黄芪多糖对体外培养大鼠软骨细胞内糖胺多糖合成的影响及其机制

目的：研究黄芪多糖对大鼠退变软骨细胞糖胺多糖（GAG）合成的影响。方法：分离大鼠关节软骨细胞传代培养并加入IL-1β造模,分别将100,10,1,0.1 mg/L的黄芪多糖作用于该软骨细胞,以4.5 mg/L的硫酸氨基葡萄糖作为阳性对照。其后检测细胞增殖、细胞内GAG含量、细胞内葡萄糖醛酸转移酶Ⅰ（GlcAT-1）mRNA含量和透射电镜观察细胞形态学改变。结果：各浓度的黄芪多糖均对大鼠软骨细胞增殖率无影响。100 mg/L的黄芪多糖可以增加软骨细胞内GAG的合成（P〈0.01）;1,10,100 mg/L的黄芪多糖能够增加GlcAT-1 mRNA的表达。结论：黄芪多糖能逆转IL-1β对体外培养的大鼠软骨细胞GAG合成的抑制作用,其主要机制可能与促进GlcAT-1的表达有关。     

当归多糖组分APS-3c软骨保护作用的体外研究

目的:探究当归多糖组分ASP-3c抗骨关节炎的分子机制。方法:不同浓度ASP-3c(2～50μg/mL)单独或联合人重组白细胞介素1β(IL-1β,10 ng/mL)处理人原代软骨细胞48 h。MTT法检测软骨细胞活力;倒置显微镜观察细胞形态;DMB法检测培养上清蛋白多糖含量;实时定量PCR及Western Blot检测IL-1β、IL-6及糖基转移酶基因表达。结果:ASP-3c处理人原代软骨细胞48 h不影响其增殖活性,并可改善IL-1β所致的软骨细胞退变表型。ASP-3c可浓度依赖性地抑制软骨细胞内IL-1β、IL-6的基因表达,并阻断外源性IL-1β对软骨细胞IL-1β、IL-6的上调作用。同时,无论是否存在外源性IL-1β处理,ASP-3c均可促进蛋白多糖合成,上调糖基转移酶mRNA水平。结论:ASP-3c可通过抑制软骨细胞IL-1β、IL-6等炎症因子的合成减轻软骨局部炎症;并促进软骨基质蛋白多糖合成恢复基质稳态,进而起到抗骨关节炎功效。     

透明质酸对体外培养大鼠退变关节软骨细胞的影响

目的:观察体外培养大鼠关节软骨生长特性及分泌蛋白多糖(PG)功能,研究中分子量透明质酸(HA)对体外培养大鼠退变关节软骨细胞的影响。方法:机械分离和胰酶、胶原酶二步消化法消化,将大鼠膝、髋关节软骨细胞进行体外分离培养,白细胞介素1β(IL-1β,10μg/L)体外造模,观察中分子质量HA(分子质量2×106U)对骨关节炎细胞模型中细胞生长增殖及细胞蛋白多糖分泌功能的影响。结果:体外培养的大鼠正常关节软骨细胞呈多角形,富含分泌颗粒。当培养基中加入IL-1β后,关节软骨细胞胞质回缩,细胞内出现空泡,骨关节炎模型组细胞增殖率及蛋白多糖的含量均较空白组低(P<0.05)。加入HA的实验组软骨细胞增殖率与模型组相比无差异(P>0.05),较空白组低(P<0.05);蛋白多糖的含量较模型组高(P<0.05),与空白对照组无差异(P>0.05)。结论:HA对体外培养大鼠退变关节软骨细胞增值率无影响,但可以增加其蛋白多糖的合成。     

