p75NTR敲除对小鼠股骨矿化发育的抑制作用

目的 对比野生型和p75 neurotrophin receptor(p75 NTR)敲除小鼠股骨骨质的改变,探讨p75 NTR敲除对小鼠股骨矿化发育的影响.方法 取同窝p75 NTR+/+(野生型)和p75 NTR-/-(敲除型)雄性小鼠,出生后8周龄时行股骨Micro-CT扫描,检测股骨松质骨的骨量(BV)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨表面积/骨量(BS/BV)、骨小梁分离度(Tb.Sp)和皮质骨的骨量(Ct.BV)、骨皮质厚度(Ct.TbTh)、骨皮质的骨表面积/骨量(Ct.BS/BV);出生后40 d分别取同窝两种基因型雄性小鼠行钙黄绿素荧光双标实验,以检测股骨的矿化沉积速率;提取4周龄大小鼠股骨总RNA及蛋白质,RT-PCR和Western blot检测ALP、Runx2的表达.结果 Micro-CT结果显示:p75 NTR--小鼠股骨的BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Ct.BV、Ct.TbTh明显低于同窝p75 NTR+/+小鼠(P＜0.05),同时,p75 NTR-/-小鼠的BS/BV、Tb.Sp、Ct.BS/BV明显高于p75 NTR+/+小鼠(P＜0.01);钙黄绿素荧光双标检测结果显示:p75 NTR-/-小鼠股骨的矿化速率明显低于同窝p75 NTR+/+小鼠(P＜0.01);RT-PCR及Western blot结果显示:p75 NTR--小鼠的ALP、Runx2表达均明显低于p75 NTR+/+小鼠(P＜0.01).结论 p75 NTR敲除对小鼠股骨的矿化发育有一定的抑制作用.     

中青年人股骨转子间区的骨密度及骨形态计量分析

目的 测定中青年人股骨近端转子间区的骨组织形态计量参数及骨密度( BMD)值,明确两者间的关系.方法 选取18～50岁新鲜尸体的股骨标本31个,男性组16个,女性组15个.应用双能X线吸收骨密度仪测量股骨颈、大转子及Ward氏三角区的BMD值.于标本的股骨近端转子间区按统一标准切取2 cm×1 cm×1 cm的骨柱,检测骨组织形态计量参数[骨小梁面积百分率(％Tb.Ar)、骨小梁宽度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁结点与游离末端比(N/F)],并对股骨大转子BMD值与各骨组织形态计量参数间的相关性进行分析.结果 两组股骨颈的BMD值均显著大于大转子及Ward氏三角区(P值均＜0.05).两组间各项骨组织形态计量参数的差异均无统计学意义(P值均＞0.05).男、女性组的股骨大转子BMD与％Tb.Ar(r值分别为0.818、0.803)、Tb.Th(r值分别为0.672、0.696)、Tb.N(r值分别为0.834、0.912)均呈正相关(P值均＜0.05),与Tb.Sp(r值分别为-0.656、-0.785)呈负相关(P值均＜0.05).结论 男女性中青年人股骨近端转子间区的骨组织形态计量参数无明显差异,股骨近端转子间区的BMD值及显微结构决定着骨质量,两者相辅相成,影响骨折的发生.     

Comparative study of the effect of exercise and estrogen on the bone mass and bone remodeling in ovariectomized rats

