熊果酸通过AMPK介导的信号通路激活自噬改善油酸诱导的肝细胞脂肪沉积

[目的]揭示熊果酸改善油酸诱导的肝细胞脂质沉积的作用及其潜在分子机制。[方法] 采用油酸诱导HepG2肝细胞建立脂质沉积模型,给予不同浓度熊果酸(10、20、40μmol·L-1)进行干预,采用酶法检测细胞内甘油三酯含量,Bodipy染色法观察胞内的脂滴,Western blot检测抗微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B,LC3B)蛋白表达及腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化水平。[结果] 0.5mmol·L-1油酸干预肝细胞16h可建立肝脂质沉积体外模型;不同浓度熊果酸干预16h可以显著减轻油酸导致的肝细胞脂质沉积(P＜0.05,P＜0.01),且保护作用呈剂量依赖关系。自噬激动剂雷帕霉素可显著降低油酸诱导后肝细胞甘油三酯含量,并抑制胞内脂滴的形成(P＜0.05);而自噬抑制剂氯喹显著加重油酸诱导的肝脂质沉积(P＜0.05)。熊果酸干预可显著上调肝细胞内LC3B的表达(P＜0.05,P＜0.01),从而激活自噬,而抑制自噬可显著阻断熊果酸对肝脂质沉积的减轻作用。熊果酸还可显著激活自噬调控开关AMPK的磷酸化水平(P＜0.05)。[结论] 熊果酸通过激活自噬改善油酸诱导的肝细胞脂质沉积,AMPK可能是熊果酸激活自噬的潜在分子靶点。     

HepG2细胞胰岛素抵抗模型中脂代谢的改变

目的:探讨胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)对肝细胞脂代谢酶的影响?方法:用不同浓度胰岛素刺激HepG2细胞,建立肝细胞IR模型;用油红O染色观察细胞形态及胞内脂滴形成;应用甘油三酯(triglyceride,TG)检测试剂盒检测细胞中TG含量;Real-time PCR检测乙酰辅酶a羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)?肝型脂肪酸结合蛋白(liver-type fatty acid-binding protein,L-FABP)?脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)?肉碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1)?微粒体甘油三酯转移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein,MTP)等脂代谢相关因子及转录因子胆固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)?过氧化物酶体增生物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptor α,PPARα)的mRNA表达水平?结果:用浓度1×10-4 mol/L的胰岛素刺激细胞36 h后形成IR?IR细胞内脂滴增多,TG含量增加;IR细胞内脂合成相关的ACC?SREBP-1c的mRNA水平较对照组升高;LPL?CPT1?MTP?PPARα的mRNA水平较对照组降低;L-FABP mRNA水平与对照组相比无差异?结论:IR通过提高肝细胞脂合成?降低脂氧化过程,导致肝细胞内脂质异常堆积?     

松果菊苷通过调控SIRT1/PGC-1α信号通路改善肥胖糖尿病小鼠肝损伤

目的 探讨松果菊苷(ECH)通过调控SIRT1和PGC-1α及其下游因子表达水平在改善肥胖糖尿病小鼠(db/db小鼠)肝损伤中的作用。方法 20只8周龄db/db小鼠采用数字表法随机分为糖尿病模型组(db/db组,0.9%氯化钠注射液灌胃,n=10)和松果菊苷治疗组(db/db+ECH组,松果菊苷灌胃,n=10)。8周龄db/m小鼠(db/m组,生理盐水灌胃,n=9),为正常对照组。每天给药1次,共处理10周。观察一般情况,监测各组小鼠体质量和血糖、计算肝质量指数,检测血清中ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平; HE染色和油红O染色观察肝脏病理学改变和脂质沉积;Western blot法检测肝脏SIRT1、PGC-1α、PPARα、CPT1蛋白质表达量;RT-PCR法检测肝脏SIRT1、PGC-1α mRNA表达。结果 糖尿病肝损伤主要表现为非酒精性脂肪肝(NAFLD),与正常对照组比较,糖尿病模型组肝质量指数和血糖增加,肝脏组织细胞气球样变性,脂滴沉积,炎性细胞浸润,血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C水平升高,HDL-C降低,SIRT1、PGC-1α蛋白质和mRNA表达水平降低,PPARα、CPT1蛋白质表达降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);与糖尿病对照组比较,松果菊苷治疗组小鼠一般情况改善,糖尿病模型组肝质量指数和血糖降低,肝脏组织脂质沉积和细胞坏死减轻,血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C水平降低,HDL-C增加,SIRT1、PGC-1α蛋白质和mRNA表达水平上调, PPARα、CPT1蛋白质表达上调,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 松果菊苷可延缓肥胖糖尿病所致的肝损伤的发生, 其机制与上调肝SIRT1/PGC-1α通路及其下游因子表达水平有关。     

