由J6-1细胞克隆EB病毒功能性巨噬细胞集落刺激因子受体基因BARF1

目的：从潜伏感染EB病毒的人白血病细胞系J6－1克隆EB病毒功能性巨噬细胞集落刺激因子受体（M－CSFR）基因BARF1。方法：从J6－1细胞提取DNA,利用PCR技术扩增出EB病毒BARF1基因编码区基因片段,连接至载体pMD18-T Vector,并转化Ecoli。对这一克隆片段进行了序列分析。结果：克隆了BARF1基因,证明其与EB病毒B95－8株相关基因同源性为99％,并发现J6－1细胞BARF1码区第577位出现一个核苷酸的缺失,引起下游序列移码,使编码区提前终止于第597位。结论：上述结果为深入研究BARF1与M－CSF及其受体之间的相互作用奠定了基础,为潜伏感染EB病毒白血病细胞的发病学研究提供了新的线索。     

ULBP3胞外段基因的克隆与表达

目的 为了研究ULBP3刺激NK细胞增殖分化的功能，首先需构建、表达ULBP3胞外段重组蛋白。方法 用RT-PCR方法从人结肠癌组织中钓取ULBP3胞外段基因，构建pET32a原核表达载体，转化大肠杆菌BL21，以IPTG诱导表达，Western blot鉴定。结果 经测序证实，所获得的cDNA克隆为ULBP3胞外段基因，其序列与genebank中已经发表的序列完全一致，pET32a原核表达载体转化大肠杆菌BL21后，经筛选获得的阳性重组菌稳定表达ULBP3胞外段重组蛋白。结论 成功表达了ULBP3胞外段重组蛋白，可用于进一步研究ULBP3刺激NK细胞增殖分化的功能。     

人生存素基因的克隆、表达与抗血清制备

目的克隆表达重组人生存素,制备其抗血清并检测其免疫识别活性。方法用RT-PCR方法从培养的人白血病细胞株HL-60中克隆人生存素cDNA,克隆到原核表达载体pET32a(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,目的蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫小鼠制备抗血清,ELISA检测抗血清的效价,Western blot和免疫细胞化学法鉴定抗血清的特异性。结果所克隆生存素cDNA序列与Genbank中序列完全一致,将其读码框插入原核表达载体pET32a(+)诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证实重组蛋白为分子量约37KD的融合蛋白,表达量占总菌体的30%,纯化后融合蛋白的纯度为95%,所制备的鼠抗血清的效价达1:1600,Western blotting证实其有较好的特异性,可以检测肿瘤细胞生存素的表达。结论我们已克隆并表达了人生存素基因,所制备的抗人生存素血清可用于相关肿瘤检测。     

重组IFN-α2a与HSV-tk/GCV系统协同作用增强对于卵巢癌细胞系SKOV3杀伤作用的体外研究

目的：在原核系统中表达并纯化人血管生成抑素（angiostatin),制备鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。方法：设计引物扩增angiostatin的cDNA,然后亚克隆入原核表达载体pQE,并转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化,再用纯化的人血管生成抑素免疫小鼠并制备多抗。结果：通过重组质粒酶切和测序分析等方法,筛选出重组阳性克隆,转化入大肠杆菌BL21中诱导表在并纯化成功,再利用纯化的人血管生成抑素制备成功鼠抗人血管生成抑素多克隆抗体。结论：表达产物及多克隆抗体为下阶段深入研究提供了重要的实验材料。     