目的 对比分析运动及雌激素对去卵巢大鼠骨量和骨重建的影响,以探讨运动及激素在防治骨质疏松中的作用机制的异同及优缺点.方法 将48只5月龄雌佳Sparague Dawley(SD)大鼠随机分为基础对照(Basal)组、假手术(Sham)组、去卵巢(Ovx)组、去卵巢十雌激素(Ovx+e)组、去卵巢十运动(Ovx+ run)组及去卵巢十雌激素十运动(Ovx+ run+e)组.Ovx+e和Ovx十run+e组于去卵巢术后1周开始予己烯雌酚(0.025mg/kg)每日1次皮下注射,持续12周.Ovx+ run和Ovx+run+e组于去卵巢术后1周开始置于大鼠专用跑笼进行运动训练,跑速6.4 m/min,每日1次,持续12周.术后13周,对所有大鼠进行股骨骨密度(BMD)及骨组织计量学指标测定.结果 Ovx+e组的BMD显著高于Ovx组(P＜0.05),Ovx+ run组的BMD显著高于Ovx和Ovx+e组(P值均＜0.05),Ovx+ run+e组的BMD显著高于其他各组(P值均＜0.01).Ovx+e组的骨小梁面积百分率(％Tb.Ar)和骨小梁数量(Tb.N)显著高于Ovx组(P值均＜0.05),而骨小梁分离度(Tb.Sp)显著低于Ovx组(P＜0.01).Ovx+ run组的％Tb.Ar和Tb.N均显著高于Ovx组(P值均＜0.05),但显著低于其余各组(P值均＜0.05);Tb.Sp显著低于Ovx组(P＜0.01),但显著高于其余各组(P值均＜0.01).Ovx+ run+e组的％Tb.Ar和骨小梁厚度(Tb.Th)均显著高于各去卵巢组(P值均＜0.05),Tb.N均显著高于Ovx、Ovx+ run组(P值均＜0.05),而Tb.Sp均显著低于Ovx、Ovx+ run组(P值均＜0.01).Ovx+e组的周长百分率(％L.Pm)、骨小梁表面骨形成率(BFR/BS)、骨小梁总面积骨形成率(BFR/BV)、骨组织总面积骨形成率(BFR/TV)、骨小梁面积破骨细胞数(Oc.No)、骨小梁周长破骨细胞数(Oc.No/Pm)及骨矿化沉积率(MAR)均显著低于Ovx组(P值均＜0.05).Ovx+ run组的％L.Pm、BFR/BV均显著低于Ovx组(P值均＜0.01),而％L.Pm、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV、MAR、Oc.No和Oc.No/Pm均显著高于Ovx+e组(P值均＜0.01).Ovx+ run+e组的％L.Pm、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV均显著高于Ovx+e组(P值均＜0.01),而MAR、Oc.No、Oc.No/Pm均显著低于Ovx和Ovx+ run组(P值均＜0.001).骨组织形态图见Ovx+ run和Ovx+run+e组骨小梁排列较Ovx+e组整齐.结论 雌激素及运动均能使去卵巢大鼠骨量增加并抑制骨重建的高转换状态,雌激素抑制骨吸收和提高骨量的作用较运动更强,而运动更促进骨矿化沉积及骨形成,两者配合有协同作用.     

二仙汤对去卵巢大鼠骨质疏松的作用

目的:研究二仙汤对去卵巢大鼠骨质疏松症的作用.方法:去卵巢诱导大鼠骨质疏松症,12周后,取胫骨近端行不脱钙制片进行骨组织形态计量学分析;双能X射线骨密度仪测量股骨骨密度.结果:二仙汤能显著增加骨小梁面积百分比和骨小梁厚度(P＜0.01),减少骨小梁分离度(P＜0.05);增加骨形成参数:矿化沉积率(MAR)、骨形成率(BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV)(P＜0.05, P＜0.01);减少破骨细胞数(P＜0.01)且显著增加去卵巢大鼠股骨骨密度(P＜0.05).结论:二仙汤对去卵巢大鼠骨质疏松有保护作用,主要是通过促进骨形成、抑制骨吸收、提高骨密度.     

