新生鼠缺氧缺血性脑损伤后经脑室人神经干细胞移植的实验研究

目的研究新生鼠缺氧缺血性脑损伤后经脑室移植人胚胎脑神经干细胞后,植入细胞的存活、迁移及分化情况。方法孕12周人胚胎神经干细胞在含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子和白血病细胞抑制因子的N2培养基(D/F12+N2+B27)中培养11天。生后7天的新生SD大鼠32只建立缺氧缺血性脑病模型,3天后将培养的人神经干细胞制成悬液(1.0×105/μl),采用立体定向移植至实验动物损伤侧脑室。移植后1、2、4周及3个月(每时间点各8只)取脑组织行HE染色和免疫组织化学分析。结果移植后1周大量抗人细胞核蛋白抗体阳性的植入细胞从脑室沿胼胝体向外迁移并到达损伤区,以损伤侧皮层、海马多见,在不同区域可见与宿主细胞类似的分化的植入细胞:移行至皮层的植入细胞85%分化为抗人细胞核蛋白神经丝蛋白或抗人核蛋白神经元管蛋白抗体双阳性的皮层细胞,而位于移行区域的植入细胞60%表达为抗人核蛋白胶质纤维酸性蛋白抗体双阳性的星形胶质细胞,其余细胞仍在迁移中未分化。移植后2周更多的移植细胞到达损伤区,移植后4周及3个月植入细胞数较前明显减少。结论人胚胎神经干细胞经脑室移植至缺氧缺血性脑损伤的鼠脑后能存活、迁移,并依迁移区域的不同分化为神经元和星形胶质细胞。     

人胎脑神经干细胞体外培养及分化研究

目的研究人胚胎神经干细胞体外长期培养的条件、不同部位脑组织神经干细胞数量及其分化能力和特点。方法分离人胚胎海马、皮质、室周、纹状体脑组织，培养在含碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、表皮生长因子（EGF）、B27、N2掭加剂的无血清培养基中，形成神经球，用有限稀释法进行克隆、传代。计算神经球数量，用溴脱氧尿苷（BrdU）标记神经球，使用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞自主分化能力。结粜人胚胎海马、皮质、室周、纹状体部位脑组织均能培养出具有自我增殖能力的神经干细胞，其中海马所含神经干细胞最丰富。室周次之。BrdU检测有正在分裂、增殖的细胞。液氮冻存6个月的细胞复苏后仍具增殖分化能力。细胞贴壁分化后可形成Nestin、胶质原性纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白2（MAP2）表达阳性细胞。结论胚胎脑组织具有丰富的神经干细胞。具有自我更新和增殖能力，可长期培养。含b-FOF、EGF的无血清培养基能促进神经干细胞连续稳定增殖，保持神经干细胞特性。分离培养的神经干细胞可向神经元、胶质细胞分化。     

小胶质细胞在癫痫发展中的研究进展

神经元的同步异常放电形成癫痫发作, 然而, 中枢神经系统中除神经元外, 小胶质细胞作为大脑的主要免疫细胞, 在发育过程中和成年期对神经回路的发育和维持起重要作用。小胶质细胞参与早期癫痫发作, 可通过增加炎症细胞因子及趋化因子介导癫痫发作。小胶质细胞可调节癫痫发作后异常神经发生, 促进癫痫发作后神经元的死亡, 引起神经退化。还可影响癫痫发作后突触修剪, 通过吞噬或剥离消除突触, 破坏突触兴奋与抑制平衡, 加重癫痫发作。小胶质细胞在癫痫发展中起重要作用, 但小胶质细胞是否参与了癫痫的发生仍需进一步研究。     

子宫内电穿孔法调控鼠胚大脑皮质神经干细胞基因表达体系的建立

目的 利用子宫内电穿孔(in utero electroporation,IUE)技术,建立小鼠胚胎阶段调控大脑皮质神经干细胞基因表达体系。方法 向孕14.5 d鼠胚脑室内注入pCIG质粒,电转至大脑皮质神经干细胞(neural stem cell,NSC)。取孕16.5 d或孕17.5 d鼠胚脑组织制作冰冻切片,采用免疫荧光染色观察NSC的增殖、凋亡、分裂、定向分化及迁移和成熟。结果 可在孕16.5 d观察到NSC向中间前体神经元分化、NSC增殖与凋亡及放射状胶质细胞放射轴形态结构发育的情况;可在孕17.5 d观察到NSC向大脑皮质Ⅴ～Ⅵ层神经元分化、NSC向外侧大脑皮质迁移、迁移神经元树突发育及神经元成熟的情况。结论 采用IUE技术可成功建立调控小鼠胚胎大脑皮质NSC基因表达体系,这有利于深入开展大脑皮质NSC的增殖、凋亡、分裂、定向分化、迁移和成熟等神经发育相关研究。[中国当代儿科杂志,2022,24 (9):1061-1067]     

