酞咪哌啶酮对多发性骨髓瘤细胞系血管新生抑制作用的研究

目的 研究多发性骨髓瘤（MM）细胞系培养上清液对人骨髓来源的内皮细胞系（HBMEC）的增殖，迁移，血管新生的促进作用及酞咪哌啶酮对其抑制作用。方法 用MM细胞系（IM9，XG1，U266和MOLP-5）培养上清液培养HBMEC，检测其对HBMEC的增殖，迁移作用，在纤维蛋白胶及基质胶（matrigel)中观察此上清液对血管新生的影响，并研究酞咪哌啶酮对这些作用的抑制。用酶联免疫吸附实验（ELISA）测定此上清液中血管内皮生长因子（VEGF）含量。结果 MM培养上清液明显促进HBMEC的增殖及迁移，在纤维蛋白胶及基质胶（matrigel)中，促进微血管的生长。这些作用均可被酞咪哌啶酮抑制。所有这些作用与MM细胞系产生的VEGF无相关性。结论 MM细胞系通过分泌VEGF或其他某些细胞因子促进HBMEC的增殖，迁移及微血管形成；酞咪哌啶酮可抑制这些作用。并可作为MM的临床治疗方法之一。     

人多发性骨髓瘤细胞系SKO-007 IL-6表达的研究

人多发性骨髓瘤(MM)细胞系SKO-007是新近建株于MM患者的骨髓瘤细胞,它是否自泌白细胞介素6(IL-6)尚未见报道。材料和方法1 细胞培养与样品收集将SKQ-007细胞(ATCC购置)悬浮于含10％灭活小牛血清(FCS)的RPMI 1640培养体系中,37℃、5％ CO_2条件下培养2～3天换液传代1次。试验前,收集细胞用无血清的RPMI 1640培养液洗涤两次,并饥饿4小时。再同法洗涤两次,收集末次洗涤液和1.5×10~7细胞作为培养0小时之样品。     

多发性骨髓瘤细胞脑源性神经营养因子对血管新生作用的研究

目的研究多发性骨髓瘤(MM)细胞脑源性神经营养因子(BDNF)的表达水平及其与MM细胞诱导的血管新生的关系。方法采用RT-PCR法、Western blot法及ELISA法检测MM细胞系KM3、RPMI8226细胞BDNF的表达及分泌。采用MTT法观察MM细胞培养上清液对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用;用改良的Boyden小室法观察MM细胞培养上清液对HUVEC迁移的影响;采用体外小管形成实验,观察MM细胞培养上清液对HUVEC分化的影响。结果KM3、RPMI8226细胞不仅表达BDNF mRNA,也表达和分泌BDNF蛋白,BDNF的基础分泌水平在其生物学作用范围内。KM3、RPMI8226细胞培养上清液均可明显促进HUVEC增殖,含50.0%KM3细胞培养上清液组和完全KM3细胞培养上清液组HUVEC数分别为对照组的(1.85±0.23)倍和(2.16±0.29)倍(P<0.05),抗人类BDNF中和抗体可部分抑制其促增殖活性;含50.0%KM3细胞培养上清液组HUVEC迁移指数为1.85±0.23,完全KM3细胞培养上清液组HUVEC迁移指数为2.16±0.29,与对照组比较,差异有统计学意义(P值均<0.05),并可明显促进基质胶中网状毛细血管形成(P<0.01),抗BDNF中和抗体可明显抑制其作用。结论MM细胞表达和分泌BDNF,BDNF可能参与MM细胞诱导的血管新生。     

