人IFN-β基因启动子荧光表达载体的构建及鉴定

目的构建人IFN-β基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-IFNB1)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体(pGE3-IFNB1),并在A549细胞中进行表达验证。方法采用PCR方法扩增出IFN-β启动子区片段,克隆入荧光表达载体pGL3 basic和pGE3 basic,并用脂质体瞬时转染A549细胞,6 h后用汉滩病毒(HTNV)感染转染后的细胞,24 h后检测重组载体在细胞内的表达情况。结果重组载体pGL3-IFNB1和pGE3-IFNB1分别经双酶切鉴定及序列测定证实载体构建正确;且在A549细胞内成功表达。经HTNV刺激后表达明显增加。结论成功构建了人IFN-β启动子荧光素酶报告基因载体(pGL3-IFNB1)及增强型绿色荧光蛋白表达载体(pGE3-IFNB1),为进一步研究病毒诱导产生IFN-β机制提供了有用的工具。     

人NKX3.1基因启动子的克隆及在不同肿瘤细胞系中启动子活性的测定(英)

目的：克隆NKX3.1基因启动子并检测其启动子活性，为研究NKX3.1 基因转录调控的基本机制奠定基础。 方法： 采用PCR方法从人基因组中扩增NKX3.1基因上游 1.04 kb 启动子片段并分别克隆到报道基因载体pGL3-basic和 pEGFP-1中，通过转染细胞、荧光素酶活性测定及荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，检测其启动子活性。 结果： DNA测序结果证实克隆的 1.04 kb 启动子片段序列正确；pGL3-1.04 kb 启动子转染LNCaP细胞后，双荧光素酶活性测定M1/M2=2.7, 为pGL3-control 活性的1.5倍，为pGL3-basic活性的50倍。表明克隆的人NKX3.1基因上游 1.04 kb 片段具有较强的启动子活性。为检测此 1.04 kb 启动子在不同组织细胞中的活性，分别将pGL3-1.04 kb 启动子和pEGFP-1.04 kb启动子转染入不同的肿瘤细胞系，检测荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达。结果显示 1.04 kb 启动子在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。采用TRANSFAC数据库分析，发现在 1 040 bp 片段内含有多种顺式作用元件，它们的功能性将需要进一步实验证明。 结论： 克隆的人NKX3.1基因上游 1.04 kb 片段具有较强的启动子活性，并且在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。     

乙型肝炎病毒X蛋白抑制SFRP5启动子的活性

 目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)抑制分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)启动子活性的分子机制。方法:扩增不同长度的SFRP5启动子区片段，构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic上，并将构建好的重组质粒转染入正常肝细胞系LO2细胞，再分别感染编码HBx的腺病毒（Ad-HBx）或编码绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-GFP），荧光显微镜下观察病毒感染效率，检测萤光素酶活性以观察HBx对SFRP5启动子活性的影响。结果:(1) 含不同长度的SFRP5启动子区截短突变报告质粒构建成功。(2) 截短突变报告质粒的萤光素酶活性与pGL3-Basic对照组相比，分别为(6.32±0.04)倍(-478 bp~+47 bp)、(5.79±0.32)倍(-811 bp~+47 bp)、(3.59±0.34)倍(-1 235 bp~+47 bp)、(3.86±0.39)倍(-1 677 bp~+47 bp)、(3.26±0.42)倍(-2 072 bp~+47 bp) (均P<0.05)。过表达HBx可以明显抑制SFRP5启动子活性，抑制率分别为44%(-478 bp~+47 bp) (P<0.05)、 46%(-811 bp~+47 bp) (P<0.05)、 28%(-1 235 bp~+47 bp)、 24%(-1 677 bp~+47 bp)和40%(-2 072 bp~+47 bp)。结论: HBx可以明显抑制SFRP5启动子区活性，可能导致SFRP5基因表达下调。     

人GDDR基因启动子的克隆和报告基因载体构建

目的:克隆人GDDR基因的启动子;构建GDDR启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法:设计合成GD-DR启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增GD-DR启动子;将扩增片段插入T载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至pGL3-Basic荧光报告基因载体;瞬时转染细胞,用双荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果:PCR扩增得到人GDDR基因启动子;成功构建pGL3-GDDR-promoter 报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.结论:成功地构建人GDDR基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究GDDR转录表达的调控机制提供基础.     

HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响

目的:构建乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)表达载体pEYFP-C1-X及人IGF-II基因P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4,并初步探讨HBx对IGF-II基因P4启动子活性的影响。方法:应用基因重组技术,将HBx基因及P4启动子分别克隆入pEYFP-C1及pGL3-Basic载体,构建重组质粒pEYFP-C1-X及pGL3-P4;将pEYFP-C1-X稳定转染HepG2细胞,进行G418筛选;将体外甲基化pGL3-P4瞬时转染HepG2-EYFP-X细胞,采用双荧光素酶实验检测P4启动子的转录调控活性。结果:(1)经酶切及测序鉴定,重组质粒中的目的片段HBx和P4启动子的大小分别为465bp及1246bp,序列与GenBank数据库一致。(2)获得了表达HBx的细胞系HepG2-EYFP-X,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。(3)转染HepG2-EYFP-X细胞的甲基化P4启动子的荧光素酶活性明显高于其对照细胞HepG2-EYFP(P0.01)。结论:HBx可增加P4启动子的转录活性。     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的 构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达.方法 采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的 片段(-298～﹢283),双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制.将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL-CMV(表达海肾荧光素酶)共转染原代培养皮质神经元,24 h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性.结果 重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶.结论 成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达.     

TFF1基因启动子双荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

目的:构建含有野生型或突变型人三叶因子1(Trefoil factor 1,TFF1)基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并研究雌激素对上述启动子转录活性的影响。方法:设计人野生型和突变型TFF1基因启动子的引物,扩增回收片段,将其克隆到含有荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中构建重组质粒,经双酶切和测序鉴定后转染胆囊癌GBC-SD细胞,24h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的表达活性。结果:成功构建了野生型pGL3-TFF1质粒和雌激素应答元件(Estrogen response elements,ERE)位点突变的pGL3-TFF1-△ERE突变质粒,激活蛋白1(Activating protein-1,AP-1)位点突变的pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒。经双荧光素酶报告基因检测分析,pGL3-TFF1质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒均具有基础转录活性,与对照组比较(P0.001)。雌激素能进一步增强野生型TFF1启动子质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒的启动子转录活性(P0.01),而对pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒的活性无影响(P0.05)。结论:本研究成功构建了野生型以及突变型TFF1启动子质粒,发现非经典雌激素受体结合部位——激活蛋白1(AP-1)位点对雌激素诱导的TFF1启动子转录活性增强发挥决定性作用。     

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

人SREBP-1c启动子报告基因的构建和功能验证

目的 构建人SREBP-1c启动子的荧光素酶报告基因载体并进行功能的初步验证。 方法 提取人血基因组DNA,PCR扩增SREBP-1c的启动子,构建SREBP-1c启动子双荧光素酶的报告基因载体;用双荧光素酶活性检测其功能。Western blotting检测FoxO1对SREBP-1c蛋白的抑制作用。 结果 成功构建了pGL3-Basic-SREBP-1c-promoter的报告基因载体,共转染FoxO1明显抑制了人SREBP-1c启动子的活性,同时过表达FoxO1抑制了SREBP-1c的蛋白表达。 结论 FoxO1通过抑制SREBP-1c的转录来抑制SREBP-1c的表达。     

系列截短和缺失的hTERT启动子报告载体的构建及活性验证

目的 构建系列截短及缺失的hTERT启动子荧光素酶报告载体并验证其活性.方法 PCR扩增系列截短及缺失的hTERT启动子基因,克隆人pGL3-Basic质粒,构建荧光素酶报告载体.分别与pRL-TK内参照质粒共转染HepG2和COS-7细胞,48h后裂解细胞,双荧光素酶分析法检测启动子的活性.结果 成功构建系列截短及缺失的hTERT启动子报告载体,分别命名为pGL3B-895、pGL3B-371、pGL3B-DELS2、pGL3B-349、pGL3B-329、pGL3B-318、pGL3B-306.双荧光素酶报告基因检测结果显示在肝癌细胞和工程细胞中上述报告载体均具有启动子活性.结论 成功构建具有启动子活性的系列截短及缺失的hTERT启动子荧光素酶报告载体,为进一步探讨肝癌发生中人端粒酶逆转录酶表达调控机制提供必要的实验材料.     

NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探

目的：构建NOx4荧光素酶报告基因质粒载体,探讨NOX4基因表达调控机制。方法：以细胞基因组DNA为模板作,采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列（533bp）,插入质粒DGL3-basic载体,构建重组质粒pGL3-NOX4,重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3-NOX4转染A549细胞,通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果：酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激,结果显示NOx4表达增强。结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体,为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。     

NOX1基因荧光素酶报告基因系统的建立

目的：对炎症细胞因子TNF-α及IFN-γ刺激下,人NOX1基因的表达调控进行初步分析。方法：将NOX1基因5′-端上游序列连接到无启动子的PGL3-BASIC质粒,构建了PGL3-BASIC／NOX1报告质粒。PGL3-BASIC／NOX1质粒转染A549细胞,用TNF-α、IFN-γ刺激12h,双荧光素酶报告基因系统检测基因表达情况。结果：克隆的NOX1片段具有较强的启动子活性,在TNF-α和IFN-γ共同刺激下,转染报告基因的A549细胞萤光素酶活性与对照相比有明显的增高（约4．3倍）。分析显示NOX1基因5′端上游序列片段含有NF-KB结合位点,提示细胞因子刺激的荧光素酶表达增强可能与NF-KB位点激活相关。结论：NOX1基因表达水平明显受到炎症细胞因子的调控,提示该基因可能参与机体免疫防御（特别是上皮细胞免疫防御）,值得进行深入研究。     

pGL3-Claudin-1 promoter荧光素酶报告基因质粒的构建及其功能鉴定

背景：Claudin-1是一种多功能蛋白,除了组成紧密连接封闭细胞间隙,它在转录水平的表达失调可能作为一种分子标志反映到恶性肿瘤的侵袭转移和预后中。 目的：构建重组大鼠重组Claudin-1萤光素酶报告基因质粒。 方法：设计和合成包含5’非转录区的约2 000 bp的脱氧核糖核酸链,经过限制性内切酶KpnⅠ和MluⅠ酶切后插入到pGL3-Basic载体中,并用感受态E.coli DH5α和Pmd18-T-simple载体筛选阳性样品。阳性克隆通过测序和PCR证实。实验分为4组：对照组,阳性对照组(pGL3-promoter质粒转染),阴性对照组(转染pGL3-Basic质粒),实验组(转染pGL3-Claudin-1 promoter质粒)。将质粒转染293T细胞检测Claudin-1启动子活性。 结果与结论：重组质粒DNA测序结果采用NCBI blast比对与GenBank(gi|62750811)中大鼠Claudin-1基因启动子序列完全匹配。重组萤光素酶报告基因转录活性检测与pGL3-Basic质粒相比,重组pGL3质粒转录活性明显增强 (P < 0.001)。经过测序和转染结果证实有效的pGL3-Claudin-1启动子质粒构建成功。     

人Egr-1启动子的克隆及其在肿瘤细胞中的辐射诱导反应

目的:克隆人Egr-1基因的启动子, 插入荧光素酶报告基因载体中, 并检测电离辐射对其活性的影响.方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出Egr-1启动子, 将其克隆到pGL3-basic载体中;将重组质粒转染人肿瘤细胞, 测定Egr-1启动子在不同辐射条件下转录活性的改变.结果:成功构建了Egr-1启动子的荧光素酶报告基因;在不同剂量的γ射线照射后, Egr-1的启动子活性均明显高于未照射组;在同一剂量照射后48 h, Egr-1的启动子活性达峰值.结论:本实验构建的Egr-1启动子具有辐射激活的功能, 为进一步研究放射-基因治疗奠定了基础.     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

错配修复基因hMLH1启动子萤光素酶报告基因载体的构建与鉴定

 目的：构建含hMLH1启动子片段的萤光素酶报告基因载体,并检测其在雌激素诱导下的转录活性。方法：以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增hMLH1启动子片段（-1953/+53）,插入萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic,将重组质粒转入HEK293细胞,检测在有和无雌激素诱导下萤光素酶的活性变化。结果：酶切和测序结果证实重组萤光素酶报告基因载体pGL3-Promoter1-luc构建成功。转染pGL3-Promoter1-luc后,雌激素诱导的萤光素酶活性为7.45±0.81,显著高于无水乙醇组的3.28±0.19 (n=3,P<0.001)。结论：hMLH1启动子片段存在与雌激素相关的调控序列。     

ID1启动子的构建及其在不同细胞系中的表达

目的 观察不同细胞系中ID1启动子活性的表达的不同.方法 以大鼠的基因组DNA为模板克隆了长度为1742 bp(-1765/+88)的大鼠ID1启动子序列,将其连接到带有luciferase报告基因的PGL3-basic载体上,构建PGL3-ID1启动子序列.测序正确后,用磷酸钙共沉淀法转染大鼠骨髓间充质干细胞(mes...