内质网应激通过SCAP/SREBP-1c调控L02肝细胞脂质合成代谢

目的 在内质网应激状态下,观察SCAP/SREBP-1c对肝细胞脂质合成代谢的影响.方法 用毒胡萝卜素(Tg)诱导人L02正常肝细胞株建立内质网应激模型,Western blot检测GRP78的蛋白表达.甘油三酯(TG)试剂盒和油红O染色检测肝细胞内脂变程度;实时荧光定量PCR检测SREBP-1c下游脂代谢相关基因FAS、ACC1的mRNA表达情况,Western blot检测nSREBP-1c、FAS、ACC1的蛋白表达情况.通过miRNA瞬时转染沉默SCAP基因的表达,观察上述指标的变化情况.结果 实验组GRP78蛋白的相对表达量与对照组比较,均显著增加(P＜0.05),Tg在体外成功建立肝细胞内质网应激模型.与空白对照组相比,Tg组肝细胞内甘油三酯含量明显增加(P＜0.05),脂滴明显增多;nSREBP-1c的蛋白水平明显升高(P＜0.05);下游靶基因FAS和ACC1的基因和蛋白水平均明显上调(P＜0.05),与nSREBP-1c的升高趋势一致.转染SCAP-3 miRNA载体后,以上指标均明显下调(P＜0.05).结论 内质网应激通过SCAP/SREBP-1c调控肝细胞脂质合成代谢,促进脂质沉积,是NAFLD重要的发病机制之一.靶向干扰SCAP,能减轻内质网应激所致的肝细胞脂肪变程度,成为安全有效的NAFLD防治新靶点.     

槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对游离脂肪酸诱导HepG2细胞脂肪变性的作用

探讨槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(quercetin-3-O-β-D-glucuronide,Q3GA)对游离脂肪酸诱导的人源肝癌细胞HepG2细胞脂质蓄积的甘油三酯调节和氧化应激的作用及其可能的相关机制。采用油红染色检测Q3GA对游离脂肪酸诱导的HepG2细胞中脂滴含量的影响,并同时检测其对甘油三酯和胆固醇的作用。DCFH-DA法检测Q3GA对HepG2细胞脂质蓄积引起的活性氧(ROS)的变化;硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法分别测定丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。RT-PCR分析脂肪酸氧化相关的基因过氧化物酶体增殖物受体(PPARα)、肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT1A)、中链酰基辅酶A脱氢酶(MCAD)、细胞色素P450 4A11(CYP4A11)、乙酰辅酶A氧化酶(ACO)的表达情况。实验结果显示,Q3GA可剂量依赖性降低FFA诱导的HepG2细胞脂质蓄积和甘油三酯的含量,但未降低胆固醇的含量。同时可改善脂肪酸氧化引起ROS,MDA的升高以及SOD的降低。另外,Q3GA在一定浓度下可上调脂肪酸β氧化相关基因PPARα、CPT1A、MCAD的表达,而对CYP4A11和ACO的表达没有促进作用。综上所述,Q3GA可抵抗脂肪酸氧化引发肝细胞的氧化应激损伤,保护HepG2细胞,降低游离脂肪酸诱导HepG2细胞脂质蓄积和甘油三酯的含量,其调节机制可能与其对HepG2细胞中游离脂肪酸氧化有关。     

