结核分枝杆菌天然黏附素HBHA的制备及其检测应用

目的探讨HBHA在ELISA检测结核病方面的应用。方法将BCG培养至稳定生长期将其苏通培养基上清通过CL-6B层折柱．利用含NaCL的PBS溶液梯度洗脱得到天然HBHA．然后以纯化的天然HBHA蛋白和原核表达的HBHA蛋白为包被抗原分别对肺结核组、肺外结核组、PPD阳性和PPD阴性健康对照组血清各47例进行ELISA检测抗HBHA抗体水平。结果在进行梯度洗脱时含有375mMNaCL的PBS洗脱液可以获得较纯的天然HBHA蛋白。ELISA检测结果表明肺结核组和肺外结核组的血清抗体水平高于PPD阳性和PPD阴性健康对照组（x^2=36．48，P〈0．01），肺结核组和肺外结核组之间（x^2=0.27。P〉0．05）、PPD阳性和PPD阴性健康对照组之间（x^2=0．30，P〉0.05）血清抗体水平没有显著差异。结论利用天然HBHA蛋白和重组HBHA蛋白进行ELISA结核病诊断都具有较高的特异性和敏感性，可以较好地用于结核病的诊断。以天然HBHA为基础的血清学诊断方法具有更好的敏感性和特异性。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素在结核病免疫应答中的研究

目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝素的免疫应答作用及其在结核病诊断中的应用价值。方法选取PPD（-）的健康对照、PPD（＋）的潜伏感染者、肺结核患者,分离入选者的外周血单个核细胞,用天然HBHA刺激,培养4天后收集细胞培养上清,ELISA方法检测上清中的γ-干扰素（IFN-γ）。同时用ELISA方法检测各组血清中的HBHA特异的IgG型抗体。结果HBFIA刺激后三组产生的IFN—γ中位数分别为：49．5pg／ml、781．9pg／ml、341．8pg／ml,潜伏感染者产生的IFN-γ水平远高于健康对照,略高于肺结核。三组血清IgG抗体浓度吸光度的均值分别为0．212±0．066,0．224±0．076,0．285±0．078。肺结核患者的HBHA特异的IgG抗体远高于健康对照及潜伏感染者。结论HBHA有较好的免疫原性,HBHA特异的IFN—γ释放反应有利于鉴别潜伏感染者。HBHA的抗体水平在结核病的诊断中有一定的辅助应用价值。     

结核分枝杆菌特异性蛋白抗体检测在结核病诊断中的价值

目的研究结核分枝杆菌特异性蛋白（TB-SA）抗体检测在结核病诊断中的价值。方法对829例结核病患者（男471例，女358例）、278例非结核性肺部疾病患者（男172例，女106例）和125例健康志愿者（男51例，女74例）同时进行结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）试验，结核分枝杆菌TB-SA抗体检测，并对全部肺结核和非结核性肺部疾病患者进行痰抗酸杆菌涂片和培养。采用EPl2000统计软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，计数资料采用X^2检验。结果结核分枝杆菌TB-SA抗体检测诊断菌阳肺结核的敏感度为75．1％（272／362）；诊断菌阴肺结核的敏感度为68．9％（226／328）；诊断肺外结核病的敏感度为71，2％（99／139）；诊断结核病的总体敏感度为72．0％（597／829），特异度为82．1％（331／403）。TB-SA血清抗体检测值并不与PPD值呈线性关系，即结核分枝杆菌TB-SA抗体检测诊断结核病不受卡介苗接种反应的影响。结论结核分枝杆菌TB-SA抗体检测诊断结核病有较好的敏感度和特异度，是辅助诊断和鉴别诊断结核病的有效手段。     