黄芪多糖对 RAW264.7泡沫细胞胆固醇含量及 ABCAl 表达的影响

目的：：以 RAW264.7泡沫细胞为研究对象,探讨黄芪多糖对胆固醇酯含量和 ABCAl 表达的影响。方法：将 RAW264.7巨噬细胞诱导分化成泡沫细胞,用不同浓度黄芪多糖对其干预24 h,酶法测定胆固醇酯含量,RT-PCR 法检测泡沫细胞内 ABCA1的 mRNA 表达。结果：对照组、10、20、50、100 mg/L 的黄芪多糖(APS)作用于泡沫细胞24 h 后,巨噬细胞内胆固醇酯含量分别为(45.15±3.57、37.67±2.26、34.59±3.51、28.57±10.34、15.92±3.86)nmol/mg。除10 mg/L 组外,其余各 APS 组与对照组比较,差异具有统计学意义(P <0.01)。采用 RT-PCR 方法检测 ABCA1的 mRNA 表达,ABCA1与β-actin OD 比值之比分别为0.41±0.03、0.59±0.03、0.64±0.08、0.77±0.11、0.95±0.07。根据其比值大小可判断各组 ABCA1的相对表达水平。各 APS 组与对照组比较,差异具有统计学意义(P <0.01)。结论：黄芪多糖可能通过上调 ABCAI 的基因表达而降低泡沫细胞内胆固醇脂含量。     

转化生长因子—β1对猪关节软骨细胞合成糖胺多糖的作用

目的观察转化生长因子-β1 (TGF-β1)对软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(GAG)含量的影响。方法通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞,定量接种6×106个细胞于培养皿,在细胞贴壁后更换培养基时,加入TGF-β1 10ng/mL,每周传代1次,连续5周,留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质GAG的变化;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果体外培养的软骨细胞从传代后合成糖胺多糖类基质,第2代传代细胞分泌GAG的能力最强;加入TGF-β1能明显促进传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质。结论TGF-β1能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质。     

脱氢表雄酮对白细胞介素-1β诱导的人骨关节炎软骨细胞退变的影响

目的:研究脱氢表雄酮(DHEA)对白细胞介素(IL-1β)诱导的人骨关节炎软骨细胞退变的影响。方法:分离人骨关节炎软骨细胞传代培养并加入IL-1β,分别将50,25和12.5μmol/L的DHEA作用于该软骨细胞。其后检测细胞增殖、上清液糖胺聚糖(GAG)和NO含量、细胞凋亡以及质金属蛋白酶-1及其组织抑制剂-1(MMP-1和TIMP-1)含量。结果:50,25和12.5μmol/L的DHEA均能促进软骨细胞增殖和GAG合成(均P<0.01),抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡(均P<0.01)以及MMP-1合成(均P<0.01);50和25μmol/L的DHEA可抑制IL-1β诱导的软骨细胞NO形成(均P<0.01),还可抑制软骨细胞自身的凋亡(均P<0.01)和MMP-1合成(均P<0.05),其效应呈浓度依赖性;50μmol/L的DHEA还可改善IL-1β对骨关节炎软骨细胞TIMP-1合成的抑制作用(P<0.05)。结论:脱氢表雄酮能在一定程度上对抗IL-1β诱导的人骨关节炎软骨细胞退变。     

黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达的影响

目的:观察黄芪甲苷对原代培养骨关节炎患者的膝关节软骨细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达影响,初步探讨黄芪甲苷防治膝骨关节软骨退变的作用机制。方法:原代培养骨关节炎患者的膝关节软骨细胞,用第三代细胞进行试验。将5个不同浓度的黄芪甲苷,分别作用于关节软骨细胞4、8、24、48、72h后,采用Real Time-PCR法检测细胞中Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)、蛋白多糖基因(ACAN)的mRNA表达。结果:黄芪甲苷浓度为25~75mmol/L,作用于退变关节软骨细胞24~72h时,软骨细胞Col Ⅱ和ACAN mRNA的表达量均较对照组显著增加。结论:黄芪甲苷可延缓膝骨关节炎关节软骨细胞的退变,促进软骨细胞ColⅡ及ACAN mRNA的表达可能是其作用机制之一。     

黄芪多糖对大鼠骨关节炎的影响

目的:探讨黄芪多糖对大鼠骨关节炎(OA)的影响。方法:4%木瓜蛋白酶关节腔注射建立大鼠OA模型,1周后50只大鼠分成5组:正常组、模型组、0.10,0.25,0.50 g/L的黄芪多糖治疗组,分组后即开始用不同浓度的黄芪多糖关节腔注射治疗,每3 d 1次,每次双膝各注射0.2 ml,对照组注射生理盐水。6周后处死动物,抽取血液、取关节滑膜检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),切取关节,进行大体及组织学观察,用免疫组织化学方法检测基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)在关节软骨中的表达。结果:黄芪多糖在高浓度可明显修复关节软骨的退变(P<0.01),降低关节滑膜、血清的MDA水平(均P<0.01),增加SOD活性(P<0.01);在低浓度时对关节软骨的修复作用并不明显(P>0.05),也不能显著降低关节滑膜、血清的MDA水平(均P>0.05)和增加SOD活性(P>0.05)。黄芪多糖可以抑制MMP-3在关节软骨中的表达(P<0.01),黄芪多糖在高浓度时可明显增加关节软骨中葡糖氨基聚糖(GAG)含量(P<0.01)。结论:黄芪多糖关节腔注射治疗大鼠OA可促进退变软骨的修复。     