正常人骨髓成纤维样基质细胞对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖的影响

为了观察正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226增殖的影响，建立了RPMI8226细胞和HFCL细胞共培养体系，用MTT法测粘附率，台盼蓝拒染法测定生长曲线；流式细胞术(FCM)检测细胞周期的变化，瑞氏—吉姆萨染色后进行分裂指数(MI)测定，Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达。结果显示，与HFCL细胞共培养1小时后，RPMI8226细胞的粘附率为29．4％；生长曲线显示直接接触组RPMI8226细胞生长受抑，而非直接接触组(transwell组)无变化；RPMI8226细胞与HFCL细胞共培养后，直接接触组G1期细胞增高，S期细胞减少；其分裂指数表现为单独骨髓瘤细胞组大于与HFCL直接接触组；直接接触组PCNA表达下调。结论：正常人骨髓成纤维样基质细胞HFCL能抑制骨髓瘤细胞系RPMI8226的增殖，阻止其细胞周期的运行。     

血管内皮细胞生长因子-A及肿瘤相关巨噬细胞在多发性骨髓瘤中的研究进展

多发性骨髓瘤(MM)是一类浆细胞恶性克隆性疾病,发病机制复杂.MM的发生、发展与新生血管形成及骨髓微环境密切相关.新生血管形成受血管内皮细胞生长因子(VEGF)等血管形成调节因子调节,可促进MM细胞增殖、迁移.肿瘤相关巨噬细胞(TAM)活化后,亦可产生VEGF等促血管生成因子,从而促进骨髓新生血管形成,促进MM发展.笔者拟就VEGF-A、TAM在MM发病中的研究进展进行综述.     

马法兰和阿霉素耐药人骨髓瘤细胞系的建立

目的:建立对马法兰和阿霉素耐药的人骨髓瘤细胞系。方法:在人骨髓瘤细胞系RPMI8226培养体系中分别加入1.0×10-8M的阿霉素(DOX)和1.0×10-6M的马法兰(LP),每周3次换液,DOX于10月后增加至1.0×10-7M,LP于47周后增加至5×10-6M。MTT法测定敏感细胞系和耐药系8226/DOX的IC50值,在耐LP细胞系8226/LP中加入丁硫氨酸亚砜胺(BSO)阻断谷胱甘肽的合成,MTT法测定细胞系8226/S、8226/LP细胞及8226/LP+BSO细胞的IC50值。HE染色普通光学显微镜下观察各组细胞形态,流式细胞仪检测各组细胞表面P-糖蛋白、CD38、CD45、CD19。台盼蓝拒染法测出8226/S、8226/DOX、8226/LP细胞的生长曲线。结果:所培养耐药细胞系8226/DOX、R8226/LP具有亲母细胞系的生物学特点,形态相似,均为CD38+CD45-CD19-表达细胞,倍增时间与亲母细胞系相近。比较IC50,8226/DOX对DOX的耐药约15倍于亲母细胞系。8226/LP对LP的耐药约7倍于亲母细胞系,而经过BSO阻断,其敏感性明显增加。结论:建立的骨髓瘤细胞系RPMI8226/LP、RPMI8226/DOX可作为骨髓瘤耐药研究的有效模型。     

氧化低密度脂蛋白诱导内皮祖细胞凋亡的机制探讨

目的:探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉血内皮祖细胞(EPCs)凋亡的信号途径.方法:密度梯度离心法获取人脐静脉血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞分成以下各组:(1)空白对照组:不作任何处理,以RPMI1640培养液继续培养48 h;(2) ox-LDL各浓度组(共3组):EPCs培养24 h后,再分别换用含5,10,20 mg/L ox-LDL的RPMI 1640培养液继续培养24 h;Western blot检测细胞内Akt、磷酸化Akt的蛋白表达时加上一组.(3) Wortmannin组:EPCs培养24 h后,换用含Wortmannin 100 μmol/L RPMI1640培养液继续培养24 h.采用MTI法检测EPCs增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率;提取细胞RNA,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测Bcl-2mRNA表达;采用免疫细胞化学法检测Bcl-2蛋白表达水平;采用Western blot检测磷酸化Akt的蛋白表达.结果:Ox-LDL呈浓度依赖性抑制EPCs增殖、诱导EPCs凋亡(P＜0.01),基础状态下内皮祖细胞表达Bcl-2mRNA及蛋白,ox-LDL处理能抑制其表达,降低磷酸化Akt的表达,并存在量效关系(P＜0.05).结论:Ox-LDL抑制EPCs增殖、诱导EPCs凋亡的作用是通过抑制Akt活化,下调凋亡抑制蛋白Bcl-2实现的;Ox-LDL的作用机制至少部分是依赖PI3K/Akt信号通路实现,这可能影响血管内皮的修复及新生血管的形成.     