结核分枝杆菌黏附素HBHA的克隆表达及其免疫原性研究

目的应用克隆表达技术从大肠杆菌中获得重组的结核分枝杆菌黏附素HBHA蛋白，并以重组HBHA免疫小鼠观察抗HBHA抗体的产生并探讨其免疫原性。方法①应用PCR技术扩增结核分枝杆菌hbhA编码基因的特异片段。②结核分枝杆菌hbhA编码基因的克隆及在大肠杆菌中的表达。③应用克隆表达的HBHA蛋白免疫小鼠，并用ELISA法测定小鼠血清抗HBHA抗体水平。结果①结核分枝杆菌hbhA基因成功地克隆到PET-32a（＋）表达载体中，并在大肠杆菌中获得了高效表达。重组HBHA主要存在于包涵体中，纯化包涵体并获得了大量的重组HBHA。②重组HBHA免疫小鼠可产生较高水平的抗HBHA抗体（〉1：102400），这表明重组HBHA在纯化过程中仍保留较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌黏附素HBHA具有较好的免疫原性。     

结核分枝杆菌TB—SA抗体检测在结核病诊断中价值的研究

目的研究结核分枝杆菌TB—SA抗体检测在结核病诊断中的价值。方法对1232例结核病、非结核病的其他呼吸系统疾患患者及健康志愿者同日寸进行抗酸杆菌涂片、培养、PPD皮试及结核分枝杆菌TB—SA抗体检测。结果①结核分枝杆菌TB—SA抗体检测菌阳肺结核的敏感性为75．1％；菌阴肺结核的敏感性为68．9％；肺外结核病的敏感性为71．2％；诊断结核病的总体敏感性为72．0％，特异性为82．1％。②TB—SA血清抗体检测OD405值并不与PPD值成线性关系，结核分枝杆菌TB—SA抗体检测对结核病人的诊断不受患者卡介苗反应的影响。结论结核分枝杆菌TB—SA抗体检测诊断结核病有较好的敏感性和特异性，是结核病诊断和鉴别诊断的可靠手段。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素与纯蛋白衍化物的细胞免疫作用比较

目的通过结核分枝杆菌肝素结合血凝素（HBHA）与纯蛋白衍化物（PPD）的免疫作用比较,探讨HBHA的免疫保护作用及诊断应用价值。方法选取阴性对照者、潜伏感染者、肺结核患者,分离入选者的外周血单个核细胞,分为无刺激、HBHA、PPD刺激组,培养4d后收集细胞培养上清,ELISA方法检测上清中的γ-干扰素（IFN-γ）和白介素4（IL-4）。结果HBHA刺激后3组产生的IFN—γ中位数分别为：49．5ng／ml、781．9ng／ml、341．8ng/ml,潜伏感染者产生的IFN-γ水平远高于阴性对照组,略高于肺结核组,HBHA特异的IFN-γ在不同治疗时间肺结核之间有显著差异。结论HBHA有较好的免疫原性,可以刺激潜伏感染者产生高水平的IFN-γ,潜伏感染者未发展为活动性结核病可能与HBHA的免疫保护作用有关,HBHA特异的IFN-γ释放反应有利于鉴别潜伏感染者。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素在肺结核及肺外结核中的免疫作用研究

目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素（heparin-binding hemagglutinin adhesin, HBHA）在不同结核感染状态人群中免疫反应及可能的诊断价值。 方法用天然的HBHA刺激选取阴性对照、潜伏感染者、肺结核和肺外结核患者,分离外周血单个核细胞,加入共培养,收集细胞培养上清,ELISA方法检测上清中IFN-γ的浓度,运用非参数检验的方法统计分析。结果4组HBHA特异的IFN-γ分泌水平分别为49.5、781.9、341.8、214.4pg/ml,潜伏感染者组远高于其他各组,HBHA 刺激后肺结核和肺外结核之间的IFN-γ分泌水平无统计学差异（U＝1901.5,P＝0.448）。结论HBHA特异的IFN-γ分泌水平,有利于鉴别健康人群中的潜伏感染者,HBHA可能具有一定的免疫保护作用,尽管HBHA与肺外结核发病相关,其特异的细胞免疫在肺结核和肺外结核间无统计学差异。     