黄芪多糖对上调ABCA1表达与泡沫细胞内胆固醇含量的关系分析

目的:探讨黄芪多糖对ABCA1蛋白表达的影响.方法:将RAW264.7巨噬细胞诱导分化成泡沫细胞,用不同浓度黄芪多糖对其干预24 h,酶法测定泡沫细胞内胆固醇酯含量,ELISA法检测细胞内ABCA1的蛋白表达.结果:对照组、10、20、50、100 mg/L的APS作用于泡沫细胞24 h后,细胞内胆固醇酯含量分别为45.15±3.57、37.67±2.26、34.59±3.51、28.57±10.34、15.92±3.86 nmol/mg.各组ABCA1蛋白浓度为(6.02±6.12)、(15.86±9.15)、(54.76±14.20)、(75.39±10.09)、(97.56±13.25)ng/L.各APS组与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论:黄芪多糖可能通过上调ABCA1的蛋白表达而降低泡沫细胞内胆固醇含量.     

TGF-β1和BMP-2对终板软骨细胞增殖和糖胺多糖合成的影响

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)和骨形态发生蛋白2(BMP-2)对体外培养大鼠终板软骨细胞增殖和合成糖胺多糖的影响。方法:取原代大鼠终板软骨细胞,体外培养传代至第二代,常规培养液培养组为对照组,培养液中加入TGF-β1及BMP-2作用于软骨细胞为实验组,观察细胞的生长情况,测定终板软骨细胞增殖和糖胺多糖(GAG)含量的变化,分析两种因子对软骨细胞增殖行为和合成糖胺多糖的影响。结果:单独应用TGF-β1与BMP-2刺激,终板软骨细胞增殖能力及糖胺多糖合成较对照组增高,而TGF-β1与BMP-2联合使用能够更加明显地促进终板软骨细胞增殖能力及糖胺多糖的合成。结论:一定浓度的TGF-β1与BMP-2联合使用,能有效促进体外培养的软骨细胞增殖和合成GAG基质的能力。     

白藜芦醇对白细胞介素-1β诱导软骨细胞iNOs表达的影响

目的:探讨白藜芦醇对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导下大鼠软骨细胞细胞一氧化氮合酶(i NOs)表达的影响。方法:体外培养大鼠膝关节软骨细胞,用IL-1β(10μg/L)刺激,并不加或加入不同浓度的白藜芦醇处理,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测i NOs基因及相关蛋白表达。结果:IL-1β诱导下软骨细胞i NOs的表达显著增加(和对照组比较,P<0.05),而加入不同浓度白藜芦醇能明显抑制IL-1β诱导软骨细胞i NOs的表达。结论:白藜芦醇抑制IL-1β诱导软骨细胞i NOs的表达是其保护骨关节炎软骨细胞的机制之一。     

川芎嗪对IL-1β诱导的兔原代软骨细胞iNOS表达和NO合成的影响

目的观察川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的兔原代软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达及一氧化氮(NO)合成的影响。方法体外培养兔软骨细胞,用甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖,免疫荧光检测兔原代软骨细胞Ⅱ型胶原;用IL-1β10 ng/ml和(或)不同浓度(5、10、15、20μg/ml)川芎嗪共培养兔原代软骨细胞48 h后,RT-PCR和免疫组化检测iNOS基因及蛋白表达;用硝酸还原法检测细胞培养上清液NO的表达。结果软骨细胞呈三角形或多角形,蛋白多糖表达于细胞质中,Ⅱ型胶原主要表达于细胞质,少见于细胞核。与对照组比较,IL-1β单独作用软骨细胞iNOS和NO的表达显著增加(P<0.01);IL-1β和川芎嗪联合作用后,软骨细胞iNOS和NO的表达较IL-1β单独作用显著降低(P<0.05,P<0.01),但仍显著高于对照组(P<0.01)。结论川芎嗪能有效抑制IL-1β诱导兔软骨细胞iNOS的表达和NO的合成。     