小鼠成纤维细胞激活蛋白多克隆抗体的制备及应用简

目的：表达和纯化小鼠成纤维细胞激活蛋白α（FAPα）二肽基肽酶催化核心序列（FAPαc）融合蛋白（His-FAPαc）,制备兔抗小鼠FAPα多克隆抗体,并用此抗体检测FAPα在肿瘤细胞和成纤维细胞以及肿瘤间质中的表达情况。方法：将本实验室构建好的原核表达质粒pET28a（＋）-FAPαc转化大肠杆菌BL21,IPTG 诱导表达目的蛋白His-FAPαc;用纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗小鼠FAPα多克隆抗体;用免疫印迹法和酶联免疫吸附试验检测该多克隆抗体与重组蛋白His-FAPαc 的反应性及检测该多克隆抗体的效价,并用该抗体检测FAPα在肿瘤细胞和成纤维细胞以及肿瘤间质中的表达情况。结果：His-FAPαc融合蛋白可与兔抗小鼠FAPα多克隆抗体特异性结合;该多克隆抗体的效价高,特异性好,并且能检测小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblast cells,MEF）及结肠癌和乳腺癌的间质细胞高表达FAPα的全长序列蛋白。结论：制备的兔抗小鼠FAPα多克隆抗体能够有效地识别小鼠胚胎成纤维细胞和肿瘤间质细胞表达的FAPα蛋白,为研究FAPα在肿瘤的发生、发展及转移中的作用和以FAPα为靶点而开展的的抗肿瘤研究奠定基础。     

靶向白血病干细胞CD123的毒性融合蛋白的制备

 目的　构建靶向白血病干细胞CD123的融合蛋白,检测其表达效果及其识别白血病干细胞的活性。方法　采用PCR法扩增白细胞介素-3（IL-3）和毒素蛋白（LP）的编码DNA序列,经酶切、连接,克隆至表达载体pAYZ,转化大肠杆菌E.coli 16C9,鉴定阳性克隆菌落,经低磷培养基AP5诱导表达融合蛋白IL-3-G4S-LP,用CM-FF阳离子柱和抗-Etag亲和层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,流式细胞术测定其与红白血病细胞TF1的结合活性。结果　构建的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶性蛋白表达,纯化后纯度达95 %以上,表达量约为1 mg／L,并有与白血病干细胞表面IL-3受体α亚基（CD123）特异性结合的活性。结论　构建的融合蛋白IL-3-G4S-LP具有与白血病干细胞结合的特性,可望成为复发和耐药白血病的治疗药物。     

大肠埃希菌植物毒素Gelonin核心功能区表达和纯化及抗肿瘤活性研究

目的:在大肠埃希菌中表达纯化植物毒素Gelonin核心功能区△Gel(S8-K200),并研究其抗肿瘤活性。方法:以pET30a( )-Gelonin为模板,采用PCR方法扩增△Gel基因,克隆插入pEASY-B载体,测序鉴定后插入pET30a( )载体,转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS,诱导表达并纯化目的蛋白,并观察其抗肿瘤活性和细胞毒性。结果:△Gel(S8-K200)目的基因的大小约为600bp,SDS-PAGE电泳显示目的蛋白的大小约为27×103,体外实验结果显示,△Gel和Gelonin对肿瘤细胞系HL-60具有明显的杀伤作用,而对正常人胚肺细胞系WI-38毒性极小。结论:Ge-lonin核心功能区△Gel保持了Gelonin毒素蛋白全部的抗肿瘤活性,具有很好的开发前景。     

人截短型线粒体凋亡诱导因子蛋白的克隆、表达及诱导肝癌细胞凋亡的活性鉴定

背景与目的:线粒体在细胞凋亡中扮演关键的角色,线粒体凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于线粒体中的一种重要的凋亡蛋白,对线粒体蛋白质的研究可深入阐明线粒体在凋亡中的作用.本研究的目的在于克隆、表达重组的人截短型AIF,并对其诱导肿瘤细胞核凋亡的生物学活性进行鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人肝癌细胞SMMC-7721中扩增出剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段,并按阅读框克隆到原核表达载体pET32a( )中.进行酶切与测序鉴定后,以构建的正确重组质粒pET32a-AIF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达AIF蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western blot检测;采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白;采用凝胶滞后实验(EMSA)与Hoechst 33258染色检测AIF蛋白的生物学活性.结果:获得了去掉线粒体定位信号的AIF基因,并克隆到pET32a( )载体中,经酶切与测序鉴定完全正确.此重组质粒转化人大肠杆菌,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量约Mr 70 000的目的蛋白;表达量约占菌体蛋白总量的11%,表达的目的蛋白与抗His标签抗体与抗人的AIF蛋白具有良好的反应性;纯化后,AIF的纯度达到95%.经EMSA与Hoechst 33258染色实验证实:获得的AIF蛋白具有良好地与DNA结合并可诱导肿瘤细胞核凋亡的能力,凋亡率为37%.结论:人AIF基因在PET表达系统中得到有效表达:蛋白复性后能有效地在体外与DNA结合,并可诱导细胞凋亡.     