重组结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合蛋白的制备及应用研究

目的 制备重组培养滤液蛋白10和6000早期分泌性抗原靶的融合蛋白(rCFPlO-ESAT-6)，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 用基因拼接(Gene SOEing)法扩增lhp-ESAT-6融合基因、并克隆人pQE30质粒，表达、纯化rCFPl0-ESAT-6蛋白，通过Western blot分析其抗原性。建立豚鼠BCG免疫模型和结核分枝杆菌强毒株(H37Rv)感染模型，建立以融合蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)法，检测豚鼠血清中的抗结核分枝杆菌抗体，并与以纯化蛋白衍生物(PPD)为抗原的ELISA法比较。结果 重组质粒pQE30-CFPl0-ESAT-6靶基因的测序结果与预计序列(lhp-linker-ESAT-6)完全一致。融合蛋白在DH5α菌中以可溶性非包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的40％，分子质量为26000，纯化后的蛋白纯度为98％，浓度为1.2g／L。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患血清、兔抗CFP10血清和兔抗ESAT-6血清都能发生特异性免疫反应。以10只生理盐水处理豚鼠血清的平均吸光度(A)值 2s为正常界限值，以融合蛋白为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清仅1份呈阳性反应；以PPD为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清也全部呈阳性反应。结论 pQE30-CFPl0-ESAT-6 DH5α菌能高效表达rCFPl0-ESAT-6融合蛋白，该蛋白兼具CFPl0和ESAT-6两种蛋白的抗原性，能特异性区分豚鼠因H37Rv感染和BCG免疫后产生的抗结核分枝杆菌抗体。本研究为rCFPl0-ESAT-6融合蛋白在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素与纯蛋白衍化物的细胞免疫作用比较

目的 通过结核分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)与纯蛋白衍化物(PPD)的免疫作用比较,探讨HBHA的免疫保护作用及诊断应用价值.方法 选取阴性对照者、潜伏感染者、肺结核患者,分离入选者的外周血单个核细胞,分为无刺激、HBHA、PPD刺激组,培养4 d后收集细胞培养上清,ELISA方法检测上清中的γ-干扰素(IFN-γ)和白介素4.结果 HBHA刺激后3组产生的IFN-γ中位数分别为49.5 ng/L、781.9 ng/L、341.8 ng/L,潜伏感染者产生的IFN-γ水平远高于阴性对照者,略高于肺结核患者.HBHA特异的IFN-γ在不同治疗时间肺结核之间有显著差异.结论 HBHA有较好的免疫原性,可以刺激潜伏感染者产生高水平的IFN-γ,潜伏感染者未发展为活动性结核病可能与HBHA的免疫保护作用有关.HBHA特异的IFN-γ释放反应有利于鉴别潜伏感染者.     

结核分枝杆菌MPT64蛋白适配子的筛选与鉴定

目的 利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子,寻找早期诊断结核病的方法.方法 体外合成随机单链DNA(ssDNA)文库,以MPT64蛋白为靶物质,采取SELEX技术进行12轮筛选,将适配子库克隆、测序后,用DNAMAN软件对其结构进行分析,经生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力,并利用捕获适配子与检测适配子组成的"三明治"夹心法对获得的适配子进行初步验证.将13个非结核分枝杆菌菌株和BCG菌株作为阴性组计为0,将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌组作为阳性组计为1,采用MedCalc软件分析受试者操作特征曲线,确定最佳阳性判定值,并构建散点图.结果 经12轮筛选后,随机挑选15个适配子与MPT64蛋白的亲和性进行分析,吸光度值为0.492～1.243,73.3％的适配子的吸光度值在1.0以上;二级结构分析显示,适配子与MPT64蛋白亲和性的基础主要是大口袋茎环结构,口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC碱基对;"三明治"夹心法对阴性组[非结核分枝杆菌标准菌株及卡介苗(BCG)株]和阳性组(结核分枝杆菌实验室H37Rv株及临床株、牛结核分枝杆菌标准株)共47个菌株培养上清的检测结果显示,在临界(cut-off)值为0.61时,H37Rv、牛结核分枝杆菌组为阳性,BCG株为阴性;阴性组标本的阴性检出率为85.7％,阳性组标本的阳性检出率为87.9％,表现出一定的检测价值.结论 已初步筛选到与MPT64蛋白具有高亲和性的DNA适配子.     

