析。结果 在肺腺癌同源正常组织中，获得12个差异表达基因片段，其中4个与细胞凋亡相关基因有较高的同源性；8个与人类不同染色体的不同区域有较高的同源性，功能不详。结论 推测肺腺癌同源正常组织中存在凋亡相关基因等，它们可能通过多种途径促进细胞凋亡而抑制细胞异常增殖，从而达到抑制肿瘤发生的目的。     

人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3的克隆

目的：克隆人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3。方法：从已获得的小鼠稳睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的表达序列标签片段（BE644537）入手，构建人同源表达序列标签重叠群，应用基因特异性引物和载体特异性引物，在睾丸cDNA文库的DN或进行巢式PCR扩增、测序，对测序结果进行生物信息学分析。结果：从睾丸cDNA文库中分离出人类睾丸凋亡相关基因的5’末端而获得全长cDNA,命名为TSARG3，GenBank登录号为AF419291（保密期为1年），同时应用相同方法克隆了该基因在小鼠中的同源基因，GenBank登录号为AF419292。结论：获得人类睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG3，该基因可能与人类睾丸生精细胞凋亡有关。     

一个新的小鼠腭裂候选基因cDNA序列的克隆

目的 克隆并筛选与小鼠腭裂发生相关候选新基因。方法 利用聚合酶链反应改良扣除杂交技术，克隆正常组与腭裂组小鼠腭突组织中差异表达的基因，经反向点杂交鉴定后挑选阳性克隆并测序及同源性分析，Northern印迹杂交检测所获的新基因mRNA的全长。结果 经大规模测序后得4个新的表达序列标签，其中1个片段全长为809bp，Northern印迹杂交结果显示为该基因的eDNA全长。结论 获得一个新的与小鼠腭裂发生相关的候选基因的cDNA全长。     

限制性酶切片段差异显示技术搜寻和克隆肝癌相关基因

目的:筛选新的肝癌相关基因并对其作用进行研究，探讨肝癌的发生机制，从而对肝癌的早期诊断和治疗提供新的思路。 方法:应用限制性酶切片段差异显示技术对比研究手术切除的新鲜的原发性肝细胞癌组织及其周围相对正常的肝组织，通过放射自显影显示结果并筛选差异条带。对差异表达基因序列进行克隆、测序和GenBank同源性比对，进一步分析差异表达的基因片段。 结果:筛选出18条表达有差异的条带，其中肝癌组织表达上调的基因有16条，肝癌组织低表达或缺失，正常组织高表达的基因有2条。二次PCR扩增出3条差异条带，进行克隆、鉴定和测序，并进行同源性比较。其中1条基因与已知基因无明显同源性，可能为新的基因；1条基因序列与编码人类核糖体蛋白基因的cDNA同源性较高（86%）；另有1条基因序列与编码P选择蛋白的基因高度同源（98%）。 结论:共克隆鉴定了3条肝癌相关基因，并初步探讨其功能，为进一步探讨肝癌的发生机理提供了理论依据。     

人CD81分子的肝组织特异性稳定表达

目的：用肝组织特异性启动子，实现人CD81分子在小鼠肝癌细胞Hepa 1—6中的稳定表达。方法：从能感染丙型肝炎病毒(HCV)的人肝癌细胞系HepG2中提取RNA，用随机引物合成cDNA的第1条链，然后用人CD81基因的特异性引物进行PCR扩增，克隆PCR扩增片段。将经测序证明为人CD81基因的正确序列，连接到肝特异性启动子的下游，使CD81基因的3′端与SV40polyA加尾序列融合，得到肝组织特异性表达的人CD81融合基因片段。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3中，转染小鼠肝癌细胞系Hepa 1—6。经G418加压筛选后，分别用RT—PCR检测人CD81 mRNA的转录，用FACS检测人CD81蛋白的表达。结果：克隆序列的测序结果与GenBank中登录的序列进行对比表明，得到了人CD81 cDNA的正确序列。构建的人CD81肝特异性融合基因片段可稳定转染Hepa 1-6细胞，并可检测到人CD81在mRNA水平上的转录和在蛋白质水平上的稳定表达。结论：由于CD81是HCV的感染受体，稳定表达HCV感染受体-人CD81分子的小鼠肝癌细胞克隆的获得，为今后研究HCV包膜蛋白与CD81的相互作用、筛选感染阻断药物，以及发展HCV感染的小鼠动物模型奠定了基础。     