姜黄素对人多发性骨髓瘤细胞表达Survivin、Bcl-2、Bax的影响

为探讨姜黄素对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226的抑制生长和诱导凋亡的作用机制,应用MTT法检测姜黄素对肿瘤细胞的杀伤效应;用流式细胞术（FCM）分析姜黄素作用后肿瘤细胞凋亡及细胞周期的变化;用RT-PCR方法检测Survivin、Bcl-2、Bax mRNA水平的变化。结果表明：姜黄素明显抑制RPMI8226细胞的增殖,并表现为时间、剂量依赖性,24、48小时IC50值分别为12.15μmol/L、4.9μmol/L;凋亡率由10.6%增加到36.9%（p〈0.05）,细胞发生G2/M期阻滞;RPMI8226细胞细胞强表达Survivin、Bcl-2,弱表达Bax。RPMI8226细胞经10μmol/L姜黄素处理24小时后,survivin、Bcl-2 mRNA表达下调,而Bax表达上调。结论：姜黄素抑制多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖,并诱导凋亡。姜黄素的抗瘤机制可能与凋亡相关蛋白survivin、bcl-2、bax在转录水平的调节有关。     

三氧化二砷与干扰素对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖的影响

目的观察三氧化二砷(As2O3)、干扰素(IFN-α1、IFN-α2、IFN-β)及其两者联合对人类骨髓瘤细胞株(RPMI8226)的增殖的影响。方法以四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)测定RPMI8226细胞的增殖活性,并观察不同类型、不同浓度干扰素和亚砷酸对RPMI8226细胞增殖的影响以及两者联合对RPMI8226细胞的增殖作用。结果As2O3对RPMI8226细胞增殖有显著的抑制作用;IFN-α1对RPMI8226细胞生长无抑制作用,当IFN-α2浓度大于500 kU/L和IFN-β浓度大于1000 kU/L时对RPMI8226细胞增殖有抑制作用(P<0.05);且IFN-α2与As2O3联合对RPMI8226细胞增殖抑制有协同作用(P<0.05)。结论As2O3对骨髓瘤细胞增殖有抑制作用,而干扰素须达到一定浓度才对RPMI8226细胞增殖有抑制作用。     

阿霉素诱导的骨髓瘤细胞化疗耐药的分子机制分析

本研究旨在探讨阿霉素诱导的骨髓瘤细胞RPMI8226化疗耐药的分子机制,分析Notch信号过度活化在化疗耐药机制中的作用.以浓度梯度递增法建立耐阿霉素的骨髓瘤细胞系RPMI8226/DOX,针对化疗耐药的瘤细胞RPMI8226/DOX,用RT-PCR法检测细胞耐药前后Notch2、Jagged1、Jagged2、HES1基因表达变化;Western blot检测耐药细胞系与敏感细胞系P-170蛋白表达变化;ELISA方法分析IL-6、VEGF水平变化.结果显示,Notch2、Jagged1、Jagged2基因随着耐药程度的增高表达逐渐增高,而HES1则相反,随着耐药程度增高表达逐渐减低.P-170蛋白随着耐药程度的增高表达逐渐增高.耐药细胞组培养上清中细胞因子VEGF和IL-6水平显著高于普通培养组.结论：建立的人骨髓瘤细胞系RPMI8226/DOX可以作为骨髓瘤耐药研究的有效模型,Notch信号通路的活化与多发性骨髓瘤的耐药密切相关,Notch信号通路有望成为多发性骨髓瘤治疗的新靶点.     