局部应用肉桂醛通过激活Nrf2通路促进糖尿病小鼠创口愈合

目的 探讨局部应用肉桂醛(cinnamic aldehyde,CA)对糖尿病小鼠创口愈合的影响及其机制.方法 8周龄Nrf2野生型(Nrf2+/+)和Nrf2敲除型(Nrf2-/-)雄性SKH-1无毛小鼠各8只,持续5d腹腔注射链脲霉素(streptozotocin,STZ,50 mg/kg),建立糖尿病小鼠模型.采用随机数字表法分为:①Nrf2+/+鼠对照组(Nrf2+/+Veh组);②Nrf2+/+鼠CA治疗组(Nrf2+/+ CA组);③Nrf2-/-鼠Veh组(Nrf2-/-Veh组);④Nrf2-/-鼠CA组(Nrf2-/-CA组)(n=4).STZ注射后第4周,在小鼠背部建立直径6 mm的全层皮肤切除创口.Nrf2+/+CA组和Nrf2-/-CA组术后当日开始局部应用20 μL含4μmol/LCA的聚乙二醇400(polyethylene glycol400,PEG400),每隔1天干预直至第14天,收集创缘处皮肤,Nrf2+/+Veh组和Nrf2-/-Veh组采用20 μL PEG400(Vehicle,Veh)局部应用作为空白对照.术后2周内每隔1天监测皮肤创口愈合面积评估愈合速率.免疫组化染色对比各组创缘处皮肤组织Nrf2蛋白、下游靶蛋白HO-1和氧化应激损伤相关指标8-oxo-dG的表达水平.结果局部应用CA明显加速Nrf2+/+糖尿病小鼠创口愈合(P＜0.05),但是并不影响Nrf2-/-糖尿病小鼠创口愈合(P＞0.05).免疫组化示Nrf2+/+糖尿病溃疡小鼠局部应用CA后,其创缘皮肤Nrf2的表达水平[(2.42±0.29) vs (7.42±0.73),P＜0.05]和下游靶蛋白HO-1的表达水平[(5.92 ±0.36) vs (8.88 ±0.53),P＜0.05]显著增强,8-oxo-dG的表达水平则明显减少[(9.46 ±0.28)vs(8.46 ±0.23),P＜0.05].Nrf2-/-糖尿病小鼠创口局部外用CA后,其创缘处皮肤Nrf2、HO-1及8-oxo-dG的表达水平与Nrf2-/-Veh组相比并无明显变化.结论 局部应用CA通过激活糖尿病小鼠皮肤组织Nrf2通路,减轻氧化应激损伤,从而促进糖尿病创口愈合.     

四连接素基因敲除小鼠表现出脊柱后凸畸形和骨质疏松症的特征

 目的  研究四连接素 (tetranectin,TN)基因敲除对小鼠骨骼生长发育的影响,从而探究该基因的正常生理功能及其缺失与疾病的关系。方法  通过基因同源重组的方法构建出TN基因敲除 (TN-/-)小鼠模型,分别对2月龄和8月龄的TN-/-雄性小鼠 (n=10)和同龄野生型(wild-type,WT)雄性小鼠 (n=10)进行全身正侧位X线摄片和脊柱后凸角度 (Cobb角)测量,并对8月龄TN-/-雄性小鼠 (n=10)和WT雄性小鼠 (n=10)的多部位骨骼进行骨密度 (bone mineral density,BMD)及骨矿含量 (bone mineral content,BMC)测定和病理切片检查,所得数据进行统计学分析。结果  TN-/-小鼠与同龄WT小鼠体质量无明显差异;2月龄及8月龄TN-/-小鼠Cobb角均较同龄WT小鼠显著增大 (P<0.01),且随月龄增加,Cobb角显著增大 (P<0.01);8月龄TN-/-小鼠的胸椎椎间盘结构不对称,外侧纤维环呈增大、疏松改变;与同龄WT小鼠相比,8月龄TN-/-小鼠全身、腰3椎体和左侧股骨BMD及BMC显著降低 (P<0.05),股骨及腰椎在组织学上也呈现出骨小梁变细、稀疏、排列紊乱或断裂等特点,且骨小梁成骨细胞减少,破骨细胞增多。结论  TN-/-小鼠表现出脊柱后凸畸形和骨质疏松症的特征,提示TN与骨骼的正常生长发育关系密切。TN-/-小鼠作为一种潜在的脊柱后凸畸形或骨质疏松症疾病动物模型具有重大的研究意义。     