人热休克蛋白70的原核表达和纯化的实验研究

目的在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70基因并纯化表达产物。方法以人HSP0 cDNA为模板,采用PCR方法进行扩增,将PCR产物克隆到表达载体pET30a上,将重组质粒pET30a-HSP70转化大肠杆菌BL21上,经IPTG诱导后,表达产物进行SDS-PAGE及Western blot验证并纯化。结果应用PCR方法扩增出约1900bp的目的片段;经酶切鉴定和DNA测序证实,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-30a上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE,发现在分子量约为70kD处有蛋白表达,Western blot证实其为目的蛋白,纯化后的HSP70纯度达到90%以上。结论在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70蛋白并且经过纯化,为研究HSP70的结构、功能及临床应用提供了必要条件。     

血管内皮抑素的原核表达及多克隆抗体的制备

背景与目的：本实验拟在原核系统中表达并纯化人血管内皮抑素（endostatin),制备鼠抗人血管内皮抑素多克隆抗体。方法：设计引物扩增内皮抑素的cDNA,重组人原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,应用纯化产物免疫3只小鼠。结果：构建成制备人血管内皮抑素的原核表达载体pQE-30,并转化入大肠杆菌BL21中得到表达产物,经Ni亲和层析柱纯化后进行SDS-PAGE鉴定结果为单一组分。利用纯化的人血管内皮抑素成功制备高滴度的鼠抗人血管内皮抑素多克隆抗体,并由Western blot分析证实。结论：高纯度表达产物及多克隆抗体的制得为今后的研究提供了素材。     

High-level expression of Mycobacterium tuberculosis protein EspB in E. coli and preparation of novel anti-EspB monoclonal antibodies

The ESX-1 secretion system plays a critical role in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. The ESX-1 secreted protein EspB is cleaved close to its C-terminus during secretion and is necessary for inhibiting phagosome maturation. In this study, the EspB gene of M. tuberculosis H37Rv was cloned into the expression vector of pET21a(+) and was effectively expressed in Escherichia coli BL21(DE3). The expressed fusion protein existed as a soluble form in cell lysate and was first purified by a column packed with Ni-NTA resin and then a column packed with DEAE-Sepharose Fast Flow matrix. Using the purified protein to immunize BALB/c mice, five monoclonal antibodies were produced. As shown by ELISA and immunoblotting, the five respective antibodies could recognize the EspB protein. These monoclonal antibodies will provide powerful reagents for further investigation of EspB protein functions.     

人黑素瘤单链抗体-量子点纳米探针的制备及其与黑素瘤细胞特异性结合

目的：制备抗人黑素瘤细胞单链抗体与碲化镉量子点(CdTe guantun dot, CdTe)连接的纳米探针,观察其对恶性黑素瘤细胞的特异性结合效果。方法：将抗人黑素瘤神经节苷脂单链抗体（antihuman melanoma ganglioside single chain variable fragment antibody,GD/ScFvMEL）基因克隆到pET32a（+）载体中,然后在BL21（DE3）细菌中进行诱导表达,采用变性法纯化表达的蛋白,再用改良的透析法复性目的蛋白,SDSPAGE分析表达的GD/ScFvMEL抗体蛋白。制备的GD/ScFvMEL抗体与量子点连接制备成纳米探针GD/ScFvMELQDs,然后与黑素瘤A375细胞株及胃癌MGC803细胞株孵育,观察纳米探针与肿瘤细胞结合的特异性。结果：PCR、双酶切和序列测定证实重组子的拼接完全正确,SDSPADE结果显示,GD/ScFvMEL抗体的表达量达40%。纯化复性后的GD/ScFvMEL抗体连接量子点制备GD/ScFvMELQDs纳米探针,经扫描电镜、X衍射分析、荧光光谱和SDSPAGE分析证实纳米探针的成功制备。GD/ScFvMELQDs纳米探针能特异性结合A375黑素瘤细胞,不与胃癌细胞MGC803细胞结合。结论：成功制备抗人黑素瘤神经节苷脂单链抗体量子点纳米探针,该探针可特异性结合黑素瘤细胞。     