酶联免疫斑点试验在菌阴肺结核诊断中的价值

目的探讨酶联免疫斑点检测技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)(T-SPOT.TB)在菌阴肺结核诊断中的应用价值。方法应用T-SPOT.TB试剂盒对55例菌阴肺结核(A组)和36例其他肺部疾病(B组)患者的外周血中Mtb特异性T淋巴细胞进行检测,同时对两组患者进行PPD试验、血清结核抗体(Mtb-AB)检测。结果A组T-SPOT.TB的阳性率为89.1%(49/55),要明显高于B组的19.4%(7/36)(χ2=44.59,P<0.001)。在A组,T-SPOT.TB的阳性率要明显高于PPD试验[36.4%(20/55)]、Mtb-AB[52.7%(29/55)]及PPD试验+Mtb-AB的阳性率[23.6%(13/55)],(χ2=12.13,χ2=7.08,χ2=21.54,P值均<0.01)。T-SPOT.TB在B组中的阴性率为80.6%(29/36),较PPD试验[86.1%(31/36)]及Mtb-AB阴性(63.9%,23/36)和PPD+Mtb-AB检测方法的阴性率[88.9%(32/36)]经检验,差异无统计学意义(χ2=0.39,χ2=2.69,χ2=0.41,P值均>0.05)。结论T-SPOT.TB检测特异度和敏感度要优于PPD试验及Mtb-AB的检测,可用于菌阴肺结核的辅助诊断,具有一定的临床推广使用的价值。     

脂阿拉伯甘露糖抗体检测对AIDS合并肺结核患者的诊断价值

目的 探讨脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomanna,LAM)抗体检测在获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)合并肺结核患者中的诊断价值.方法 收集我院2013年3月至2016年3月就诊的AIDS感染肺结核患者38例(研究组)及无肺结核的AIDS患者38例(对照组),对两组患者均进行LAM抗体检测及PPD试验,比较两组患者LAM抗体阳性率及PPD阳性率.同时对所有患者行CD4+T淋巴细胞计数.根据CD4+T淋巴细胞计数,将研究组患者进一步分为CD4+T淋巴细胞≥200/μl组和CD4+T淋巴细胞＜200/μl组,比较两组患者LAM抗体阳性率及PPD阳性率.比较LAM抗体检测及PPD试验对AIDS合并肺结核的诊断价值.结果 研究组患者LAM抗体检测阳性率为84.2％,对照组LAM抗体检测阳性率为l0.5％,两组患者比较差异有统计学意义(P＜0.05).研究组患者PPD阳性率为42.1％较对照组(23.7％)高,但差异无统计学意义(P＞0.05).CD4+T淋巴细胞≥200/μl组患者LAM抗体阳性率92.9％,较CD4+T淋巴细胞＜200/μl组(79.2％)高,但差异无统计学意义(P＞0.05).CD4+T淋巴细胞≥200/μl组患者PPD阳性率为92.9％,较CD4+T淋巴细胞＜200/μl组(12.5％)高,且差异有统计学意义(P＜0.05).LAM抗体检测诊断AIDS合并肺结核的敏感度为84.2％,特异度为89.5％,阳性预测值为94.1％、阴性预测值为85.7％、阳性似然比为15.9、阴性似然比为0.17.LAM抗体诊断AIDS合并肺结核阳性似然比＞10,即表示LAM抗体诊断AIDS合并肺结核的可能性显著增加.结论 LAM抗体检测在AIDS患者合并肺结核的诊断中特异度及敏感度高,有利于AIDS合并肺结核患者的诊断.值得临床进一步地推广应用.     