星形胶质细胞GJ及Cx43表达影响因素研究进展

星形胶质细胞间存在间隙连接（GJ）,表达连接蛋白（Cx）43,它将星形胶质细胞连接成功能合胞体。在神经系统的信号传递及各种反应中,通过细胞外离子、神经递质、神经调质及神经元－神经胶质间的相互作用,维持细胞内外环境稳定及某些神经元的功能。脑组织缺氧、缺血、其它损伤等异常情况下,星形胶质细胞间的CJ、Cx43及偶联被打破,导致神经元功能失常及死亡。本文就星形胶质细胞GJ及Cx43表达影响因素作一综述。     

bFGF与缺氧缺血性脑损伤的修复

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种在体内分布广泛,对多种细胞尤其是神经元和神经胶质细胞的增殖、分化功能有强烈调节作用的生物活性因子。新生儿缺氧缺血性脑损伤具有较高的病死率和神经系统后遗症发生率。体内外动物实验证实,bFGF可以促进神经元和神经胶质细胞的增殖、存活和生长,尤其在损伤早期,给予外源性bFGF可以明显提高受损部位周围脑组织存活神经元数目。     

星形胶质细胞GJ及Cx43表达影响因素研究进展

星形胶质细胞间存在间隙连接（ＧＪ）,表达连接蛋白（Ｃｘ）４３,它将星影胶质细胞连接成功能合胞体。在神经系统的信号传递及各种反应中,通过细胞外离子、神经递质、神经调质及神经元－神经胶质间的相互作用,维持细胞内外环境稳定及某些神经元的功能。脑组织缺氧、缺血、其它损伤等异常情况下,星形胶质细胞间的 ＧＪ、 Ｃｘ４３及偶联被打破,导致神经元功能失常及死亡。本文就星影胶质细胞ＧＪ及Ｃｘ４３代表达影响因素作一综述。     

bFGF与缺氧缺血性脑损伤的修复

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF）是一种在体内分布广泛，对多种细胞尤其是神经元和神经胶质细胞的增殖、分化功能有强烈调节作用的生物活性因子。新生儿缺氧缺血性脑损伤具有较高的病死率和神经系统后遗症发生率。体内外动物实验证实，bFGF可以促进神经元和神经胶质细胞的增殖、存活和生长、尤其在损伤早期，给予外源性bFGF可以明显提高受损部位周围脑组织存活神经元数目。     

缺氧缺血对人类胚胎脑室管膜下区神经细胞亚群的影响

目的 研究缺氧缺血对妊娠中期人类胚胎脑室管膜下区(subventricular zone,SVZ)神经细胞亚群的影响.方法 取即刻解离的妊娠中期人类胚胎脑SVZ细胞,分缺氧缺血组(HI组)和对照组短时培养.以氧糖缺失法(OGD)制备缺氧缺血损伤细胞模型.培养前以细胞成活率评价损伤程度,培养后以细胞特异性标志蛋白nestin、MAP2、GFAP、PDGFRa及RCA120的抗体通过免疫荧光细胞化学法分别鉴定神经干细胞(NSCs)、神经元、星形胶质细胞、少突胶质祖细胞及小胶质细胞,比较其百分含量.结果 HI组的细胞成活率(63.41%±0.06%),明显低于正常组(98.9%±0.01%)(P＜0.001),短时培养后HI组中细胞亚群中含量最高的是GFAP(+)的星形胶质细胞56.48%±0.03%,其次为神经干细胞NSCs 22.47%±0.03%而PDGFRa(+)的少突胶质祖细胞含量最低;在对照组中最高则为MAP2(+)的神经元48.81%±0.03%,其次为GFAP(+)的星形胶质细胞32.31%±0.03%.含量最少的为小胶质细胞1.15%±0.01%.结论 妊娠中期人类胚胎脑SVZ含有NSCs、神经元、星形胶质细胞、少突胶质祖细胞和小胶质细胞,缺氧缺血对SVZ神经细胞损伤明显,不同细胞对缺氧缺血损伤的耐受性不同:NSCs、星形胶质细胞对缺氧缺血损伤的耐受性相对强于神经元、少突胶质祖细胞.     