低氧/低氧诱导因子-1α通路对成骨细胞与破骨细胞耦联的调控作用

目的 探讨低氧/低氧诱导因子(HIF) -1α通路对成骨细胞与破骨细胞耦联的调控作用.方法 取出生2～3d条件性基因敲除小鼠颅盖骨的成骨细胞与4～8周龄C57BL/6小鼠股骨破骨细胞的前体细胞,建立基因敲除小鼠成骨细胞与破骨细胞前体细胞共培养体系(野生型、HIF-1α-/-、Vhl-/-、HIF - 1α-/-/Vhl -/-共培养).采用RT-PCR技术检测成骨细胞中核因子κB受体活化因子配体(RANKL) mRNA和骨保护素(OPG) mRNA的表达以及破骨细胞中标志酶基因TRAP mRNA的表达,甲苯胺蓝染色观察破骨细胞溶骨形成的骨陷窝.结果 RT-PCR检测结果显示:与野生型共培养比较,HIF-1α-/-共培养的成骨细胞中RANKL mRNA表达上调、OPG mRNA表达下调(均P＜0.05),破骨细胞TRAP mRNA表达上调;Vhl-/-共培养和HIF-1α-/-/Vhl-/-共培养的成骨细胞中RANKL mRNA表达下调、OPG mRNA表达显著上调(均P＜0.05),破骨细胞TRAP mRNA表达下调;随着共培养时间的延长,成骨细胞中RANKL mRNA和OPG mRNA表达均逐渐减少,而破骨细胞TRAP mRNA表达均逐渐增加.甲苯胺蓝染色倒置显微镜观察显示:共培养第9天,破骨细胞骨吸收陷窝出现;随着共培养时间的延长,骨吸收陷窝面积和深度逐渐增加;与野生型共培养比较,HIF-1α-/-共培养的破骨细胞骨吸收陷窝较大且较深,Vhl-/-和HIF-1α-/-/Vhl-/-共培养的破骨细胞骨吸收陷窝较小且较浅.结论 低氧/HIF-1α通路激活后,成骨细胞抑制破骨细胞的分化功能;低氧/HIF-1α通路阻断后,成骨细胞促进破骨细胞的分化功能.     

催产素干预兔骨质疏松模型骨微结构变化规律的实验研究

目的 采用显微CT(Micro-CT)评估催产素(oxytocin, OT)干预骨质疏松(osteoporosis, OP)后的骨质及骨微结构时序变化规律。 方法 60只20周龄新西兰雌性大白兔随机分为对照组、OP模型组和OT干预组,每组20只。对照组施行假手术,OP组行双侧卵巢切除术(ovariectomy, OVX)。OT组在兔OVX术后第2周起,每天皮下注射催产素持续8周或至实验时间点为止,对照组和OP组则皮下注射生理盐水。三组分别在术后第0、4、8、10、12周处死,获取兔左后股骨上段行Micro-CT扫描,计测骨组织矿物质密度(tissue mineral density, TMD)和主要骨微结构参数,三组间结果进行比较、统计学分析。结果 OP组TMD、骨体积分数(bone volume fraction, BV/TV)、骨小梁数目(trabecular number, Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)从第8周开始较对照组明显降低(P＜0.05),骨结构模型指数(structure model index, SMI)、骨小梁间隙(trabecular space, Tb.Sp)则较对照组明显升高(P＜0.05)。OT组TMD直到第12周较对照组明显降低(P＜0.05),而BV/TV、Tb.N从第8周开始较OP组明显增加(P＜0.05),Tb.Th从第10周开始较OP组增加(P＜0.05),SMI、Tb.Sp从第8周开始较OP组明显降低(P＜0.05)。结论 OP模型兔早期活体OT干预可有效减缓骨质衰败程度,Micro-CT能动态观察其病理生理变化过程,OT可能是一种有效防治OP的药物。     

Akt3基因敲除对坐骨神经结扎小鼠痛行为学的影响

目的 探讨Akt3基因敲除对坐骨神经结扎小鼠神经病理性痛行为学的影响.方法 C57BL/6小鼠分为Akt3基因敲除组(Akt3-/-,n=12)和野生组(WT,n=12).随机编号后,在小鼠右侧制作坐骨神经慢性挤压(CCI)模型.观察术前1d,术后1,3,5,7,10,14,17,21 d小鼠机械缩足阈值(Pawwithdrawal mechanical threshold,PWMT)和热缩足潜伏期(Paw withdrawal thermal latency,PWTL).结果 两组小鼠基础PWMT[右侧:(1.09 ±0.20)g,(1.17±0.22)g;左侧:(1.17±0.15)g,(1.22±0.23)g,P＞0.05]和PWTL[右侧:(6.18±1.11)s,(6.20±1.25)s;左侧:(5.82±0.91)s,(5.92±1.71)s,P＞0.05]差异无统计学意义.术后1d,与基础值相比,Akt3-/-组和WT组小鼠右侧足PWMT和PWTL明显降低(P＜0.05),并持续到术后第21天.Akt3-/-组小鼠右侧足PWMT[第3天:(0.42±0.22)g,(0.72±0.36)g;第17天:(0.29±0.15)g,(0.49±0.19)g;第21天:(0.27±0.18)g,(0.56±0.15)g,P＜0.05]和PWTL[第5天:(2.43±0.68)s,(3.13±0.52)s;第17天:(2.43±1.26)s,(3.84±1.29)s;第21天:(2.14±1.23)s,(4.07±1.26)s,P＜0.05]明显低于WT组.Akt3-/-组左侧足PWMT和PWTL与WT组小鼠相比差异无统计学意义(P＞0.05).但是与左侧足相比,Akt3-/-组和WT组小鼠右侧足PWMT和PWTL均明显降低(P＜0.05).结论 Akt3基因敲除后,小鼠坐骨神经结扎诱发的神经病理性疼痛加重.     