Regulatory T cells depress immune responses to protective antigens in active tuberculosis

RATIONALE: Tuberculosis (TB) remains a leading cause of death, and the role of T-cell responses to control Mycobacterium tuberculosis infections is well recognized. Patients with latent TB infection develop strong IFN-gamma responses to the protective antigen heparin-binding hemagglutinin (HBHA), whereas patients with active TB do not. OBJECTIVES: We investigated the mechanism of this difference and evaluated the possible involvement of regulatory T (Treg) cells and/or cytokines in the low HBHA T-cell responses of patients with active TB. METHODS: The impact of anti-transforming growth factor (TGF)-beta and anti-IL-10 antibodies and of Treg cell depletion on the HBHA-induced IFN-gamma secretion was analyzed, and the Treg cell phenotype was characterized by flow cytometry. MEASUREMENTS AND MAIN RESULTS: Although the addition of anti-TGF-beta or anti-IL-10 antibodies had no effect on the HBHA-induced IFN-gamma secretion in patients with active TB, depletion of CD4(+)CD25(high)FOXP3(+) T lymphocytes resulted in the induction by HBHA of IFN-gamma concentrations that reached levels similar to those obtained for latent TB infection. No effect was noted on the early-secreted antigen target-6 or candidin T-cell responses. CONCLUSIONS: Specific CD4(+)CD25(high)FOXP3(+) T cells depress the T-cell-mediated immune responses to the protective mycobacterial antigen HBHA during active TB in humans.     

Serodiagnosis of tuberculosis by radioimmunoassay

Mycobacteria antigens derived from whole cells and cell walls of M. tuberculosis and M. bovis (BCG) and soluble purified protein derivative (PPD) prepared from M. tuberculosis were used in solid phase radioimmunoassays to measure the amount of reactive IgG antibody in serums from 54 patients with active (culture-positive) tuberculosis (Group I), 6 patients with inactive (culture-negative) tuberculosis (Group II), 15 healthy subjects who were skin test positive to PPD (Group III), and 30 healthy persons who were PPD skin test negative (Group IV). Patients with active tuberculosis had statistically larger (p less than 0.001) amounts of IgG antibody to M. tuberculosis whole cells, cell walls, and PPD and to BCG whole cells and cell walls when compared with the amount of antibody in serums from healthy subjects who were PPD skin test negative. However, no significant differences were detected in the mean antibody response or frequency of positive antibody responses between patients with active disease and those in clinical remission. Moreover, significant amounts of antibody were detected in 7 to 20% of healthy, tuberculin-reactive subjects. On the basis of these results, it is unlikely that antibody assays alone will prove useful in the diagnosis of this disease.     

不同结核分支杆菌抗原对结核病的诊断价值

目的　研究不同结核分支杆菌单体蛋白抗原在结核病体液免疫诊断中的价值。方法以快速免疫色谱法（ＩＣＴＴＢ卡） 检测结核分支杆菌５ 种单体蛋白的抗原性，观察其在结核病诊断中的敏感性和特异性，并与ＰＰＤ 皮试及脂阿拉伯糖甘露糖（ＬＡＭ） 相比较。结果　ＩＣＴＴＢ 卡、ＬＡＭ 及ＰＰＤ皮试诊断结核病的敏感性分别为５５．９％ 、５２．６％ 、７５．０％ ，后者与前二者间差异均有显著意义（ Ｐ＜０ ．０５）；ＩＣＴＴＢ卡、ＬＡＭ、ＰＰＤ皮试诊断肺结核的特异性为８７ ．６％ 、６２．９％ 、６８．９％ ，前者与后二者间差异均有非常显著意义（ Ｐ＜ ０．０１）；ＩＣＴＴＢ卡诊断肺结核病的临床阳性预计值为８８ ．５％ ，临床阴性预计值为５３ ．８ ％ ；非结核病例中的ＩＣＴＴＢ阳性主要由抗原４、５ 阳性所致，如果去除抗原４ 、５，那么ＩＣＴＴＢ诊断结核病的特异性将提高到９８．９％ 。结论　血清结核分支杆菌单体蛋白抗原性的测定是肺结核病一项有用的辅助诊断手段。     