干扰SREBP-1c对内质网应激状态下L02和HepG2肝细胞脂质沉积的影响

目的 构建SREBP-1c基因的miRNA真核表达载体,观察其对内质网应激状态下L02和HepG2肝细胞脂质沉积的影响.方法 设计并构建SREBP-1c基因的3个miRNA干扰载体,经测序鉴定miRNA载体构建成功后转染肝细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.Western blot检测转染后SREBP-1c的表达;甘油三酯测定和油红O染色检测细胞内脂质沉积;Western blot检测SREBP-1c下游脂代谢相关基因脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC1)的表达.结果 靶向干扰SREBP-1c的miRNA真核表达载体构建成功.Western blot结果显示,转染SREBP-1c-1miRNA和SREBP-1c-3miRNA载体后,L02和HepG2细胞内SREBP-1c蛋白水平表达均明显减低(P＜0.05),SREBP-1c-1miRNA的干扰效果最好(P＜0.05).与对照组相比,转染SREBP-1c-1miRNA载体后L02和HepG2肝细胞内甘油三酯含量均明显降低(P＜0.05),细胞内脂滴明显减少;FAS和ACC1蛋白的表达明显降低(P＜0.05).结论 SREBP-1c基因沉默通过FAS/ACC1降低了内质网应激状态下肝细胞脂质合成.     

厚朴酚对脂肪酸诱导HepG2细胞脂质积蓄的作用及机制研究

目的:研究藿朴夏苓汤中主要成分之一厚朴酚改善OA+PA诱导HepG2细胞脂质积蓄的作用及机制。方法:采用双荧光素酶报告基因活性分析筛选藿朴夏苓汤中各成分对CPT1α-luc荧光素酶活性的影响;采用分子对接研究厚朴酚与PPARα的相互作用;采用免疫荧光分析测定HepG2细胞的PPARα蛋白表达。将HepG2细胞分为对照组(DMSO)、模型组(OA+PA)、厚朴酚低、中、高剂量组(2.5,10,40μmol/L)和非诺贝特组(10μmol/L)。1 mmol/L的OA+PA处理HepG2细胞24 h构建脂质积蓄细胞模型,2.5,10,40μmol/L厚朴酚处理24 h。油红O染色观察脂滴聚集情况,采用全自动生化仪检测细胞内甘油三酯(TG)含量,使用实时荧光定量PCR检测与脂质合成、摄取和氧化分解相关基因的mRNA表达。结果:厚朴酚通过Cys276、Lys358、Thr279等氢键方式与PPARα的LBD进行分子-蛋白质相互作用,提高CPT1α-luc荧光素酶报告基因活性;厚朴酚通过促进PPARα核易位,提高PPARα和CPT1-α的mRNA表达水平。油红染色实验显示,与对照组比较,模型组中HepG2细胞内红色脂滴聚集和TG水平明显增加,模型组细胞内主要脂质合成和转运基因(FAS、CD36、FABP1和FATP2)的mRNA表达水平显著升高,而脂质氧化代谢基因(PPARα、CPT1-α和ACO)则显著降低(P0.01),差异有统计学意义。与模型组比较,厚朴酚中、高剂量组均可明显降低细胞内红色脂滴聚集和细胞内TG水平,抑制脂质合成和转运基因FAS、CD36、FABP1和FATP2的基因表达,而提高脂质氧化代谢基因PPARα、CPT1-α和ACO的表达(P0.05,P0.01),差异有统计学意义。PPARα敲减实验显示,与模型组比较,厚朴酚失去了降低细胞内红色脂滴聚集和细胞内TG水平,以及失去对脂质合成、转运和氧化代谢相关基因的调控作用,差异无统计学意义(P0.05)。结论:藿朴夏苓汤成分厚朴酚通过激动PPARα信号,提高脂质氧化分解作用,并降低脂质合成、摄取,从而减少HepG2细胞模型脂质蓄积。     

