Livin异构体特异性siRNA表达载体的构建及其在SPC-A1细胞中的稳定表达

目的：利用基因转染和RNA干涉（RNA interference．RNAi）技术在肺腺癌SPC-A1细胞株中分别建立2种Livin异构体的基因沉默体系，旨在进一步体外观察两种异构体基因沉默诱导SPC-A1细胞凋亡效应。方法：构建Livin两种异构体小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）表达载体；以电穿孔法转染SPC-A1细胞，经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆；通过半定量RT-PCR和Western blot验证Livin异构体在SPC-A1细胞中的基因沉默效率，建立高效Livin异构体基因沉默体系。结果：成功获得Livin异构体siRNA表达载体，经基因转染以及G418抗性筛选，成功建立Livin异构体特异基因沉默SPC-Al细胞克隆。结论：RNAi能高效特异阻断两种Livin异构体表达，为进一步研究其不同的抗凋亡生物学功能，探讨其作为诱导肺癌细胞凋亡治疗分子靶点以及提高肺癌细胞放化疗敏感性打下基础。     

胶质瘤细胞诱导分化相关基因在胶质瘤组织中的表达

目的 利用已经建立的胶质瘤细胞诱导分化相关基因表达谱，筛选胶质瘤恶性进展相关基因。方法 按分子生物学实验要求，收集经病理确诊的不同恶性程度胶质瘤手术标本，应用反向多点杂交技术制作分子探针，与96个相关基因组成的小芯片杂交检测在不同恶性级别胶质瘤手术标本中的表达情况。结果共有8个基因在各个恶性级别胶质瘤中均呈高表达；有14个基因随胶质瘤恶性程度升高而表达频率呈上升趋势；有6个基因随胶质瘤恶性程度升高表达频率呈下降趋势；筛选到可能与胶质瘤恶性进展有关的新基因有DIP1、RPS7、CLK2、WWOX／FOR、GRIM-19等基因。结论 本研究制作的胶质瘤细胞分化相关基因小芯片，在不同级别胶质瘤组织标本中检测到的表达情况，可进一步用于胶质瘤恶性进展的分子机制研究。     

绿原酸对人胶质瘤细胞U251的抗肿瘤活性及其促凋亡机制

 目的 研究绿原酸对人胶质瘤细胞U251细胞株增殖、凋亡的作用及其机制。方法 培养人胶质瘤U251细胞，不同浓度绿原酸处理细胞48 h后，CCK-8法检测细胞生长抑制率，观察细胞形态学变化；Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡，RT-PCR及Western blot检测p53、Livin、Bcl-2、Bax mRNA和蛋白的表达，Western blot检测Caspase-3蛋白的表达。结果 不同浓度绿原酸干预U251细胞48 h后显著抑制细胞的增殖活性，促进细胞凋亡，并且能够上调p53和Bax基因，下调Livin、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达，促进Caspase-3蛋白的表达。结论 绿原酸可能是通过上调p53和Bax的表达，下调Livin和Bcl-2的表达，激活Caspase-3蛋白，最终诱导U251细胞凋亡。     

Livin异构体特异性基因沉默诱导肺腺癌SPC-A1细胞凋亡

目的:利用基因转染和RNA干涉(RNAi)技术,在SPC-A1细胞中建立Livin异构体α和β特异的基因沉默体系,探讨其在诱导SPC-A1细胞凋亡效应中的不同作用及价值。方法:在肺腺癌SPC-A1细胞中稳定表达Livinα β、Livinα和Livinβ特异性小干涉RNA(siRNA),观察SPC-A1细胞形态、增殖等生物学行为的改变,TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:Livinα β、Livinα和Livinβ基因沉默后,SPC-A1细胞克隆形成能力较对照组显著下降(P<0.05);转染后SPC-A1细胞发生凋亡,TUNEL法显示细胞凋亡指数分别为(9.20±1.90)%、(6.75±1.20)%和(4.82±1.20)%,(流式细胞仪检测)细胞凋亡率分别为(7.48±1.30)%、(5.50±0.90)%和(4.16±0.70)%。结论:Livinα和β两种异构体均能作为诱导肺癌细胞凋亡的分子靶点,Livin基因沉默靶向诱导肺癌细胞凋亡可能作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。     