大鼠胚胎神经干细胞移植治疗类脊髓栓系综合征的实验研究

目的将胎鼠的神经干细胞移植到脊髓栓系综合征大鼠的病变脊髓中，观察治疗效果。方法从孕17d大鼠胚胎脊髓中分离、培养神经干细胞并诱导分化，通过免疫组化技术研究证实其特性。制作大鼠脊髓栓系模型，3d后将未分化的神经干细胞注人病变脊髓内，2个月后观察大鼠的运动功能，处死大鼠，研究移植后的干细胞在体内存活、迁移及分化情况。结果实验中分离、培养的神经干细胞能够被诱导分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。脊髓栓系大鼠移植干细胞后运动功能改善，神经元数目增多，显著好于未移植组。免疫组化方法证实移植后的干细胞在体内可以存活、迁移、分化成神经细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞体内、体外均具有多向分化潜能，移植神经干细胞是治疗脊髓栓系神经变性的一种有效途径。     

染色质重塑在小儿神经发育障碍中的遗传学机制进展

神经系统发育受到外在环境和内在信号的调控，除转录因子外，表观遗传修饰也发挥着重要作用。该文主要围绕ATP依赖的染色质重塑在小儿神经发育障碍中的遗传学机制展开，详细论述4大染色质重塑复合物家族对神经发生、神经元及神经胶质细胞发育成熟的影响，介绍神经发育障碍的临床研究进展。     

营养与儿童脑发育和脑功能

一、蛋白质与脑发育 在脑细胞中氨基酸代谢和蛋白质合成非常活跃。不管是细胞增殖还是体积增大,蛋白质营养均占主要地位,尤其是后者,主要依赖蛋白质的合成。新生儿脑中氨基酸浓度远较成年人高,对保证脑内蛋白快速合成起重要作用。蛋白质营养不良对细胞增殖期的影响是永久性的,而对细胞生长期的影响是可逆的。脑组织各部分的发育在时间上是不同步的,因此,不同时期的蛋白质缺乏的影响也是不同的。人类大脑的发育在妊娠后3个月发育最快,出生后继续发育,直至2足岁;小脑主要在出生后发育;髓鞘形成,从胎龄4个月开始,至2足岁得以完成,髓鞘的形成,表示神经系统的成熟。     

胶质细胞源性神经营养因子和缺氧缺血性脑损伤

胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是神经营养因子家族的重要新成员,对神经元的发育、生长、分化、修复和再生有其他神经营养因子不可替代的作用。该文阐述了GDNF的基因,结构,受体及信号传导系统及其生物学功能,并阐述了GDNF在新生儿缺氧缺血性脑病脑组织中呈双峰式表达上调以及应用GDNF可以减轻脑损伤,改善新生儿缺氧缺血性脑病后所致的长期学习和记忆障碍。     

碱性成纤维细胞生长因子对胚胎大鼠神经干细胞增殖分化的影响

目的探讨分离、培养及鉴定胚胎大鼠神经干细胞(NSCs)方法，观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对NSCs增殖、分化的影响。方法从大鼠胚胎脑组织中分离出NSCs，用bRGF和胎牛血清诱导其增殖和分化，予BrdU以标记分裂细胞，采用免疫细胞化学鉴定NSCs和分化神经细胞。结果大鼠胚胎脑NSCs在无细胞因子和胎牛血清的培养基中无新生细胞形成，但能在bFGF和血清诱导下形成克隆，并产生nestin和BrdU阳性细胞，贴壁后分化为神经元和星形胶质细胞。结论该方法从大鼠胚胎大脑分离出的细胞具有NSCs特性，即自我更新和多向分化潜能;bFGF是NSCs增殖必须的丝裂原。     

神经元特异性烯醇化酶在小儿中枢神经系统疾病中的应用

神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific-enolase,NSE）属于烯醇化酶中的一种同工酶,是糖酵解途径中的关键酶,并特异性存在于神经元、神经内分泌细胞和少突胶质内.NSE的活性在脑组织细胞中最高,在外周神经和神经分泌组织内居中,最低则在非神经组织、血清和脑脊液中.NSE的活性改变与导致神经损伤的许多神经性疾病关系密切.本文就NSE的基本生物学特性、功能及其与小儿中枢神经系统疾病的关系等进行综述.     

不同日龄大鼠海马神经发生的研究

目的 探讨年龄因素对大鼠海马齿状回神经发生的影响及新生神经细胞的分化.方法选择7、14、28、60、180 d 5个日龄组SD大鼠,每组8只,雌雄不限.采用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记新生细胞,以β微管蛋白(TuJ1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)双标免疫组织化学方法分别标记其神经元和胶质细胞,检测不同日龄大鼠海马齿状回神经发生,了解新生细胞向神经元细胞和神经胶质细胞分化比例.结果5个日龄组大鼠均有海马齿状回颗粒细胞层神经发生现象,细胞形态多样,呈圆形、椭圆形、菱形等,胞核较大,分布于整个颗粒细胞层.日龄7、14、28、60、180 d组大鼠BrdU阳性细胞数分别为158.07±5.37、141.28±7.27、116.93±9.24、76.56±6.88、41.42±4.45,随着日龄的增长,大鼠海马齿状回新生细胞数量渐减少(P＜0.05);日龄7、14、28、60、180 d组大鼠BrdU阳性细胞同时表达TuJ1的比例分别为81.6.%、78.9%、83.9%、80.2%、82.4%,组间比较无明显差异(P＞0.05);各组新生细胞中4%～5%为GFAP阳性.还有少数齿状回的BrdU阳性细胞并不同时表达TuJ1或GFAP.结论在生理状态下不同日龄大鼠海马齿状回存在神经细胞增殖现象,而且随着日龄增加,神经元再生的能力渐减弱,新生细胞多分化为神经元细胞.     