重组天花粉蛋白的原核表达、纯化及其对 宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

 目的克隆天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)的cDNA, 构建原核表达TCS的质粒,从表达菌中分离纯化重组天花粉蛋白（rTCS）后,分析rTCS和nTCS（天然天花粉蛋白）对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法RT-PCR技术从新鲜栝楼叶片中扩增TCS cDNA,测序鉴定后克隆入表达载体pET-28a(+) 并转化入BL21(DE3)细胞。IPTG诱导表达后,用金属镍螯合层析法纯化rTCS蛋白, MTT法分别检测rTCS 和nTCS处理24、48和72h对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。结果1. 成功克隆获得TCS的cDNA并构建 pET-28a (+)-TCS原核表达质粒;该cDNA的碱基序列与基因库中注册的序列99.4%同源;2.在BL21(DE3)菌中,IPTG可诱导重组TCS蛋白表达,且表达的TCS主要以包含体的形式存在。在一定的时间范围内（0～8h）;rTCS的表达水平与诱导时间正相关;3.用Ni-NTA树脂亲和层析法,从诱导表达菌中获得了高纯度的重组TCS蛋白;4. MTT法分析表明,rTCS和nTCS均对HeLa宫颈癌细胞的生长具有抑制作用。在0～100μg/ml的浓度范围内,随着药物浓度的增加及作用时间的延长,rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长抑制率逐渐增大,且各组之间差异有统计学意义（P﹤0.05）;rTCS的IC₅₀小于nTCS。结论本实验克隆了TCS的cDNA,构建了表达载体pET-28a (+)-TCS,并成功地在E.coli中原核表达和纯化出重组TCS蛋白,发现纯化的rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长都有明显抑制作用,并且rTCS的细胞毒性小于nTCS。     

SARS coronavirus nucleocapsid protein monoclonal antibodies developed using a prokaryotic expressed protein

Immunological detection of viruses and their components using monoclonal antibodies (MAbs) is a powerful diagnostic method. Here we report a detailed method for the establishment of MAbs against severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). To express and purify the nucleocapsid protein (N protein) of SARS-CoV and generate MAbs against the N protein, gene encoding N protein was separated into two parts according to the prediction of epitopes and cloned into pET32a(+), respectively. Expression of the target proteins were induced by M isopropyl-β-thio-D-galactopyranoside (IPTG) and purified by a single-step affinity chromatography on a Ni-NTA column. BALB/c mice were immunized with the purified recombinant proteins to prepare MAbs by hybridoma technique. The reactivity and specificity of the MAbs were analyzed by ELISA and Western blot analysis. Seven MAbs against N1 and two MAbs against N2 were obtained. In the present study, recombinant SARS-CoV N protein was expressed and purified and nine specific MAbs against SARS-CoV N protein were obtained successfully. This panel of anti-N MAbs may be used as a tool for rapid and specific diagnosis of SARS-CoV.     

人CIDE-3蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备人诱导细胞死亡的DFF45样效应因子-3(CIDE-3)蛋白兔抗人多克隆抗体并进行鉴定。方法:将原核表达载体pET28a( )/CIDE-3转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达CIDE-3蛋白,经Ni-NTA Agarose纯化后免疫新西兰白兔,获得人CIDE-3蛋白兔抗血清,并通过免疫印迹(Western blot)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及免疫组织化学法对抗体进行鉴定。结果:成功地表达、纯化了人CIDE-3蛋白,与弗氏佐剂乳化后,免疫新西兰白兔,获得高效价的人CIDE-3蛋白兔抗血清,ELISA结果证实该抗体具有较高的亲和性,Western blot及免疫组织化学染色显示证实该抗体能够与人CIDE-3蛋白特异性结合,是一种细胞质蛋白。结论:获得了效价高、特异性较强的人CIDE-3蛋白兔抗血清,为进一步研究人CIDE-3奠定了实验基础。     