苯乙酸对胶质瘤细胞中HoxA10基因mRNA表达的影响

目的：观察苯乙酸（PA）诱导分化胶质瘤细胞C6过程中，同源盒基因HoxA3和HoxA10mRNA水平表达的变化。方法：应用逆转录PCR（RT-PCR）厦图像分析法。分组检测原代培养的大鼠星形胶质细胞中厦应用PA前后胶质瘤细胞C6中HoxA3和HoxA10基因mRNA水平表达。结果：HoxA3基因在正常大鼠脑组织和应用PA前后的胶质瘤C6细胞中，均存在明显表达，图像分析显示各组间差异无显著性。HoxA10基因在正常大鼠脑组织中未见表达；在胶质瘤C6细胞中存在明显表达；应用0、5mmol／LPA后，胶质瘤C6细胞中HoxA10基因弱表达，与未用药的C6细胞比较，图像分析显示差异有显著性（P〈0.05）；应用1．0mmol／LPA后，HoxA10基因未见表达，与未用药的C6细胞比较，图像分析显示差异有显著性（P〈0．01）。结论：苯乙酸抑制胶质瘤细胞增殖的作用机理可能与降低胶质瘤细胞HOXA10基因mRNA水平表达有关。     

转染Livin基因后骨肉瘤细胞系的多药耐药性研究

目的:探讨转染Livin基因后人骨肉瘤细胞的多药耐药变化.方法:采用基因重组技术构建Livin 基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin ,经酶切和基因测序分析对构建结果进行鉴定;通过脂质体将含Livin基因的表达载体转染人骨肉瘤细胞U-2OS,RT-PCR检测基因转录水平;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞在不同化疗药物作用下的细胞耐药性.结果:经酶切鉴定和基因测序分析证明真核表达载体pcDNA3.1(+)/Livin 构建成功.将该表达载体转染U-2OS细胞后,Livin基因的表达水平与野生型U-2OS细胞和转染空载体的U-2OS/neo细胞相比显著提高(P<0.01) .与U-2OS细胞和U-2OS/neo细胞相比,U-2OS/Livin细胞对ADM、CTX、MMC和DDP等化疗药物的耐药性也明显增强(P<0.01).结论:Livin基因高表达是人骨肉瘤多药耐药的原因之一.     

siRNA沉默Livin基因表达在抑制裸鼠肝癌生长中的作用研究

目的目的应用RNA干扰技术抑制人肝癌细胞株MHCC97H中凋亡抑制因子Livin的表达,研究Livin基因在抑制裸鼠肝癌细胞移植瘤生长中的作用。方法设计针对Livin基因目标序列的siRNA,将其经脂质体Lipofectamine~(TM)2000转染至肝癌细胞株MHCC97H细胞,采用RT-PCR、Westernblot方法检测转染后的MHCC97H细胞中Livin基因的mRNA和蛋白质表达。通过建立裸鼠的荧光素酶(Luciferase)标记的MHCC97H肝癌细胞移植瘤模型,监测肿瘤体积、重量,通过活体成像技术观察siRNA注射治疗移植瘤的效果。结果在Livin-siRNA转染后的MHCC97H细胞中,Livin基因的mRNA和蛋白质表达显著下降(P0.05),siRNA注射治疗移植瘤后,肿瘤重量、体积及荧光素酶信号均显著性下降(P0.05)。结论通过RNA干扰技术阻断MHCC97H细胞中Livin的表达,可抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长,提示Livin基因在肝癌的发生、发展过程中起重要作用。     