小儿营养和智能发育

脑是智能发育的物质基础。早在胚胎的第18天就出现脑细胞发育的基质神经板。胚胎10～18周脑的生长极快,至23周,大脑皮质的6层结构已基本定型。出生前3个月脑细胞的增殖最快,出生后细胞增殖减慢,6个月左右增殖停止,但细胞的发育和功能完善在4岁前极为迅速。出生时脑重约350g,6个月时达600g,3岁达900～1000g,为成人脑重的2/3。所以生前3个月至生后3岁是脑发育的关键时期。也是智能发育的重要时期,此期的营养也就显得特别重要。脑的营养需要脑细胞在增殖、发育期间,大量细胞分裂复制,轴突分枝,树突生长,突触联接,以及髓鞘形成都需要充足的营养供给。在脑细胞中,蛋白质和氨基酸的代谢十分活跃。细胞核中DNA和RNA     

人胚胎消化道神经节细胞发育的研究

为了研究胎儿消化道神经节细胞的发育过程，探讨神经节细胞的发育与肠管发育之间的关系，共观察了新鲜胎儿标本２２个，其中男１１个，女１１个。胎龄为３～１０个月。剖取全部消化道，分段作大切片，然后行ＨＥ染色及特殊染色，部分标本作电镜观察。结果提示：胎龄越小，神经节细胞发育越不成熟。在胚胎３个月时，消化道各节段肌间及粘膜下层均未见明确的神经丛及神经节细胞，胚胎４个月时才偶见体积较小、发育不成熟的神经节细胞，５个月时肠壁增厚，神经节细胞发育，但仍不成熟，至６个月时，神经节细胞明显增多，并成簇状分布。研究提示神经节细胞的发育与肠管其他结构的发育是同步进行的。研究中未见到近端肠管神经节细胞较远端肠管神经节细胞提前发育，也未发现神经节细胞从前肠向后肠移行的过程。先天性巨结肠的成因不仅仅是胚胎发育第６～１２周神经嵴内神经节细胞向肠管移行过程中胚胎发育停顿的结果，而且在胚胎发育的第１２～１６周，肠管神经节细胞发育成熟之前某些影响神经节细胞发育的局部因素也可导致无神经节细胞巨结肠的形成。     

比较胚胎和新生小鼠肠神经嵴干细胞体外增殖分化的实验研究

目的联合应用简化无血清培养基和连续传代法，从胚胎14～17d、新生1d、新生5d小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞（gut neural crest stem cells，GNCSCs），观察其体外培养过程中增殖、分化的特点，用p75、GFAP、Peripherin、α-Actin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系，比较胚胎和新生小鼠GNCSCs在生长速度、分化细胞的种类及数量上的差异。方法取3组小鼠的肠管，分离制成单细胞悬液，接种于DMEM／F12完全培养基贴壁培养，在连续传代培养中观察克隆球的形成；将克隆球接种于含血清培养基，观察其分化现象；用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达。结果部分胚胎和新生小鼠肠管细胞在无血清培养基中连续传代培养形成克隆球。在血清刺激下克隆球可分化为多种形态的细胞。克隆球和分化细胞系的免疫染色均为阳性。结论胚胎和新生鼠肠管内存在具有自我更新能力的GNCSCs，且均可分化为神经元、神经胶质细胞和平滑肌三类细胞。新生鼠较胎鼠GNCSCs生长速度慢，分化的神经元数量减少，神经胶质细胞数量增加，平滑肌细胞无显著变化。     

三种方法建立神经元与星形胶质细胞共培养模型的对比研究

目的：比较神经元和星形胶质细胞共培养的3种不同方法,旨在获得高纯度的神经元。方法：采用新生大鼠作为神经元和星形胶质细胞体外培养的细胞来源,用混合培养、Banker共培养方法和插入式培养皿的方法建立神经元和星形胶质细胞共培养模型。结果：混合培养的神经元和星形胶质细胞同时生长在一个盖玻片上,不易控制胶质细胞的生长速度,神经元纯度不高;Banker共培养方法和插入式培养皿的方法均可获得高纯度的神经元,但 Banker 程序复杂;插入式培养皿的方法简化了 Banker 共培养程序。结论：利用插入式培养皿建立神经元和星形胶质细胞共培养体系,是一种值得推广的可用于体外细胞共培养相关研究工作的有效方法。［中国当代儿科杂志,2010,12(12)：984-987］