ApoE基因敲除鼠骨量改变及其可能机制的初步研究

目的 观察ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠骨量的变化,并探讨其骨量变化的可能机制.方法 28周龄雄性ApoE-/-鼠6只和野生型C57BL/6J(WT)鼠10只,颈脱臼法处死动物,应用显微CT测定小鼠右侧股骨远端松质骨和皮质骨的骨微结构参数,采用双能X线吸收仪测定左侧股骨骨密度.应用ELISA方法测定血清中的护骨素(OPG)和核因子kB受体活化因子配基(RANKL)的水平.分离鼠左侧胫骨,脱钙后置4%多聚甲醛固定,用免疫组织化学染色SP法检测胫骨中OPG和RANKL的表达情况.结果 28周龄ApoE-/-鼠股骨松质骨体积骨密度(294±38)mg/mm~3、组织骨密度(627±23)mg/mm~3、骨矿含量(0.57±0.08)mg、骨体积分数(20.38±4.74)%、骨小梁数量(6.67±0.78)mm~(-1)、骨小梁厚度(0.03±0.01)mm明显高于WT鼠,而骨面积分数(69±18)mm~(-1)、骨小梁间隔(0.12±0.01)和结构模型指数(1.73±0.24)明显减低.DXA测定显示ApoE-/-鼠的总体骨密度[(0.063±0.004)g/cm~2],比WT鼠[(0.056±0.004)g/cm~2,P=0.01]增加了12.6%.ELISA结果显示ApoE-/-鼠OPG水平[(4.98±0.97)ng/ml]明显高于WT鼠[(3.54±0.65)ng/ml],而RANKL水平在两组鼠中无显著变化[(575±83)pg/ml比(591±87)pg/ml,P＞0.05],差异无统计学意义.但OPG表达水平明显增高.结论 OPG/RANKL比率失衡使得骨动态平衡被打破,骨吸收功能减弱可能是造成ApoE-/-鼠骨量增加的机制之一.     

LIGHT在低氧性肺动脉高压形成中的作用及机制

目的 初步探讨LIGHT在低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)形成中的作用及其机制.方法 将20只8周龄雌性C57BL/6J小鼠[体质量(17.90 ±0.91)g]和20只8周龄雌性LIGHT-/-C57BL/6J小鼠[体质量(17.55 ±0.93)g]分为4组(n=10):①野生小鼠常氧组(WT-C组)、②野生小鼠低氧组(WT-H组)、③LIGHT KO小鼠常氧组(LIGHT KO-C组)、④HGHT KO小鼠低氧组(LIGHT KO-H组).WT-H组和LIGHT KO-H组小鼠置于模拟6000 m低压舱内连续低氧饲养30 d,WT-C组和LIGHT KO-C组小鼠舱外(海拔308 m)常规饲养.检测右心室收缩压(right ventricular systolic pressure,RVSP)和右心肥厚指数(right ventricular hypertrophy index,RVHI);HE染色观察肺小动脉结构;免疫组化检测LIGHT及其受体HVEM、LTβR表达;荧光定量PCR和Western blot检测肺组织LIGHT、HVEM和LTβR、IL-6的mRNA和蛋白水平.流式细胞术检测肺组织中各类炎症细胞的比例.结果 与WT-C组相比,WT-H组肺组织中LIGHT的mRNA和蛋白水平均显著增高(P＜0.05),WT-H组RVSP和RVHI明显升高(P＜0.05),肺小动脉明显增厚;与HGHT KO-C组相比,LIGHT KO-H组小鼠的RVSP、RVHI和肺小动脉厚度显著增加(P＜0.05),但与WT-H组相比,LIGHTKO-H组的RVSP、RVHI和肺小动脉增厚程度明显降低(P＜0.05).与WT-C组相比,WT-H组LIGHT受体HVEM表达增加,LTβR表达降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).LIGHT KO-H组与WT-H组相比,肺组织IL-6mRNA和蛋白水平显著降低(P＜0.05).流式细胞检测发现,与WT-C组相比,WT-H组小鼠肺组织中单核细胞比例降低[(3.88±0.87)％ vs (11.03±1.71)％,P ＜0.05],间质巨噬细胞比例升高[(15.56±2.69)％ vs (8.57±2.17)％,P ＜0.05];与WT-H组相比,LIGHT KO-H组的肺组织单核细胞增加[(6.55±1.01)％ vs (3.88±0.87)％,P ＜0.05],而间质巨噬细胞的比例降低[(10.87±1.68)％vs.(15.56±2.69)％,P ＜0.05].结论 慢性低氧诱导肺组织中HGHT表达增加与HPH发病机制密切相关.LIGHT可能通过HVEM信号途径促进细胞增殖、上调肺组织IL-6表达、促进肺间质巨噬细胞产生,参与HPH的形成.     