Livin异构体特异性shRNA对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

目的：应用构建成功的Livin异构体（BIRC71，BIRC72）短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）真核表达载体转染Hela细胞，探讨其对Livin基因的沉默效应及诱导Hela细胞凋亡的作用。方法：采用脂质体转染法转染Hela细胞，荧光实时定量PCR、Western blotting检测转染前后宫颈癌Hela细胞Livin基因拷贝数和蛋白表达的变化，将shRNA表达载体流式细胞术检测不同时间（24、48、72h）的细胞凋亡率。结果：真核表达载体的转染效率48h较24、72h高；转染pGenesil-1-BIRC71、pGenesil-1-BIRC72后Hela细胞中Livin拷贝数明显减少（P〈0．05），蛋白质表达水平显著降低（P〈0．05）；流式细胞术检测24、48、72h凋亡率，转染LivinshRNA组细胞的凋亡率显著高于对照组（P〈0．05），随时间延长（24→72h）凋亡率相应增加。结论：靶向Livin的shRNA真核表达载体可以有效特异地阻断Livin基因的表达，明显诱导宫颈癌细胞凋亡。     

细胞周期特异性Survivin启动子在胶质瘤细胞T98G中活性的初步研究

目的　研究在细胞周期G2 /M期特异性的Survivin基因启动子在多型性胶质母细胞瘤 (glioblastomamultiform ,以下简称胶质瘤 )细胞株T98G中的活性 ,为该启动子在胶质瘤靶向性基因治疗中的应用提供依据。方法　用RT PCR法检测Survivin基因在胶质瘤细胞株T98G及正常肝中的表达 ,用转染荧光素酶报告基因的方法 ,比较不同长度的Survivin基因启动子在非同步化和阻断于G1期细胞中的活性。结果　Survivin基因在T98G胶质瘤细胞中表达 ,而在正常肝细胞中不表达。Survivin基因启动子在非同步化细胞中的活性大约是G1期细胞中的 11倍。结论　Survivin启动子在转录水平上可以选择性地使报告基因在胶质瘤细胞中表达 ,这使它成为一个在胶质瘤基因治疗中有潜力的启动子。     

转染Livin基因对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响的研究

目的:观察凋亡抑制蛋白Livin对于膀胱癌细胞系增殖和凋亡的影响.方法:采用脂质体转染法将Livin基因转入膀胱癌T24细胞系,经G418筛选后获得稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin 及仅转染载体的T24/pcDNA3.1( ).应用Western blot RT-PCR法来检测Livin 在转染细胞中的表达;应用克隆形成试验检测细胞增殖活性;用丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)分别作用转染前后的膀胱癌细胞系24 h,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测转染前后细胞生长抑制率,应用流式细胞仪(FCM)及吖啶橙(AO)染色检测细胞凋亡.结果:成功建立了稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin 及T24/pcDNA3.1( ).Western blot及RT-PCR法检测结果表明Livin在T24/Livin 中表达阳性,而在T24与T24/pcDNA3.1( )中表达阴性.Livin的表达导致了膀胱癌细胞系更强的细胞增殖能力(P<0.01); 经MMC作用24 h后,T24/pcDNA3.1( )与T24的细胞凋亡率分别为(21.38±2.27)%和(19.60±2.31)%,而T24/Livin 的细胞凋亡率则为(8.65±1.47)%,Livin表达阳性的细胞较阴性组的细胞凋亡率明显减少,差异有统计学意义,P<0.01.结论:Livin基因在膀胱癌细胞系T24中可以诱导细胞增殖,并赋予其在化疗中具有更强的抗凋亡能力.     

Livin异构体基因沉默对肺腺癌SPC-A1 细胞化疗增敏效应研究

背景与目的 前期研究发现,凋亡抑制蛋白家族(IAP)新成员Livin尤其是Livinα,参与肺癌的发生发展,是肺癌细胞化疗耐药的重要机制之一.本研究的目的是利用基因转染和RNA干涉(RNAi)技术,在肺腺癌SPC-A1细胞中建立Livin异构体α和β特异的基因沉默体系,探讨其对增加SPC-A1细胞化疗敏感性的不同作用及价值.方法 在SPC-A1细胞中稳定表达Livinα β、Livinα和Livinβ特异性小干涉RNA(siRNA),体外实验用甲基偶氮唑蓝(MTT)法,研究Livin基因沉默后SPC-A1细胞对化疗药物的敏感性改变;体内实验利用荷瘤裸鼠模型,研究Livin基因沉默后荷瘤小鼠对顺铂的敏感性改变.结果 Livinα β、Livinα和Livinβ基因沉默后,SPC-A1细胞对顺铂、卡铂、环磷酰胺、阿霉素等多种化疗药物敏感性增加(P＜0.05),其中,Livinα β基因沉默能更有效增加肺癌细胞化疗敏感性(P＜0.01).动物实验表明,pSilencer-Livinα β组、pSilencer-Livinα组和pSilencer-Livinβ组抑瘤率分别为146.1%、130.7%、110.5%.结论 Livin异构体尤其是Livinα β可作为肺癌细胞化疗增敏的分子靶点,其基因沉默有望成为非小细胞肺癌基因治疗新手段.     