过氧化物酶体增殖物PGC-1α对肝缺血再灌注损伤的保护作用研究

目的 探讨过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)对肝缺血再灌注损伤的保护作用.方法 构建大鼠肝缺血再灌注损伤模型,恢复灌注后12 h,以蛋白免疫印迹(Western blot)检测PGC-1α表达情况,并检测肝脏活性氧、三磷酸腺苷(ATP)水平及血丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性变化,评估肝功能情况.另一方面,构建PGC-1α慢病毒过表达载体,并在大鼠缺血再灌注前转染,于缺血再灌注后,再以Western blot检测PGC-1α表达,肝脏活性氧、ATP水平和血肝酶活性变化,评估PGC-1α表达对肝缺血再灌注损伤的保护作用.结果 缺血再灌注肝脏PGC-1α表达较假手术组及对照组(未手术)明显降低(均P<0.05),同时肝脏活性氧族水平及ALT活性显著升高,而肝ATP产生减少(均P<0.05).PGC-1α慢病毒过表达载体转染显著上调缺血再灌注肝脏PGC-1α表达,同时肝脏活性氧族水平及ALT活性较未转染组显著降低,而肝ATP产生增加(均P<0.05).结论 PGC-1α表达有利于保护肝缺血再灌注损伤.     

不同葡萄糖浓度对INS-1细胞PPARδ表达的影响

目的 研究不同葡萄糖浓度对大鼠INS-1 细胞PPARδ表达的影响,以初步阐明PPARδ在胰岛细胞糖脂代谢关联中的作用.方法 分别用含3、11、20 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养基,培养INS-1细胞24 h后,冻融法裂解细胞,检测INS-1细胞内的甘油三酯水平.提取RNA和核蛋白,RT-PCR半定量检测PPARδ mRNA,Western blot 检测PPARδ蛋白表达.结果 随着葡萄糖浓度的升高INS-1细胞内甘油三酯含量增高,而PPARδ mRNA和蛋白的表达均明显降低.结论 葡萄糖促进,INS-1细胞内甘油三酯沉积,而PPARδ的表达下降可能是高糖条件下胰岛细胞脂质沉积的重要原因.     

慢病毒介导的FHIT基因过表达调控人肝癌细胞株生长实验研究

［摘要］目的　探讨过表达FHIT基因对FHIT基因含量不一致的人肝癌细胞株HepG2、Hep3B 和 Huh7的增殖、凋亡和细胞侵袭以及细胞周期的影响,以期证实FHIT基因在肝癌细胞株的表达差异与肝癌细胞的分化有密切相关性．方法　体外成功构建pLVX-IRES-FHIT慢病毒重组载体转染FHIT基因含量不一致的肝癌细胞株HepG2、Hep3B 和 Huh7,以MTT法、FCM法、Annexin V/PI双染色法、细胞周期检测技术和Transwell侵袭实验分析过表达的FHIT基因对三系肝癌细胞的增殖活性、凋亡、细胞侵袭性和细胞周期的影响机制及其生物学效应与时间梯度的关系．结果　体外成功构建重组慢病毒载体pLVX-IRES-FHIT转染FHIT含量不一致的肝癌细胞株HepG2、Hep3B 和 Huh7．（1）MTT法检测显示三系肝癌细胞株的pLVX-IRES-FHIT组细胞增殖活性明显降低,且随时间推移细胞增殖抑制效果更为显著,在48 h达到高峰,此后到72 h进入平台期,对照组细胞增殖抑制不明显（P＜0.05）．AnnexinV/PI双染色法检测发现pLVX-IRES-FHIT组三系肝癌细胞48 h凋亡率较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）．三系肝癌细胞中对pLVX-IRES-FHIT组转染致FHIT基因过表达抑制增殖活性大小的顺序依次是HepG2＞Hep3B＞Huh7;（2）经过Transwell侵袭实验表明对FHIT基因过表达对三系肝癌细胞的pLVX-IRES-FHIT组侵袭性均有明显的抑制作用（P＜0.05）,而对照组未见明显差异（P＞0.05）．三系肝癌细胞的侵袭性顺序依次为HepG2＞Hep3B＞Huh7;（3）细胞周期检测发现pLVX-IRES-FHIT组G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,增殖指数减低,在HepG2细胞中与对照组间有统计学意义（P＜0.05）,在HepB和Huh7细胞中与对照组间无统计学意义（P＞0.05）．FHIT基因的过表达对三系肝癌细胞的细胞周期影响为细胞周期停滞于S期,且G0/G1期细胞增多的顺序依次是HepG2＜Hep3B＜Huh7．结论　FHIT基因在肝癌细胞株中的表达差异可能与肝癌细胞的恶性分化有密切正相关性,FHIT基因有可能成为原发性肝癌的基因治疗的基因靶标之一．     