表皮生长因子受体对小鼠初级软骨内骨化、破骨细胞的募集及生成的影响

目的：探讨表皮生长因子受体（EGFR）信号转导在软骨内骨化中的作用。 方法：以EGFR敲除鼠（EGFR-/-）、EGFR正常野生鼠 （EGFR+/+）和（或）杂合子鼠（EGFR+/-）为实验动物模型，通过马森三色染色（Trichrome Masson）、原位杂交及抗九石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察各组小鼠四肢长骨软骨内骨化及破骨细胞募集情况的变化；体外分离培养破骨细胞，加入EGFR酪氨酸激酶的抑制因子AG1478，通过对破骨细胞生成实验的观察，明确EGFR信号转导在破骨细胞中的作用。 结果：EGFR+/+鼠与EGFR+/-鼠有相同的表型，因此在实验中将它们皆看做EGFR+/+鼠。形态学观察EGFR-/-鼠肥大细胞区域较EGFR+/+鼠增大，其区域大小约为EGFR+/+鼠的5倍；EGFR-/-鼠破骨细胞向中心生长板的募集速度较EGFR+/+鼠亦明显延迟；在胚胎16.5 d（E16.5）dEGFR-/-和EGFR+/+鼠金属蛋白酶-9 （MMP-9） 分布上有一定差别，但单个破骨细胞上MMP-9的表达数量二者无明显差别；加入EGFR抑制因子AG1478的实验组与加入DMSO的对照组比较，破骨细胞的形成明显减少(P<0.01)。结论:EGFR信号转导机制可能通过调节破骨细胞的生成，影响其向中心生长板的募集，从而影响小鼠初级软骨内骨化的进展。     

慢性缺氧诱导小鼠心肌细胞自噬及其机制

目的 观察慢性缺氧对小鼠心肌细胞自噬水平的影响,并初步探讨AMPKα2敲除对该过程的作用.方法 采用野生型与AMPKα2-/-雄性C57小鼠均分为野生型常氧组、野生型缺氧组、敲除型常氧组和敲除型缺氧组(n=10).常氧组于空气环境中饲养,缺氧组于10％ O2的低氧舱内饲养.4周后野生型小鼠取静脉血标本,测红细胞及血红蛋白水平;取心脏标本用Western blot检测AMPKα2及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与p62的变化,用免疫荧光染色法检测心肌冰冻切片LC3变化.敲除型小鼠取心脏标本用Western blot检测心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值变化.结果 ①野生型小鼠中,与常氧组比较,缺氧组红细胞与血红蛋白水平显著增加[红细胞:(9.33 ±0.15)×1012/L vs(12.78±0.66)×1012/L,P ＜0.05;血红蛋白:(135 ±3)g/L vs (192 ±4)g/L,P＜0.05];②野生型小鼠中,与常氧组相比,缺氧组心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著增加[(0.49 ±0.29) vs(1.70 ±0.24),P＜0.05];p62表达明显降低[(1.32±0.57) vs (0.71 ±0.19),P＜0.05];免疫荧光结果显示,缺氧组心肌组织LC3荧光较常氧组增多;③在常氧条件下,与野生型小鼠比较,AMPKα2-/-小鼠心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,但差异无统计学意义[(0.78 ±0.08) vs (0.73 ±0.34),P＞0.05];在缺氧条件下,与野生型小鼠比较,AMPKα2-/-小鼠心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低[(2.08±0.72) vs (1.01 ±0.21),P＜0.05];④野生型小鼠中,与常氧组比较,缺氧组AMPKα2蛋白表达水平并无显著增加[(1.14±0.13) vs(1.25±0.19),P＞0.05].结论 慢性缺氧可能通过AMPKα2依赖的途径增强心肌细胞自噬,该自噬可能是心肌细胞对慢性缺氧的适应机制.     