激活Notch信号抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡

摘要多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞的增殖及凋亡受骨髓造血微环境的调节。Notch信号是骨髓中细胞与细胞之间通讯的主要信号通路之一，它对多发性骨髓瘤细胞的调节作用目前并不清楚。本研究旨在阐明Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡的调节作用。利用RT-PCR分析多发性骨髓瘤细胞Notch信号分子的表达和采用逆转录病毒介导的基因转移方法将Notch-1胞内区(Intracellular domain of Notch，ICN)转入多发性骨髓瘤细胞株，以建立激活)Notch信号的多发性骨髓瘤细胞系；采用台盼蓝拒染和TUNEL方法测定骨髓瘤细胞的死亡。结果表明：RT-PCR检测显示多发性骨髓瘤细胞表达、Notch-1及相关分子。逆转录病毒可以介导外源Notch-ICN在骨髓瘤细胞中表达，激活Notch-1信号可以抑制二甲基鞘氨醇(N，N-dimethylspingosine，DMS)诱导的多发性骨髓瘤细胞的凋亡。结论：：Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡有抑制作用，这可能为多发性骨髓瘤的治疗提供新的靶点．     

骨髓间充质干细胞在多发性骨髓瘤活动与缓解期具有不同的促血管生成能力

背景：活动期和缓解期多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的血管生成能力有无差异目前尚不清楚。目的：观察多发性骨髓瘤活动期及缓解期骨髓间充质干细胞促血管生成能力的差异。方法：抽取13例多发性骨髓瘤患者治疗前和4个周期治疗后的骨髓,分离培养出骨髓间充质干细胞,采用ELISA 方法测定骨髓间充质干细胞培养上清液中血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的浓度;MTT检测骨髓间充质干细胞培养上清液对脐静脉内皮细胞增殖能力的影响;通过Transwel 小室观察骨髓间充质干细胞培养上清液对脐静脉内皮细胞运动能力的影响;通过人工基底膜实验观察骨髓间充质干细胞体外促血管生成和成管能力。结果与结论：活动期多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞培养上清中血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子浓度明显高于缓解期（P〈0.05）;骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞上清对脐静脉内皮细胞增殖作用呈剂量依赖性,活动期明显强于缓解期（P〈0.05）;活动期骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞上清对脐静脉内皮细胞迁移作用明显高于缓解期（P〈0.05）;骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞体外具有明显成血管作用,活动期明显强于缓解期（P〈0.05）。结果提示多发性骨髓瘤活动期骨髓间充质干细胞促血管生成能力明显大于缓解期。     

多发性骨髓瘤骨髓活检切片与涂片的比较

本研究探讨骨髓活检在多发性骨髓瘤诊断中的意义。观察279例多发性骨髓瘤患者的骨髓涂片及骨髓活检切片,就骨髓增生程度,骨髓中浆细胞浸润度及增殖模式,骨髓间质病理变化及骨髓纤维化程度进行比较。结果表明：骨髓活检切片显示的增生程度明显高于骨髓涂片;骨髓切片的浆细胞增殖模式与骨髓涂片的浆细胞比例不完全一致;骨髓纤维化程度对骨髓涂片和活检的细胞增生度一致性有影响。结论：骨髓活检切片比骨髓涂片能更准确地反映骨髓增生程度、浆细胞浸润情况及增殖模式,对多发性骨髓瘤的诊断具有重要价值。     