肌色素上皮源性因子基因与黑色素瘤的发生相关

目的：寻找与B16黑色素瘤发生相关的DNA序列或片段。方法：用105条引物对B16黑色素瘤及其来源小鼠C57BL／6J基因组DNA进行随机扩增多态DNA分析,比较肿瘤组织及其相应正常组织的DNA指纹,对差异很明显的片段收、克隆和测序,序列与GenBank数据库进行同源性分析。结果：105条引物中有24条引物扩增出的条带在肿瘤组织与其相应正常组织间存在差异。在6个差异很明显的回收DNA片段中引物AB8－5扩增后所得差异片段B8－5,肿瘤组织中此片段缺失,该片段序列长610bp,与GenBank序列数据库中鼠肌色素上皮源性因子基因具有99％（419／421）的同源性,与鼠肌色素上皮源性因子（PEDF）mRNA的同源性为100％（213／213）。可以认为该序列即为此基因,结论：黑色素瘤中存在PEDF基因缺失,提示PEDF基因与黑色素瘤发生相关。     

MRP-1/CD9基因在胃癌及其癌前病变中的差异表达

目的　筛选和鉴定与胃癌发生、发展相关的基因片段 ,探讨胃癌的癌变分子机理。方法　应用荧光 m RNA差异显示技术对胃正常黏膜、癌前病变及癌组织的基因差异表达情况进行了分析。对其中的运动相关蛋白 (motility- related protein- 1,MRP- 1/CD9)基因 ,用 Northern印迹及逆转录 -聚合酶链反应技术分析在正常及不同病理状态下该基因表达的情况。结果　Northern印迹结果与 m RNA差异显示的结果相符合 ,逆转录 -聚合酶链反应显示 MRP- 1/CD9在胃癌组织中的表达 (0 .31± 0 .18)低于相应的正常胃黏膜 (0 .4 9± 0 .2 4 )及癌前病变组织 (0 .4 7± 0 .18) ,差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ;在胃癌中 ,MRP- 1/CD9在弥漫型胃癌中的表达 (0 .2 2± 0 .17)明显低于肠型胃癌 (0 .38± 0 .16 ) (P<0 .0 5 )。结论　与正常胃黏膜及癌前病变组织相比 ,MRP- 1/CD9基因在胃癌组织中表达明显降低 ,提示 MRP- 1/CD9基因的表达情况可能与胃癌的发病及其组织学分型有关。     

从EST克隆中筛选肝癌内高表达的基因片段

应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术，从表达序列标记（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）克隆中筛选出一个在肝癌组织内高表达，而在相应癌旁肝及正常肝组织内低表达或不表达的基因片段。ＤＮＡ序列测定表明，该基因片段为一未知新基因的部分序列。此基因片段可作为探针，进一步筛选ｃＤＮＡ文库，以得到新的癌基因的候选基因。     

应用银染mRNA差异显示法寻找高温致神经管畸形差异表达基因

目的 :寻找高温致神经管畸形的差异表达基因。方法 :在高温致神经管畸形的动物模型上 ,分别于高温处理后 2 4、48和 72小时 ,提取鼠胚神经管组织总RNA和正常对照组鼠胚相应时间的神经管组织总RNA ,反转录合成cDNA第一链后进行差异显示PCR扩增 ,采用PAGE和银染技术显示差异条带 ,回收差异条带并经PCR二次扩增后 ,用点杂交方法筛除假阳性条带 ,再用Northern印迹杂交进一步鉴定。结果 :在高温致畸的鼠胚神经管组织中筛选到一个特别明显的差示cDNA片段N3 2 ,该片段所在基因在高温致畸的胚胎神经管组织中的表达远低于正常同龄胚的神经管组织。结论 :N3 2片段所在基因的低表达与高温致神经管畸形相关。     