Depressed T-cell interferon-gamma responses in pulmonary tuberculosis: analysis of underlying mechanisms and modulation with therapy

Immunological and clinical profiles were evaluated in 2 groups: human immunodeficiency virus (HIV)-uninfected and HIV-infected patients, with newly diagnosed pulmonary tuberculosis (TB), and tuberculin-skin-test-reactive healthy control subjects. HIV-uninfected patients with TB were also followed up longitudinally during and after chemotherapy. At the time of diagnosis, purified protein derivative (PPD)-stimulated production of interferon (IFN)-gamma by peripheral blood mononuclear cells from TB patients was depressed, compared with that of healthy control subjects, whereas levels of transforming growth factor (TGF)-beta and interleukin (IL)-10 were increased. In longitudinal studies, PPD stimulated production of IL-10 and TGF-beta returned to baseline by 3 months, whereas IFN-gamma production remained depressed for at least 12 months. These data indicate that the immunosuppression of TB is not only immediate and apparently dependent (at least in part) on immunosuppressive cytokines early during the course of Mycobacterium TB infection but is also long lasting, presumably relating to a primary abnormality in T-cell function.     

结核分枝杆菌组合蛋白的表达及血清学诊断价值的评价

目的取得能用于结核病血清学诊断的敏感性、高特异性强的组合蛋白。方法用DNA双链全合成的方法合成ESAT6,MPT64,38KD,Ag85B等结核分枝杆菌特异性抗原的抗原表位基因,用PCR法将这些基因片段连接起来成为新型抗原的编码基因。将该编码基因克隆于pET24b载体,经测序鉴定后转化于大肠杆菌BL21菌株用IPTG进行诱导表达。组合蛋白经镍柱纯化后用Western印迹法和酶联免疫实验（ELISA）对其抗原性和特异性进行检测。结果携带重组质粒的菌株经IPTG诱导后以包涵体的形式大量表达组合蛋白,经镍柱纯化后蛋白质浓度达到0．5mg／ml,western实验表明：该组合蛋白能与结核病人血清特异性结合,而不与健康人血清结合。以该组合蛋白为包被抗原采用ELISA法检测结核抗体的灵敏度为61％,特异性为97．3％。PPD检测的灵敏度和特异性分别为73．7％和91．8％。该组合蛋白检测卡介苗接种阳转血清的阳性率为2．1％,特异性为97．9％,而PPD检测卡介苗接种阳转血清的阳性率为22．3％,特异性为79．7％。结论该组合蛋白用于结核病血清学诊断具有较高的灵敏度和特异性,能够为结核病的临床诊断提供一定的指导。     

重组结核分枝杆菌11 000蛋白对结核分枝杆菌感染的鉴别作用

目的 研究重组结核分枝杆菌11 000蛋白对结核分枝杆菌感染的鉴别作用.方法 以不同分枝杆菌分别致敏豚鼠,致敏成功后给所有动物皮内注射重组结核分枝杆菌11 000蛋白和结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)或胞内分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD-B),用双盲法记录注射后24 h和(或)48 h注射局部皮肤反应的纵、横径,计算其均值.结果 PPD或PPD-B对所有分枝杆菌致敏豚鼠的皮肤反应均为阳性,局部硬结直径均大于10 mm;重组结核分枝杆菌11 000蛋白对结核分枝杆菌活菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠的皮肤试验为阳性,局部硬结直径依次为(14.7±2.0)、(9.3±3.8)、(18.7±2.4)和(14.8±4.2) mm,而对灭活结核分枝杆菌、卡介苗和其他非结核分枝杆菌致敏豚鼠的皮肤试验均为阴性.结论 重组结核分枝杆菌11 000蛋白可有效鉴别结核分枝杆菌活菌感染和卡介苗接种、结核分枝杆菌死菌致敏以及其他非结核分枝杆菌的感染.