甲状腺滤泡性肿瘤中PPARγ和垂体肿瘤转化基因-1表达与临床意义

目的：研究PPARγ、PTTG在甲状腺滤泡性肿瘤中表达及其与病变的关系。方法：应用免疫组化方法检测42例甲状腺滤泡性肿瘤（腺癌19例,腺瘤23例）标本中PPARγ、PTTG表达。结果： PPARγ蛋白在腺癌与腺瘤表达无差异（P＞0.05）,PTTG在甲状腺癌表达高于腺瘤（P＜0.05）。甲状腺滤泡性癌中癌转移组与非转移组、高预后指数（≥65）组与低预后指数（＜65）组的PPARγ 及PTTG蛋白表达均具有统计学差异（p<0.05）。结论：检测PTTG水平对于鉴别原发性甲状腺滤泡肿瘤良恶性具有重要参考意义,PPARγ及PTTG表达水平可能是判断甲状腺滤泡癌预后的观测指标。     

The Different Expression of PPARγ in the Artery Tissues of Hypertensive Patients with Different Ages

Objective: To study the expression of the peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ) in the artery tissues of essential hypertensive patients, and the different changes with different ages, especially to the hypertensive patients more than 65 years old.Methods: Collected the mesenteric artery tissues of essential hypertensive patients( ＞65 years old group and ＜65 years old group)and patients with normal blood pressure,using immunohistochemical analysis and image acquiring and analysis system to detect the expression of PPARγ in the artery tissues. Results: the expression of PPARγ in the artery tissues of essential hypertensive patients is higher than that in the patients with normal blood pressure( P ＜ 0.05), and to the group of hypertensive patients, the expression of PPARγ in ＞ 65 years old group is higher than that in ＜ 65 years old group ( P ＜ 0.05). Conclusion: the expression of PPARγ in artery tissues is increased in hypertensive patients than in the patients with normal blood pressure, and increased with aging in hypertensive patients, suggesting that PPARγhas great relationship with hypertension.     

EB病毒对胃癌细胞增殖、凋亡和脂代谢的影响

【目的】探讨EB病毒（EBV）对胃癌细胞增殖、凋亡及脂代谢的影响,以揭示EB病毒相关胃癌（EBVaGC）发生发展的机制。【方法】将AGS和A kata细胞共培养建立EB病毒阳性的AGS-EBV细胞株,并比较AGS和AGS-EBV细胞增殖、凋亡和脂代谢的变化。使用CCK-8测定法检测细胞增殖活性,Annexin V PE/7-AAD凋亡染色和流式细胞术检测细胞凋亡。油红O染色观察胃癌细胞内脂滴的含量,并用相关脂质试剂盒检测游离脂肪酸、甘油三酯和总胆固醇的含量,qRT-PCR检测脂质合成关键酶的表达。【结果】EB病毒促进胃癌细胞株AGS细胞增殖（F=23.214,P=0.001;24、48、72、96和120h的P值分别为0.007、0.004、＜0.001、＜0.001和＜0.001）,抑制细胞凋亡（晚期和总凋亡率的P值分别为0.032和<0.001）,并可能通过上调脂质合成酶表达而使细胞内脂滴、游离脂肪酸（P<0.001）、甘油三酯（P=0.004）和总胆固醇（P<0.001）含量增加。【结论】EB病毒促进胃癌细胞增殖、抑制细胞凋亡,并增强细胞脂代谢。     