一株与大鼠肝细胞再生相关的新cDNA克隆

目的:用表达性差异显示分析(RDA)技术发现的一株新基因为目的基因。研究该基因与肝细胞再生的可能关系及在组织中的分布等初步的生物学功能。方法:用狭线杂交、Northern杂交、RT-PCR、cDNA文库筛选及序列分析法研究新基因cDNA序列、组织分布及初步功能。 结果:从大鼠胎肝cDNA文库中筛选出该基因的克隆;杂交等证实其在肝大部切除后表达迅速上调,在EGF诱导的肝细胞及肿瘤组织中呈高丰度表达;对该基因进行序列测定并获得全长核苷酸序列;分析表明该核苷酸序列仅编码70余个氨基酸。 结论:该基因与肝细胞再生相关;可能仅编码小分子多肽或其N-端具有更长的序列。     

食管癌低表达cDNA片段C6-2A的克隆及表达分析

目的　克隆人食管癌发生相关的基因。方法　用ｍ Ｒ Ｎ Ａ 差异显示技术分离、克隆食管癌组织中不表达或低表达的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段,再通过 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 、ｄｏｔ ｂｌｏｔ 和 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 证实。结果　获得２８０ｂｐ 的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段,命名为 Ｃ６２ Ａ。与 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ 基因数据库比较,未发现 Ｃ６２ Ａ 与任何已知基因有同源性。查询 Ｅ Ｓ Ｔ 数据库,发现 Ｃ６２ Ａ 与ｎｅ２７ｂ０３ ,ｓ１ Ｎ Ｃ Ｉ Ｃ Ｇ Ａ Ｐ Ｃ０３ 人ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆８９８５４１ 及人卵巢肿瘤ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆７５５１９６ 等高度同源。 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 结果显示６／６ 例食管癌组织表达丧失或低表达,ｄｏｔ ｂｌｏｔ 分析表明７／８例食管癌组织低表达, Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 显示食管癌细胞系 Ｅ Ｃ１０９ 、 Ｅ Ｃ８７１２ 、 Ｅ Ｃ９７０６ 和肺腺癌细胞系 Ｇ Ｌ Ｃ８２ 极弱表达,１７／２０ 例食管癌组织表达丧失或低表达,胎儿食管、皮肤、大脑、胎盘较高表达,胎儿胃、肝较弱表达,胎儿心、小肠、肾不表达。结论　在食管癌细胞系和食管癌组织高频率的不表达或低表达提示, Ｃ６２ Ａ 很可能与食管癌的发生、发展有关。     

刺激ECV304细胞增殖的新基因EOLA1的克隆和功能研究

目的 扩增内皮细胞受内毒素刺激后上调表达的新序列标签ST55（GenBank No．BMl21646）全长eDNA序列并研究其结构和生物学功能。方法 应用快速扩增cDNA末端技术延伸ST55获得其全长cDNA序列，以Noithem杂交检测其组织分布，通过酵母双杂交筛选其胞内相互作用蛋白，在ECV304细胞中稳定转染目的基因并强制表达后观察细胞生长变化。结果 获得1个全长为1404碱基的cDNA序列，作为人类新mRNA被GenBank接受（AY074889），命名为内皮高表达脂多糖相关因子1（endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1，EOLA1）。生物信息学分析显示EOLA1基因含5个外显子，定位于染色体Xq27．4，编码蛋白质由158个氨基酸组成，分子量为1789。Northern印迹显示EOLA1在人各组织和癌细胞系有不同的表达；以EOLA1 cDNA作为诱铒，进行酵母双杂交筛选人肝cDNA文库，鉴定了金属硫蛋白2A（metallothionein 2A，MT2A）为其相互作用蛋白并采用免疫共沉淀验证了这一结果。高表达EOLA1显著促进了ECV304细胞增殖。结论 EOLA1是人内皮活化相关新基因，EOLA1与MT2A的相互作用可能在炎症反应中细胞内保护方面发挥作用。