核糖核苷酸还原酶小亚基M2在多发性骨髓瘤患者中的表达及抑制肿瘤细胞增殖的相关机制

目的:探讨核糖核苷酸还原酶小亚基M2(ribonucleotide reductase M2,RRM2)在多发性骨髓瘤细胞中的表达及抑制肿瘤细胞增殖的相关机制。方法:选取2016年7月至2018年9月在本院初诊的多发性骨髓瘤患者36例为MM组,选取同期纯缺铁性贫血的患者16例作为对照组。应用RT-qPCR、Western blot检测所收集病例中骨髓单个核细胞内RRM2的表达。用siRNAs转染多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226建立RRM2表达缺失的细胞模型,并用CCK8检测细胞的增殖,流式细胞术分析敲低RRM2表达对细胞周期的影响,并应用Western blot分析周期相关调控蛋白的变化。结果:RT-qPCR及Western blot结果显示,多发性骨髓瘤患者样品中的RRM2相对表达水平比对照组明显升高(P<0.05)。进一步分析证明,多发性骨髓瘤患者单个核细胞中RRM2的表达量与临床肿瘤分期、骨质破坏及髓外浸润等关系密切(P<0.05)。在多发性骨髓瘤细胞株内,利用siRNA干扰下调RPMI8226细胞内RRM2蛋白表达,可以明显抑制RPMI8226细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞周期的结果发现,RRM2干扰组细胞周期阻滞于S期(P<0.05);进一步的研究证明,RRM2干扰可以影响细胞周期调控相关蛋白的表达。结论:RRM2在多发性骨髓瘤单个核细胞内呈高表达,且与患者肿瘤恶性程度密切相关。干扰细胞内RRM2表达可通过阻滞细胞周期抑制细胞增殖。RRM2可能成为评估多发性骨髓瘤进展的新指标及药物开发的新靶点。     

多发性骨髓瘤细胞DNA含量和细胞周期分析

本研究探讨MM的遗传学背景和细胞增殖特点。应用直接免疫磁珠法分选19例多发性骨髓瘤（MM）患者的骨髓瘤细胞，用流式细胞术检测骨髓瘤细胞的DNA含量和细胞周期。结果表明：19例患者中4例骨髓瘤细胞为超二倍体，15例骨髓瘤细胞均为二倍体；正常人浆细胞处于S＋G2／M期细胞的比例为（1．15±0．60）％，MM患者骨髓瘤细胞处于S＋G2／M期细胞比例为（10．06±12．60）％，两组相比具有显著性差异（P=0．001）。初治组患者出现超二倍体比例为11．76％，复治组患者为100．00％，两组相比有显著性差异（p=0．035）；初治组骨髓瘤细胞处于S＋G2／M期的比例为（7．12±4．98）％，复治组为（35．10±32．56）％，两组相比有显著性差异（P=0．001）。结论：MM患者骨髓细胞DNA含量和细胞周期分布的变化提示了该病遗传背景的复杂性和细胞增殖的异常。而此与病程可能具有一定的相关性。     

姜黄素抑制多发性骨髓瘤细胞脑源性神经营养因子所诱导的血管新生作用

为了研究姜黄素对多发性骨髓瘤（MM）细胞脑源性神经营养因子（BDNF）、内皮细胞株TrkB的表达及内皮细胞血管新生的影响，以初步探讨姜黄素通过抑制血管新生治疗多发性骨髓瘤的可能性，采用RT—PCR法分别检测姜黄素处理前后多发性骨髓瘤细胞株KM3中BDNF的基因表达变化与内皮细胞株ECV304中TrkB的基因表达变化，应用内皮细胞迁移试验和内皮细胞小管形成试验评价姜黄素对内皮细胞血管新生的影响。结果显示：外源性BDNF能够有效地促进内皮细胞的迁移和小管形成，但这两个效应均能被姜黄素明显阻断；KM3细胞表达BDNFmRNA，ECV304细胞表达TrkBmRNA，姜黄素对两者的表达均具有抑制作用，并呈剂量-时间依赖性。结论：BDNF是一种具有促进血管增殖活性的细胞因子，姜黄素可以分别下调MM细胞BDNF与内皮细胞T她的表达，阻碍两者间的相互作用，继而抑制血管新生，这可能成为治疗MM潜在的作用靶点。     

多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞生物学特性分析

为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor，SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31；MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能；MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常；MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论：MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。