人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体（Ad-BMP-2/GFP）转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。     

仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原的制备及其细胞相容性

背景：目前骨组织工程常用的支架材料主要有无机材料、有机高分子材料及天然衍生材料等,上述材料各有优缺点,为了充分发挥各类材料的优势,弥补其不足,目前多采用联合材料制备复合支架。目的：制备新型仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原,并观察其对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及分化的影响。方法：制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合支架材料,扫描电镜观察支架材料表面微观形貌;采用真空吸附法将骨形态发生蛋白7多肽与支架材料复合,高效液相色谱仪检测骨形态发生蛋白7多肽在体外的释放规律;将骨髓间充质干细胞接种到复合骨形态发生蛋白7多肽的仿生支架材料上,以未复合多肽的支架材料作为对照,检测支架材料表面细胞增殖、黏附率、生长形态及碱性磷酸酶活性。结果与结论：壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原支架材料呈多孔状,孔径10~100μm;骨形态发生蛋白7多肽可以从支架材料中缓慢释出;在复合多肽的仿生支架材料表面,骨髓间充质干细胞的黏附及向成骨细胞方向分化能力均明显强于对照组（P〈0.05）,而增殖能力与对照组差异无显著性意义（P〉0.05）。说明新型仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原是一种理想的骨组织工程支架材料,具有良好的细胞相容性。     

仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原的制备及其细胞相容性

背景:目前骨组织工程常用的支架材料主要有无机材料、有机高分子材料及天然衍生材料等,上述材料各有优缺点,为了充分发挥各类材料的优势,弥补其不足,目前多采用联合材料制备复合支架。目的:制备新型仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原,并观察其对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及分化的影响。方法:制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合支架材料,扫描电镜观察支架材料表面微观形貌;采用真空吸附法将骨形态发生蛋白7多肽与支架材料复合,高效液相色谱仪检测骨形态发生蛋白7多肽在体外的释放规律;将骨髓间充质干细胞接种到复合骨形态发生蛋白7多肽的仿生支架材料上,以未复合多肽的支架材料作为对照,检测支架材料表面细胞增殖、黏附率、生长形态及碱性磷酸酶活性。结果与结论:壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原支架材料呈多孔状,孔径10~100μm;骨形态发生蛋白7多肽可以从支架材料中缓慢释出;在复合多肽的仿生支架材料表面,骨髓间充质干细胞的黏附及向成骨细胞方向分化能力均明显强于对照组(P<0.05),而增殖能力与对照组差异无显著性意义(P>0.05)。说明新型仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原是一种理想的骨组织工程支架材料,具有良好的细胞相容性。     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞

背景：骨髓间充质干细胞作为骨、软骨创伤缺损及退变修复的种子细胞越来越受到关注。目的：分析人骨形态发生蛋白2基因转染对白色封闭群大鼠（SD大鼠）骨髓间充质干细胞的影响。方法：分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞并体外扩增,通过腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞,分别通过荧光显微镜观察荧光表达情况及蛋白质水平来测定转染后人骨形态发生蛋白2的表达,碱性磷酸酶定量测定鉴定成骨活性及MTT法评估人骨形态发生蛋白2转染对骨髓间充质干细胞的影响。结果与结论：从SD大鼠骨髓提取物中分离培养的细胞形态为梭形,呈铺路石状、漩涡状生长,经流式细胞仪检测及多项分化能力鉴定符合骨髓间充质干细胞的特征;经转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞表达人骨形态发生蛋白2、碱性磷酸酶;MTT法检测转染人骨形态发生蛋白2基因后,骨髓间充质干细胞增殖能力明显增强（P〈0．05）。说明人骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞后可以持续、高效表达入骨形态发生蛋白2和碱性磷酸酶,在体外明显促进骨髓间充质干细胞的增殖。     

纳米晶胶原基骨修复材料与兔骨髓间充质干细胞体外复合培养

背景:纳米晶羟基磷灰石胶原基骨修复材料具有与天然骨成分接近,结构和形貌图谱分析与天然骨相似,生物相容性好等特点,且材料多孔,孔径较大、孔隙率及孔隙交通率高,符合作为骨组织工程支架材料的要求.目的:观察兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度.设计、时间及地点:体外观察实验,于2006-03/09在江苏大学医学院细胞实验室完成.材料:健康雄性新西兰大白兔1只,1月龄.纳米晶胶原基骨修复材料由清华大学材料系提供.方法:体外分离培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养.主要观察指标:①兔骨髓间充质干细胞生长形态及生长曲线.②复合培养5,10 d后扫描电镜观察二者复合程度.③复合培养5,10 d时纳米晶胶原基骨修复材料上结合的细胞数量.结果:兔骨髓间充质干细胞贴壁生长,增殖速度快,生长曲线符合Logistic生长曲线,兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养,在第5,10天进行扫描电镜观察,发现10 d时黏附于纳米晶胶原基骨上的骨髓间充质干细胞数明显高于5 d时黏附的细胞数,差异有显著性意义(P<0.01).结论:兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨体外复合培养结合程度较高.     