透明质酸对白细胞介素-1β诱导软骨细胞iNOS活性和表达的影响

目的:研究透明质酸对重组大鼠白细胞介素-1β(rrIL-β)诱导体外骨关节炎软骨细胞iNOS活性和表达的影响,并探讨其作用机制.方法:体外分离、培养大鼠软骨细胞成功后,加入不同浓度的透明质酸(10,20,40 mg/L)1 h后,以10 μ g/L IL-1β刺激,培养24 h后,通过RT-PCR检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS) mRNA的表达;以Griess反应测定上清液中一氧化氮(NO)浓度,并通过iNOS催化L-精氨酸和分子氧反应生成NO推算iNOS的活力.结果:透明质酸可有效抑制IL-1β诱导骨关节炎软骨细胞iNOS的活性和NO的产量;RT-PCR检测显示透明质酸能抑制iNOS的mRNA表达,且呈现剂量依赖的趋势.结论:透明质酸能通过降低iNOS的活性和其蛋白表达,来抑制骨关节炎软骨细胞上清液中NO的含量.     

葛根素对IL-1β损伤大鼠关节软骨细胞增殖的影响

目的 观察葛根素（Pue）对IL-1β损伤大鼠关节软骨细胞增殖的影响.方法 取10日龄大鼠膝关节软骨做体外细胞培养,培养后软骨细胞随机分为六组：正常组、IL-1β组、地塞米松组、Pue50组、Pue100组、Pue200组.其中,IL-1β组、地塞米松组、Pue50组、Pue100组、Pue200组分别加入IL-1β（5μg/L）10 μmol、IL-1β （5μg/L） 10 μmol＋地塞米松10-9 mol/L、IL-1β（5μg/L）10μmol＋Pue 50μmol/L、IL-1β（5μg/L）10.μmol＋Pue 100μmol/L、IL-1β（5μg/L）10 μmol＋Pue200 μmol/L,使用酶标仪测定570 nm光吸收值,计算各组软骨细胞的增殖率.结果 正常组、IL-1β组、地塞米松组、Pue50组、Pue100组、Pue200组软骨细胞的增殖率分别为0、-11.044％、0.471％、-2.424％、2.828％、5.387％,地塞米松组、Pue50组、Pue100组、Pue200与IL-1β组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,且随着Pue剂量升高,使增殖率逐步上升.结论 葛根素具有一定的促进软骨细胞增殖的作用,为防治骨性关节炎提供理论依据.     

黄芪多糖对子宫内膜癌患者外周血单核细胞源性DCs成熟的影响

目的探讨黄芪多糖对子宫内膜癌患者外周血单核细胞源性树突状细胞（DCs）成熟的影响。方法从子宫内膜癌患者外周血中分离单核细胞,以加入IL-4、GM-CSF树突状细胞专用培养基培养5d后,以不同浓度的黄芪多糖（终浓度分别为0、50mg/L、100mg/L、150mg/L）刺激48h,镜下观察DCs形态变化,采用流式细胞术检测树突状细胞表型CD1α、CD83、CD86的表达,以及ELISA法检测细胞上清液中IL-12的含量。结果 150mg/L APS组细胞生长状态最好,具有典型的树枝状突起;150mg/L APS组、100mg/L APS组DCs表面CD1α、CD83及CD86的表达较对照组、50mg/L APS组明显上调（P〈0.05）;150mg/L APS组、100mg/L APS组细胞上清液中IL-12含量高于对照组、50mg/L APS组（P〈0.05）。结论黄芪多糖可促进子宫内膜癌患者外周血单核细胞源性DCs成熟以及IL-12的分泌。     