Rab32对小鼠肝细胞系AML12细胞内脂质代谢的影响

目的 探讨调控Rab32蛋白表达对小鼠AML12细胞内脂质代谢的影响.方法 常规培养AML12细胞,通过转染FCD-EYFP-Rab32慢病毒表达载体构建Rab32过表达细胞系(过表达组) ,利用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建Rab32敲除细胞系(敲除组) ,正常细胞设为对照组.Western blot检测各组细胞中Rab32蛋白表达水平;尼罗红染色后,激光共聚焦显微镜观测各组细胞内的脂滴数量和面积;定量试剂盒检测各组细胞内甘油三酯及总胆固醇水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平.结果 与对照组比较,过表达组AML12细胞中Rab32蛋白表达水平显著上调,而Rab32敲除组细胞中Rab32蛋白表达水平显著下调(P＜ 0.01);过表达组AML12细胞内脂滴数量[过表达组vs对照组: (21.91 ±14.32) vs (33.89 ± 17.31) ,P＜ 0.01]及面积[过表达组vs对照组: (16.82 ± 14.37) μm2 vs (22.27 ±14.10) μm2,P＜ 0.01]显著减少,每毫克蛋白甘油三酯[过表达组vs对照组: (104.03 ± 12.28) nmol vs(130.94 ± 4.21) nmol,P＜ 0.01]及胆固醇水平[过表达组vs对照组: (46.92 ± 1.26) μg vs (81.11 ±0.65) μg,P＜ 0.01]显著降低;而Rab32敲除组细胞内脂滴数量[(58.23 ± 42.28) ]及面积[(53.31 ±36.33) μm2]较对照组显著增加(P＜ 0.01) ,其每毫克蛋白甘油三酯[(159.03 ± 8.85) nmol]及胆固醇水平[(93.38 ± 3.33) μg]显著增高(P＜ 0.01) .3组细胞凋亡水平差异无统计学意义(P＞ 0.05) .结论 Rab32促进小鼠肝细胞AML12胞内脂质代谢.     

白藜芦醇对3T3-L1脂肪细胞线粒体生物合成的影响

目的通过研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对3T3-L1脂肪细胞线粒体生物合成的影响,探讨其在细胞能量代谢中的作用。方法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,分别设置对照组和10、20、40μmol/L的Res干预组,油红O染色观察细胞内脂质蓄积情况,透射电镜观察细胞内线粒体的数量和形态,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测线粒体合成过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子(peroxisome proliferato-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α)、含PR结构域的锌指蛋白16(PR domain-containing 16,PRDM16)的表达水平。结果 Res干预导致10、20、40μmol/L组细胞内的脂质蓄积量与对照组相比分别减少了10.7%、38.9%、62.9%(P均0.01);细胞内的线粒体数量增加,体积增大;细胞内PPARγ、PGC-1α、PRDM16蛋白表达水平增加。其中10μmol/L组PPARγ、PGC-1α的表达量为对照组的(1.91±0.38)、(1.59±0.10)倍(P0.01),20μmol/L组PPARγ、PGC-1α和PRDM16的表达量为对照组的(3.76±0.28)、(1.61±0.15)和(1.30±0.10)倍(P0.01),40μmol/L组PPARγ、PRDM16的表达量为对照组的(3.88±0.31)、(1.22±0.13)倍(P0.05)。结论 Res可能通过促进3T3-L1细胞线粒体的生物合成,减少其脂质蓄积,从而提升细胞能量代谢水平。     