纳米羟基磷灰石复合骨形态发生蛋白2与骨髓基质干细胞的体外培养

背景：纳米级羟基磷灰石支架材料复合骨形态发生蛋白2因子组织构建模式组合后对骨髓基质干细胞的作用是叠加促进或抑制作用以及其生物相容性如何？目的：验证纳米羟基磷灰石复合骨形态发生蛋白2与骨髓基质干细胞在体外共同培养下的生物相容性和成骨性。方法：将兔骨髓基质干细胞体外培养、传代和扩增,经鉴定后将第3代细胞分别接种在对照组、骨形态发生蛋白2组、纳米羟基磷灰石组、纳米羟基磷灰石/骨形态发生蛋白2组4种培养液中。结果与结论：对照组和纳米羟基磷灰石组的细胞倍增时间较骨形态发生蛋白2组、纳米羟基磷灰石/骨形态发生蛋白2组两组长;骨形态发生蛋白2组和纳米羟基磷灰石/骨形态发生蛋白2组细胞增殖能力及碱性磷酸酶测量值明显大于对照组和纳米羟基磷灰石组（P〈0.01）。提示纳米羟基磷灰石复合骨形态发生蛋白2的组织构架不仅与骨髓基质干细胞之间具有良好的生物相容性,还可发挥骨形态发生蛋白2促进骨髓基质干细胞增殖和定向分化成骨的作用。     

纳米晶羟基磷灰石/胶原骨与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的黏附与生长有很重要的影响。利用纳米技术和三维造孔技术制备的纳米晶羟基磷灰石，胶原骨模仿了天然骨的成分与微结构特征。目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨的细胞相容性。设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-09／2006—12在江苏大学医学技术学院完成。材料；纳米晶羟基磷灰石，胶原骨由清华大学材料科学与工程系研制。人骨髓间充质干细胞由健康成年志愿者自愿捐献，受试者对实验内容知情同意。方法：全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞，应用成骨诱导剂（地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油、碱性成纤维细胞生长因子）诱导向成骨细胞表型转化。将第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨复合培养14d。主要观察指标：通过碱性磷酸酶组织化学染色、Von Kossa染色鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨上的生长情况。结果：原代培养的骨髓细胞增殖迅速，10～12d左右即可稳定传代，传代细胞7-9d即可传代。经诱导培养的细胞碱性磷酸酶组织化学染色阳性，Von Kossa染色阳性，可见钙化的基质沉积，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石／胶原骨共培养模型中，细胞可在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨表面良好贴壁。复合培养8d，分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。复合培养14d，大量细胞在材料表面和孔隙中生长，细胞之间广泛存在突起连接。结论：纳米晶羟基磷灰石肢原骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖，细胞相容性良好。     

pIRES-骨形态发生蛋白2质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的持续表达

背景:重组人骨形态发生蛋白2已被广泛应用于骨组织工程治疗骨缺损或骨不连,但是直接应用外源性骨形态发生蛋白2修复骨缺损效果不理想。目的:观察转染pIRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓间充质干细胞持续合成并分泌骨形态发生蛋白2的情况。方法:全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,脂质体介导下将真核表达质粒pIRES-骨形态发生蛋白2导入大鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论:ELISA结果显示,随着pIRES-骨形态发生蛋白2转染时间的延长,大鼠骨髓间充质干细胞分泌的骨形态发生蛋白2逐渐增多,至转染后10～12d达高峰,转染后15d,仍可见较多骨形态发生蛋白2的表达。说明转染pIRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓间充质干细胞可持续稳定分泌骨形态发生蛋白2。     

plRES-骨形态发生蛋白2质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的持续表达

背景：重组人骨形态发生蛋白2已被广泛应用于骨组织工程治疗骨缺损或骨不连,但是直接应用外源性骨形态发生蛋白2修复骨缺损效果不理想。目的：观察转染plRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓问充质干细胞持续合成并分泌骨形态发生蛋白2的情况。方法：全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,脂质体介导下将真核表达质粒plRES-骨形态发生蛋白2导入大鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论：ELISA结果显示,随着plRES-骨形态发生蛋白2转染时间的延长,大鼠骨髓问充质干细胞分泌的骨形态发生蛋白2逐渐增多,至转染后10-12d达高峰,转染后15d,仍可见较多骨形态发生蛋白2的表达。说明转染plRES-骨形态发生蛋白2的大鼠骨髓间充质干细胞可持续稳定分泌骨形态发生蛋白2。     