抗CEA和CA19-9的单链抗体在HEK293细胞中的融合表达及亲和力鉴定

 目的 在HEK293细胞中高效表达抗CEA scFv和抗CA19-9 scFv两种单链抗体的Fc融合蛋白（anti-CEA scFv-Fc和anti-CA19-9 scFv-Fc），并测定两种单链抗体亲和力。方法 从GenBank中获取两种scFv基因序列；经优化后合成，并与pET32a（+）构成原核表达载体anti-CEA scFv/pET32a（+）和anti-CA19-9 scFv/pET32a（+），在E.coli BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达；两种scFv经PCR扩增技术删除末端终止序列，利用重叠区基因扩增法在anti-CEA scFv上游加入人IL-2信号肽，分别与含人IgG Fc段基因的pTT5载体（Fc/pTT5）构成真核表达载体（anti-CEA scFv（-t）-Fc/pTT5、IL2-anti-CEA scFv（-t）-Fc/pTT5和anti-CA19-9 scFv（-t）-Fc/pTT5）；使用脂质体转染法，将3个重组质粒转入HEK293细胞中进行表达；产物经rProtein-A FF亲和层析纯化，竞争性细胞ELISA和Western blot检测。结果 免疫印迹显示，3个scFv-Fc融合蛋白均在HEK293细胞中表达；竞争结合实验表明，anti-CEA scFv-Fc和anti-CA19-9 scFv-Fc的抗体浓度分别为8.2 nmol/L和6.0 nmol/L。结论 anti-CEA scFv和anti-CA19-9 scFv能在HEK293细胞内表达；虽然表达量较低，但纯化后表达产物能够识别肿瘤细胞表面抗原CEA和CA19-9。     

EXPRESSION OF cDNA FOR RECOMBINANT HUMAN GRANULOCYTE COLONY-STIMULATING FACTOR IN ESCHERICHIA COLI AND CHARACTERIZATION OF THE PROTEIN

Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（ｒｈＧＣＳＦ）ｈａｄｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓａｆａｃｔｏｒｔｈａｔｒｅｇｕｌａｔｅｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔ...     

宫颈癌患者HPV16型E6蛋白的表达纯化及血清抗体检测

背景与目的:人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)是宫颈癌组织中最常见的高危HPV,其相应蛋白的血清抗体与宫颈癌的发生发展相关。本研究构建HPV16E6重组表达载体并表达纯化获得HPV16E6重组蛋白,用于检测不同人群血清相应抗体,初步探讨本地区HPV16E6血清抗体反应与宫颈癌的相关性。方法:将HPV16E6基因与pRSET-A融合表达载体连接,获得E6表达重组体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用异丙基硫代-$-D-半乳糖苷(isopropylthio-$-D-galactoside,IPTG)诱导表达。表达的包涵体变性后经Ni柱纯化,复性并经活性鉴定后,用以包被ELISA板,检测正常女性、慢性宫颈炎患者和宫颈癌患者血清抗体。同时采用荧光偏振方法分型检测宫颈癌组织HPVDNA。结果:pRSET-16E6表达重组体的工程菌经IPTG诱导后可表达Mr24×103的HPV16E6组氨酸融合蛋白,表达量占菌体蛋白的22.3%。表达形式为包涵体,重组蛋白纯度达95%以上,其活性经ELISA法证实。80例正常女性、46例慢性宫颈炎和32例宫颈癌患者血清抗体阳性率分别为5.0%、6.5%和31.2%,宫颈癌患者HPV16E6血清抗体阳性率显著高于正常人(P<0.002)及慢性宫颈炎患者(P<0.01),而正常人与慢性宫颈炎患者间的差异无显著性。32例宫颈癌患者癌组织中,HPVDNA阳性率90.6%,HPV16DNA阳性率46.9%。HPV16DNA阳性组血清HPV16E6抗体阳性率(46.7%)高于阴性组(17.6%),但两组间的差异无显著性(P>0.05)。结论:在pRSET-A/BL21中表达获得的HPV16E6融合蛋白,可用于宫颈癌相关HPV的血清学研究;宫颈癌患者HPV16E6血清抗体阳性率明显高于正常人和慢性宫颈炎患者。