SIRT1激动剂通过降低ACAT1表达抑制平滑肌泡沫细胞形成

目的 探讨沉默信息调节因子1 (silent mating type information regulation 2 homolog-1,SIRT1)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cell,VSMC)泡沫化的作用和相关的分子机制.方法 用组织贴块法体外培养原代VSMC,用80μg/mL ox-LDL刺激VSMC诱导泡沫细胞形成.检测SIRT1在ox-LDL刺激不同时间(24、48、72 h)的表达变化.SIRT1的活性调控分别应用SIRT1激动剂(SRT1720,SRT,1μmol/L)和抑制剂(nicotinamide,Nic,100 μmoL/L)进行干预.干预24 h后采用Western blot检测VSMC过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(A-cholesterol acyhransferase 1,ACAT1)的蛋白表达,干预48 h后采用油红O染色检测细胞内脂质沉积和泡沫细胞形成情况.应用PPARγ激动剂(Rosiglitazone,RSG,50 μmol/L)和抑制剂(GW9662,10 μmol/L)调控PPARγ的表达,Western blot检测VSMC中ACAT1的表达.结果 ①ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中,SIRT1蛋白表达在48 h降低约47％ (P ＜0.01);油红O染色显示,SRT可以抑制VSMC泡沫细胞形成,而Nic可逆转SRT的抑制作用;②ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中ACAT1的表达显著增加[(2.77±0.70),P＜0.01],SIRT1激动剂SRT可显著抑制ACAT1的表达[(0.90±0.27),P＜0.01],而SIRT1抑制剂Nic可阻断这一作用,升高ACAT1的表达[(2.25±0.37),P＜0.05];③ox-LDL诱导的VSMC泡沫细胞中PPARγ的表达减少[(0.73±0.12),P＜0.05],SIRT1激动剂SRT可上调VSMC中PPARγ的表达[(0.98±0.16),P＜0.05],SIRT1抑制剂Nic抑制PPARγ的表达[(0.47 ±0.13),P＜0.01];④PPARγγ激动剂RSG可抑制ACAT1的表达[(0.73±0.09),P＜0.01],而PPARγ抑制剂GW9662则上调ACAT1表达[(1.68±0.09),P＜0.01].结论 SIRT1通过上调VSMC中PPARγ表达而抑制ACAT1表达,从而抑制ox-LDL诱导的VSMC泡沫样变.     

吡格列酮保护乳鼠心肌细胞与ATP敏感性钾通道表达的关系

目的探讨吡格列酮对缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡和心肌细胞ATP敏感性钾通道亚单位表达的影响。方法原代培养的sD乳鼠心肌细胞随机分为6组：溶媒组、缺氧复氧组、0．1μmol／L吡格列酮组、1．0μmol／L吡格列酮组、2．0μmol／L吡格列酮组、2．0μmol／L吡格列酮＋GW9662组（GW9662组）,药物预处理24h后建立缺氧复氧模型,利用膜联蛋白-v与溴化丙啶双染法检测心肌细胞凋亡,利用RT—PCR及Western—blot技术检测心肌细胞ATP敏感性钾通道亚单位的表达。结果0．1、1．0、2．0μmol／L吡格列酮组心肌细胞凋亡率与缺氧复氧组及GW9662组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;0．1、1．0、2．0μmol／L吡格列酮组心肌细胞线粒体ATP敏感性钾通道（mitoKATP）亚单位Kir6．1mRNA及蛋白的表达与缺氧复氧组及GW9662组比较差异有统计学意义（P〈0．05）,各组细胞膜ATP敏感性钾通道（sarcKATP）亚单位Kir6．2mRNA表达间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论吡格列酮抑制缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡,此保护作用可能与激活PPARγ及上调mitoKATP通道亚单位表达有关,sarcKATP未参与这种保护过程。     