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞*

背景：骨形态发生蛋白2及转化生长因子β是骨再生中重要的因子,提高其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。目的：构建携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体,观察其在骨髓间充质干细胞中的表达情况。方法：应用重组慢病毒技术构建同时携带转化生长因子β3、骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒表达载体,并用其转染体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞,以转染携带转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2单一基因的慢病毒或单独慢病毒的骨髓间充质干细胞作为对照。转染后1周分别提取各组细胞的总RNA 和蛋白进行检测。结果与结论：荧光显微镜下见转染转化生长因子β3和(或)骨形态发生蛋白2基因3 d 的骨髓间充质干细胞发绿色荧光,转染效率达90%以上。RT-PCR 和 Western blot 结果显示,转染转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2 mRNA 和蛋白的表达均高于单一基因转染组及空白对照组。可见应用慢病毒可成功将转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞并实现其高效表达,且两种基因具有协同促表达作用。     

去抗原牛松质骨支架复合骨形态发生蛋白2基因在骨缺损修复过程中的血管化反应

背景：体外构建的组织工程骨是细胞与材料的复合体，再血管化是组织工程骨植入体内后关系其能否充分发挥成骨作用，有效修复骨缺损的关键环节。 目的：观察以去抗原牛松质骨支架复合骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）基因修复大段骨缺损过程中对血管化的影响。 设计、时间及地点：随机分组设计、对照动物实验，于2003—09／2004—12在吉林大学中日联谊医院中心实验室完成。 材料：选用清洁级新西兰大耳白兔60只。选取市售新鲜牛肱骨上端松质骨制备去抗原牛松质骨支架（Bovine Cancellous Bone，BCB）。携带人BMP-2和β-半乳糖酐酶基因的重组腺病毒（Ad-BMP-2和Ad—Lacz）及重组人BMP-2（rh-BMP-2）由美国Dr．Oliver及吉林大学病理教研室高航博士馈赠。 方法：新西兰大耳白兔60只分离培养兔骨髓基质干细胞，经BMP-2腺病毒载体转染后复合BCB移植修复兔双上肢桡骨1．5cm的缺损。按随机数字表法分为5组，每组12只，植入经不同处理的人工骨，Ad—BMP-2转染细胞＋BCB组，未转染细胞＋rh-BMP-2＋BCB组，Ad-Lacz转染细胞＋BCB组，未转染细胞＋BCB组，单纯BCB组。通过紧密缝合肌膜和筋膜固定移植骨。 主要观察指标：术后4，8，12周X射线检查观察骨缺损区的新骨形成情况，微血管墨汁灌注观察血管分布情况，透射电镜观察成骨细胞和血管生成情况，苏木精一伊红染色、爱辛蓝染色和VonKossa染色观察微血管与骨形成关系，血管内皮生长因子免疫组织化学染色测定染色灰度值、CD34免疫组织化学染色特异性标记血管内皮细胞，进行微血管计数。 结果：纳入兔60只均进入结果分析。X射线检查和组织学观察显示AD-BMP-2转染细胞＋BCB组和未转染细胞＋rh—BMP-2＋BCB组骨形成及血管生成情况优于其他3组。微血管墨汁灌注显示术后4周，两组每一个骨小梁孔隙中有一支新形成的小血管，骨间血管的密度在周边区域较高，随着向移植骨中央呈向心性减少。透射电镜观察，两组术后4周，可见较多功能活跃的成骨细胞及新生血管芽；术后12周，成熟的板层骨形成，新生血管结构完好。血管内皮生长因子表达检测和微血管计数测定显示AD—BMP-2转染细胞＋BCB组血管内皮生长因子相对含量明显高于其他各组，差异有显著性意义（P〈0．01）。微血管计数明显高于其他各组，差异有显著性意义（P〈0．01）。 结论：BMP-2基因可通过上调血管内皮生长因子表达，间接诱导移植骨血管化，比应用rh—BMP-2更有优势。     

Lentivirus-mediated gene transfer induces long-term transgene expression of BMP-2 in vitro and new bone formation in vivo.