骨形成蛋白-7对多孔钽／软骨细胞复合物分泌功能以及 Col-Ⅱ、AGG 和 Sox9基因表达的影响

目的：研究人重组骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7,BMP-7）对国产多孔钽／软骨细胞复合物中软骨细胞分泌功能以及Ⅱ型胶原（ typeⅡcollagen,Col-Ⅱ）、蛋白聚糖（ aggrecan,AGG）和SRY相关高迁移率组基因9（SRY-related high mobility group-box gene 9,Sox9）mRNA表达的影响。方法：3周龄新西兰幼兔,取双膝关节软骨细胞分离培养及鉴定,将生长状态良好的第2代细胞以1×106／mL浓度接种于多孔钽并给予不同浓度BMP-7,分为对照组（多孔钽／软骨细胞组）、50μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组、100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组及200μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组。 CCK-8法检测不同浓度BMP-7对多孔钽／软骨细胞生长及增殖的影响,扫描电镜观察各组软骨细胞在多孔钽表面及内部生长情况,二甲基亚甲蓝（ dimethyl methylene blue,DMMB）比色定量法对BMP-7／多孔钽／软骨细胞复合物糖胺多糖（ glycosaminoglycan,GAG）进行定量检测,实时荧光定量PCR检测Col-Ⅱ、AGG和Sox9 mRNA的表达。结果：原代软骨细胞培养24 h后呈梭形生长,4 d后细胞呈多角形,胞浆丰富。阿辛蓝（ alcian blue）、番红O（ safranin O）、Col-Ⅱ免疫细胞化学染色均呈阳性反应。 CCK-8法细胞增殖检测结果显示,100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组细胞增殖水平高于其他各组（ P＜0．05）。扫描电镜示各组软骨细胞在多孔钽表面生长状态良好,细胞有多个突起、伸展、叠层生长并覆盖于多孔钽表面。 GAG定量检测显示,100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组GAG含量比其他各组均明显升高（ P＜0．05）;实时荧光定量PCR检测显示,各实验组Col-Ⅱ、AGG和Sox9 mRNA表达量均高于对照组,以200μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组升高最为明显（ P＜0．05）。结论：BMP-7／多孔钽／软骨细胞复合体能促进体外软骨细胞增殖及细胞外基质的分泌,促进软骨基因的表达。     

黄芪多糖抑制IL-1β表达及改善脓毒症小鼠心功能研究

目的 探讨黄芪多糖对脓毒症小鼠心肌成纤维细胞IL-1β表达水平及心功能的影响。方法 取2~3月龄C57BL/6小鼠,设立对照组。以腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharidi,LPS)建立脓毒症模型,设立脓毒症组和黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)处理组,6 h后酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠外周血IL-1β蛋白表达,24 h后超声心动图检测小鼠心脏功能。取对照组C57BL/6小鼠,体外分离培养小鼠心肌成纤维细胞,设立对照组、LPS处理组和黄芪多糖低、中、高浓度(1、10、100 mg/L)+LPS处理组。采用ELISA检测细胞上清液中IL-1β,采用免疫印迹法检测Pro-IL-1β及IL-1β蛋白。结果 脓毒症小鼠心脏功能较对照组明显减退(P<0.05),黄芪多糖处理组较未处理的脓毒症小鼠心脏功能明显改善(P<0.05)。脓毒症组外周血IL-1β蛋白较对照组明显升高(P<0.05),黄芪多糖处理组的脓毒症小鼠IL-1β明显降低(P<0.05); LPS或联合三磷酸腺苷(ATP)诱导的心肌成纤维细胞与对照组相比,LPS组(LPS 1 ng/mL)诱导心肌成纤维细胞Pro-IL-1β及IL-1β蛋白明显增加(P<0.05),而黄芪多糖处理组较LPS组相比,Pro-IL-1β及IL-1β蛋白表达明显减少(P<0.05)。结论 黄芪多糖对脓毒症小鼠心肌成纤维细胞IL-1β蛋白表达有抑制作用,改善脓毒症引起的心脏功能障碍。     

葛根素对IL-1β损伤大鼠关节软骨细胞核因子-κB的影响

目的：观察葛根素（Pue）对IL-1β损伤大鼠关节软骨细胞核因子-κB（NF-κB）的影响。方法取10日龄大鼠关节软骨作体外细胞培养,培养后软骨细胞随机分为正常组、IL-1β组、地塞米松组、Pue50组、Pue100组、Pue200组等6组。后5组分别给药后24h,用实时定量PCR法检测各组NF-κBp65的表达。结果 IL-1β损伤软骨细胞核内NF-κBp65的表达明显增强,后4组与IL-1β组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,且随着剂量上升（50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）使其NF-κB的表达量逐步下降。结论葛根素具有一定的抑制NF-κBp65活化的作用,为防治骨性关节炎提供新的途径。