脂多糖诱导的小鼠急性呼吸窘迫综合征中microRNA-27a和PPARγ表达变化

目的 研究脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导小鼠急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)模型中外周血和肺内microRNA-27a和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPARγ)表达变化规律,探讨microRNA-27a和PPARγ在ARDS发病机制中的作用.方法 将50只8～10周雄性C57BL/6小鼠分为模型组不同给药时间(3、6、12、24 h各10只)和对照组(n=10).通过尾静脉注射LPS建立ARDS模型,通过组织学病理评价、炎症反应细胞分泌物表达水平等炎症反应指标评价ARDS模型建立的有效性.Western blot和免疫组织化学(IHC)观察模型不同时间点肺内PPARγ表达及变化趋势;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进一步研究基因表达改变情况.结果 与对照组相比,模型组不同时间点肺组织病理改变明显;外周血和肺内不同时间点microRNA-27a表达明显增加,外周血各时间点较变化对照组增加2～4倍,差异有统计学意义[3 h (3.53 ±0.89),6 h(1.97±0.40),12 h(1.87±0.35),24 h(1.98±0.53),P＜0.05]o与对照组相比,肺内microRNA-27a 6 h(3.08 ±0.97)、24 h(3.49 ±0.94)表达增加差异有统计学意义;3 h(1.90 ±0.87)、12 h(1.88 ±0.62)差异无意义.PPARγ在蛋白水平表达明显减少;基因水平上外周血PPARγ6、12 h表达降低差异有统计学意义[P ＜0.05,6 h(0.31 ±0.19),12 h(0.37 ±0.43)],3(0.70 ±0.33)、24 h(0.80 ±0.44)差异无统计学意义;肺内6、12、24 h表达降低差异有统计学意义[P ＜0.05,6 h(0.60±0.23),12 h(0.71 ±0.12),24 h(0.42±0.20)],3 h(0.67 ±0.36)差异无统计学意义.结论 LPS诱导小鼠ARDS模型中,microRNA-27a和PPARγ表达发生明显变化,二者可能参与ARDS发病过程.     

2型糖尿病大鼠骨髓腔内PPARγ和Cbfα1 mRNA的表达与骨折愈合障碍的关系

目的:探讨2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)和核心结合因子α1(core binding factor alpha 1,Cbfα1)表达的变化与2型糖尿病骨折愈合障碍之间的关系.方法:雄性SD大鼠随机分为对照组(n=15)和实验组(n=15)分别给予普通饲料、高糖高脂饲料喂养.8周后摘眼球取血,两组分别腹腔注射枸橼酸盐缓冲液和链脲佐菌素(STZ,35 mg/kg).2周后再次摘眼球取血,并建立大鼠左胫骨牵引成骨模型,牵引14 d后处死动物,收集血液及左胫骨,无菌分离双侧股骨.X线摄片比较两组胫骨牵引间隙内骨痂的形成情况.组织学观察牵引骨痂内微骨柱(MCF)与初始基质前沿(PMF)及骨折两端髓腔内脂肪细胞的形成情况,并计算骨折两端髓腔内脂肪细胞与骨髓腔面积百分比.RT-PCR法检测两组动物股骨骨髓腔内PPARγ和Cbfα1 mRNA的表达.结果:8周后实验组大鼠血清甘油三酯较对照组明显升高(P<0.01),血清总胆固醇较正常组升高(P<0.05),空腹血糖、血胰岛素水平无明显差异(P>0.05).10周后实验组大鼠空腹血糖、血清甘油三酯较对照组明显升高(P<0.01),血清总胆固醇较正常组升高(P<0.05),血胰岛素水平无明显差异(P>0.05),2型糖尿病大鼠模型建立.与对照组比较,2型糖尿病组大鼠X线摄片显示骨折断端之间牵引骨痂形成明显减少,骨痂组织学检查表现为MCF排列紊乱,PMF浅染;骨折两端髓腔内脂肪细胞及脂肪细胞占骨髓腔面积百分比明显增加(P<0.01);RT-PCR法检测显示双侧股骨骨髓腔内PPARγ mRNA表达上调(P<0.05), 而Cbfα1 mRNA的表达下调(P<0.05),而对照组则相反.2型糖尿病对早期骨折愈合表现为明显的抑制作用.结论:2型糖尿病大鼠骨折愈合障碍可能与2型糖尿病条件下骨髓腔内PPARγ mRNA表达增加而Cbfα1 mRNA的表达受抑制有关.