We examined the potential of ex vivo gene therapy to enhance bone repair using lentiviral vectors encoding either enhanced green fluorescent protein (EGFP) as a reporter gene or bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) downstream of either the cytomegalovirus immediate early (CMV) promoter or the murine leukemia virus long terminal repeat (RhMLV) promoter derived from a murine retrovirus adapted to replicate in a rhesus macaque. In vitro, rat bone marrow stromal cells (BMSCs) transduced with Lenti-CMV-EGFP or Lenti-RhMLV-EGFP demonstrated over 90% transduction efficiency at 1 week and continued to demonstrate stable expression for 8 weeks. ELISA results demonstrated that lentivirus-mediated gene transfer into BMSCs induced stable BMP-2 production in vitro for 8 weeks. Increased EGFP and BMP-2 production was noted with the RhMLV promoter. In addition, we implanted BMSCs transduced with Lenti-RhMLV-BMP-2 into a muscle pouch in the hind limbs of severe combined immune deficient mice. Robust bone formation was noted in animals that received Lenti-RhMLV-BMP-2 cells at 3 weeks. These results demonstrate that lentiviral vectors expressing BMP-2 can induce long-term gene expression in vitro and new bone formation in vivo under the control of the RhMLV promoter. Prolonged gene expression may be advantageous when developing tissue engineering strategies to repair large bone defects.     

脂质体介导骨保护素基因转染大鼠骨髓基质干细胞及其表达

背景:基因修饰骨组织工程种子细胞,可提高对骨缺损的修复能力.目的:构建含有骨保护素的真核表达载体并检测转染骨髓基质干细胞后的表达.方法:取4周龄SD大鼠胫骨和股骨行骨髓基质干细胞的分离和培养,分为载体组、空载体组、对照组.空载体组转染plRES2-EGFP载体,载体组转染plRES2-EGFP-OPG.结果与结论:转染后激光扫描共聚焦显微镜观察可见骨髓基质干细胞内绿色荧光蛋白表达;RT-PCR检测结果可见质粒载体组在1 200 bp有明显条带,空载体组及对照组未见表达;免疫细胞化学检测骨髓基质干细胞内骨保护素蛋白呈阳性;MTT法检测各组细胞增殖活力无明显改变(P > 0.05).证实应用plRES2-EGFP-骨保护素质粒转染大鼠骨髓基质干细胞,可获得外源性骨保护素的基因及蛋白表达.     

转染血管内皮细胞生长因子骨髓间充质干细胞与牛松质骨支架复合组织工程骨的血管形成

背景:小块组织工程骨植入动物体内后,早期依靠组织液的渗透可获得营养,但大块组织工程骨的营养仅靠组织液的渗透是远远不够的,必须通过血管再生来获得。目的:观察转染血管内皮细胞生长因子表达载体骨髓间充质干细胞复合组织工程骨植入动物体内后的血管形成能力。方法:制作日本大耳白兔双侧尺骨中段骨缺损模型,左侧尺骨缺损植入转染血管内皮细胞生长因子表达载体的自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为实验组,右侧尺骨缺损植入自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为对照组。术后12周行X射线摄片观察、大体标本观察、苏木精-伊红染色和Masson染色组织切片观察、MiFas图像分析系统定量分析。结果与结论:实验组与对照组尺骨缺损处均有连续骨痂形成;组织切片经苏木精-伊红染色、Masson三色法染色及MiFas图像分析系统定量分析可见实验组和对照组均有大量的新生骨,但实验组新生血管明显多于对照组(P<0.01),且血管较粗大,而且与新生骨接近。说明将转染血管内皮细胞生长因子表达载体的骨髓间充质干细胞复合在组织工程骨上植入动物体内可明显促进新生血管的形成。     