高脂血症促进载脂蛋白E基因敲除小鼠牙周炎进展的实验研究

目的探讨高脂血症是否影响牙周炎进展。方法以ApoE基因敲除的C57BL/6J(ApoE-/-)小鼠和相同基因背景的野生型C57BL/6J(C57)小鼠各分为实验组和对照组,采用丝线结扎小鼠的上颌双侧第二磨牙,实验组接种牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis),对照组只完成牙周结扎过程而不接种细菌。用纸尖从牙周袋获取P.gingivalis进行菌落计数;截取上颌骨标本行亚甲基蓝染色,观察牙周组织损伤程度。结果普通饮食条件下,ApoE-/-小鼠血清脂质水平显著高于C57小鼠;实验第7d时实验组ApoE-/-小鼠牙周组织中获取的P.gingivalis菌落数为(8 341.66±1 217.88)个,显著高于C57小鼠(4 466.66±1 115.87)个(P<0.05);实验组ApoE-/-小鼠牙槽骨吸收量为(506.87±93.89)μm,显著高于C57小鼠(322.18±41.40)μm(P<0.05)。结论 ApoE-/-小鼠血清脂质水平升高,牙周清除P.gingivalis能力下降,牙周病进展加速。     

骨形态发生蛋白2在小鼠模型中诱导破骨细胞活化的机制

目的探讨骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）在诱导小鼠破骨细胞活化的作用以及相关的机制。方法选取20只小鼠,按照随机数字法分为对照组和实验组,每组10只,均接受小鼠脊柱后外侧入路的横突间融合手术,实验组植入骨片和BMP-2,对照组仅植入骨片,评估术后骨骼变化情况。在小鼠胫骨内提取骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages,BMMs）,应用RANKL及M-CSF试剂诱导为破骨细胞,并在其中加入不同浓度的BMP-2,应用TRAP染色法检测破骨细胞情况,荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）方法测定Smad1及p65基因,Western blotting法测定Smad1及p65蛋白表达情况。结果微型CT仪影像检查显示,实验组小鼠术后的脊柱融合情况强于对照组。2组小鼠术后1、2、4周骨小梁体积和骨小梁厚度均呈增高趋势,骨小梁间隙呈降低趋势,差异均具有统计学意义（P < 0.01）。实验组术后1、2、4周骨小梁体积高于对照组,实验组术后2、4周骨小梁间隙低于对照组（P < 0.01）。在BMP-2浓度为60、90及120 ng/mL时破骨细胞总数和总面积均高于BMP-2浓度为0、30 ng/mL时（P < 0.01）。Smad1及p65 mRNA表达在不同浓度BMP-2诱导破骨细胞比较差异均具有统计学意义（P < 0.01）,Smad1和p65 mRNA表达呈线性相关（P < 0.05）。结论BMP-2能够促进小鼠脊柱手术模型的融合,BMP-2参与了破骨细胞活化的过程,可能通过Smad1/p65信号通路介导破骨细胞活化。     