不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响

背景:骨髓间充质干细胞常被用作骨组织工程的种子细胞和基因治疗的载体细胞,如何获得纯度较高活性较好的骨髓间充质干细胞是很多研究者关心的问题.目的:观察不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响.方法:分别用密度梯度离心法、全骨髓培养法和红细胞裂解液法提取兔骨髓间充质干细胞,48 h后观察各组获得的细胞量,记录各组首次传代时间,相差显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪鉴定其CD44抗原表达.分别用DMEM-LG、MEM-HG和DMEM/F12 3种培养基培养第3代细胞和第7代老化细胞,MTT法和计数板计数法比较不同时间点3种培养基培养细胞的生长情况,相差显微镜观察老化细胞的形态变化.结果与结论:3种分离方法均能得到较均一的梭形或者多角形贴壁细胞,胞核大胞浆丰富,CD44抗原表达阳性.其中红细胞裂解液法获得的贴壁细胞的量较其他方法多,首次传代时间短(P＜0.05).用DMEM/F12培养的细胞活力更好,细胞生长更迅速,并且经过DMEM/F12培养一段时间后,部分静止期细胞开始分裂增殖.提示红细胞裂解液法能够提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,是一种方便、有效的提取方法;DMEM/F12更能够促进细胞的增殖,较适合于培养骨髓间充质干细胞.     

应用细胞片层技术构建组织工程骨

背景:传统的骨组织工程学在收获和转移细胞方面仍存在诸多不足,细胞片层技术是收获种子细胞和对种子细胞进行转移的一项新技术.目的:应用细胞片层技术与传统骨组织工程相结合的方法构建组织工程骨.方法:密度梯度离心法分离培养犬骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞分化.将诱导后的骨髓间充质干细胞接种至温度反应性培养皿中,先37 ℃饱和湿度培养,然后降温至20 ℃制备细胞片层;将犬脱钙骨基质/富血小板血浆/骨髓间充质干细胞细胞片层/骨髓间充质干细胞复合体植入犬左侧背阔肌下,术后4,8,12周,观察成骨情况.结果与结论:当温度降至20 ℃时,骨髓间充质干细胞从温度反应性培养皿上完全脱落,形成细胞片层,将其覆盖于犬脱钙骨基质/富血小板血浆/骨髓间充质干细胞后植入犬背阔肌下,其成骨效果明显好于不加细胞片层对照侧.说明应用细胞片层技术与传统的骨组织工程方法相结合可构建出较理想的组织工程骨.     

pcDNA3.1-bFGF真核表达载体的构建及其在犬骨髓基质干细胞中的表达

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs)后的表达情况,并进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法:提取国人脑胶质瘤细胞BT325总RNA,RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段,构建重组载体pcDNA3.1-bFGF,重组载体经脂质体介导转染犬BMSCs,半定量RT-PCR及Western blot检测表达。结果:重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。bFGF在犬BMSCs中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-bFGF,此重组载体在犬BMSCs中能够表达。     

BMP-2重组质粒转染骨髓间充质干细胞及表达的检测

目的 pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞,并检测其在靶细胞中的表达。方法脂质体将pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒转染入BMSCs,荧光显微镜下观察绿色荧光,计算转染率,利用ELLISA法检测目的基因在靶细胞中的表达,免疫组化染色检测成骨特异性生化指标(I型胶原、ALP及骨钙素)。结果本实验成功的利用脂质体将质粒转染入BMSCs,目的基因可以持续高表达,并促进细胞向成骨方向分化。结论为进一步利用BMP-2基因修饰组强Ⅰ程骨促进成骨提供实验基础。     

A study of the role of nell-1 gene modified goat bone marrow stromal cells in promoting new bone formation.

Nell-1 is a recently discovered secreted protein with the capacity to promote osteoblastic calvarial cell differentiation and mineralization and induce calvarial bone overgrowth and regeneration in various rodent models. However, the extent of Nell-1 osteoinductivity in large animal cells remains unknown. The objective of the study was to evaluate the feasibility of adenoviral encoding Nell-1 (AdNell-1) gene transfer into primary adult goat bone marrow stromal cells (BMSCs) in vitro and in vivo and to compare the osteoinductive effects with those produced by bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), a well established osteoinductive molecule currently utilized for regional gene therapy. AdNell-1-transduced BMSCs expressed Nell-1 protein and underwent osteoblastic differentiation within 2 weeks in vitro, which is comparable to AdBMP-2. After intramuscular injection of nude mice, the AdNell-1- and AdBMP-2-transduced BMSCs revealed new bone formation, while untransduced or AdLacZ-transduced BMSCs showed mainly fibrotic tissue proliferation. At 4 weeks, BMP-2 induced significantly larger bone mass with a mature bone margin and central cavity filled with primarily fatty marrow tissue. Nell-1 samples had significantly less bone mass but were histologically similar to newly formed trabecular bone mixed with chondroid bone-like areas verified by type X collagen (ColX) immunohistochemistry. This distinct difference in histomorphology from the bone mass induced by BMP-2 suggests that there is a potential clinical role/advantage for Nell-1 in skeletal tissue engineering and regeneration.