表皮生长因子受体的敲除对小鼠骨密度以及成骨细胞募集的影响

目的：探讨表皮生长因子受体（EGFR）信号转导系统在小鼠骨胳发育中的作用。 方法：以EGFR敲除鼠(EGFR-/-)为实验动物模型,通过马森三色染色（Masson Trichrome）、原位杂交技术,观察其子₁代胚胎鼠及新生鼠四肢长骨发育过程中松质骨的形成及成骨细胞募集的变化。 结果:形态学观察分析, EGFR-/-松质骨的形成较正常野生鼠(EGFR+/+)延迟,骨小梁较正常鼠减少;在胚胎发育第16.5天 (E16.5), 其成骨细胞向中心生长板的募集速度较EGFR+/+亦延迟; 形态学观察EGFR-/-和EGFR+/+核心结合因子A （Cbfa）、降钙素 （OC）及I 型胶原（Col I）在表达数量上有明显不同。结论:EGFR信号转导系统在在小鼠松质骨的形成过程中起着重要作用,其机制可能与调节成骨细胞向中心生长板的募集有关。     

TNF-α通过唾液酸化促进小鼠破骨细胞分化

目的 探究TNF-α促进破骨细胞分化的作用机制。方法 利用4月龄野生型小鼠与同龄TNF-α转基因鼠进行体内研究,分别收集双侧膝骨关节样本后,进行CT扫描分析骨量差异,TRAP染色及免疫荧光染色分析破骨细胞分化程度及唾液酸表达水平。体外培养破骨细胞前体细胞系RAW264.7分为3组：RAW对照组（不含药物的分化培养基处理）;RAW实验组（含有TNF-α的分化培养基处理）;RAW药物组（含有TNF-α和唾液酸酶的分化培养基处理）。体外培养3 d后进行qPCR检测,TRAP染色,唾液酸免疫荧光共定位染色分析。同时,分离培养野生型小鼠（BM对照组）和TNF-α转基因鼠[BM实验组（不含药物的分化培养基处理）,BM药物组（含有唾液酸酶的分化培养基处理）]原代骨髓源巨噬细胞,3 d后进行TRAP染色及唾液酸染色。结果 TRAP染色显示,TNF-α转基因鼠膝关节软骨下骨中破骨细胞数量较野生型小鼠显著增多（P<0.001）;其骨量/体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）则显著降低（P<0.001）;而TNF-α转基因鼠软骨下骨中唾液酸与TRAP荧光共定位阳性细胞数也显著高于野生型小鼠（P=0.004）。RAW实验组唾液酸表达平均荧光强度（P<0.001）及破骨细胞形成率（P<0.001）均显著高于RAW对照组,而RAW药物组唾液酸表达平均荧光强度、破骨细胞形成率以及TRAP基因转录水平显著低于RAW实验组（P<0.001）。BM实验组较BM对照组唾液酸表达平均荧光强度、破骨细胞形成率均显著提高（P<0.001）,而BM药物组较BM实验组唾液酸表达平均荧光强度、破骨细胞形成率均显著降低（P<0.001）。结论 TNF-α可通过提高破骨细胞的唾液酸化水平进而促进破骨细胞的分化和功能。     

Myostatin基因敲除对哺乳期幼鼠骨骼肌生长的影响

目的 构建稳定的肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因敲除小鼠模型,观察敲除MSTN基因对哺乳期幼鼠骨骼肌生长的影响,并初步探讨其相关机制.方法 采用Cre-LoxP系统建立MSTN基因敲除的小鼠模型,通过PCR法鉴定子代小鼠基因型;比较MSTN基因敲除后小鼠体质量及腿部骨骼肌质量的变化;免疫荧光法检测野生型小鼠与MSTN基因敲除小鼠腿部骨骼肌纤维横截面积;qPCR法检测MST基因敲除小鼠Atrogin-1和MuRF-1 mRNA的表达.结果 PCR结果显示:子代小鼠的基因型符合MSTN-loxP+/+MCK-Cre+/-;与野生型小鼠(WT)相比,MSTN敲除小鼠(KO)体质量及骨骼肌质量显著增加,在出生第7、21天差异均具有统计学意义(P＜0.05),腿部骨骼肌纤维显著增粗,差异具有统计学意义(P＜0.01);而MSTN基因敲除后小鼠Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表达较野生型小鼠显著降低,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 利用Cre-loxP系统成功建立稳定的MSTN基因敲除的小鼠模型,该小鼠腿部骨骼肌纤维增粗,其质量以及小鼠体质量显著增加,其机制可能与泛素连接酶Atrogin-1和MuRF-1的表达下调有关.