乳腺癌中Livin的表达与癌细胞凋亡相关性的研究

目的:探讨凋亡抑制基因Livin在乳腺癌组织中的表达与细胞凋亡的关系.方法: 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测乳腺癌组织中Livin mRNA的表达,并用western blot分析Livin蛋白的表达.应用流式细胞术检测乳腺癌细胞的凋亡水平.结果: 40例乳腺癌组织中有26例Livin表达,阳性率为 65.00%,而13例癌旁正常乳腺组织中Livin低表达,阳性率为15.39%(P<0.01).40例乳腺癌组织中,26例乳腺癌组织Livin表达阳性者,肿瘤细胞早期细胞凋亡率为(4.27±0.72)%;14例Livin表达阴性者,肿瘤细胞早期细胞凋亡率为(4.56±0.76)%,两者比较差异有显著性(P<0.05).结论: Livin在乳腺癌组织中的异常表达与乳腺癌细胞凋亡有关,有望成为乳腺癌基因治疗的新靶点.     

Livin异构体特异性shRNA对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

目的: 应用构建成功的Livin异构体(BIRC71, BIRC72)短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）真核表达载体转染Hela细胞，探讨其对Livin基因的沉默效应及诱导Hela细胞凋亡的作用。方法: 采用脂质体转染法转染Hela细胞，荧光实时定量PCR、Western blotting检测转染前后宫颈癌Hela细胞Livin基因拷贝数和蛋白表达的变化，将shRNA表达载体流式细胞术检测不同时间（24、48、72 h）的细胞凋亡率。结果: 真核表达载体的转染效率48 h较24、72 h高；转染pGenesil1BIRC71、pGenesil1BIRC72后Hela细胞中Livin拷贝数明显减少（P<0.05），蛋白质表达水平显著降低（P<0.05）；流式细胞术检测24、48、72 h凋亡率，转染Livin shRNA组细胞的凋亡率显著高于对照组（P<0.05），随时间延长（24→72 h）凋亡率相应增加。结论: 靶向Livin的shRNA真核表达载体可以有效特异地阻断Livin基因的表达，明显诱导宫颈癌细胞凋亡。     

凋亡抑制蛋白Livin在食管癌中的研究进展

Livin是新近发现的人类IAP家族成员,为类内源性细胞凋亡抑制蛋白,Livin在多种肿瘤细胞中高表达,通过抑制caspase在许多物种中起着抑制细胞凋亡的作用.近年来人们发现Livin特异性表达于食管癌细胞中,通过下调或抑制Livin基因的表达及诱导产生特异性地识别Livin的抗体可抑制、杀死肿瘤细胞,为食管癌的诊断、细胞和基因靶向治疗等提供新的方法.     

Livin基因RNAi表达载体的构建及其沉默效应观察

目的:构建针对人Livin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并观察该载体对Livin基因表达的沉默效应.方法:设计并合成4个Livin靶向的发夹状siRNA靶序列,退火后分别连接入pGCL-GFP慢病毒表达载体,转化,扩增后测序.以含有Livin基因的质粒为模板,扩增Livin基因cDNA序列的特异性片段,连接,克隆入真核表达载体pdsRED2-N1-3FLAG.将构建好的Livin基因过表达克隆质粒和不同靶点的RNAi表达载体质粒,经lipfectamine2000包裹,共转染人人293T细胞,Western blot和荧光显微镜检测Livin蛋白的表达情况,判断不同靶点的干扰效果.结果:Livin基因RNAi的表达载体pGCL-GFP-shLivin和Livin基因过表达载体pdsRED2-N1-Livin的阳性克隆序列正确.人293T细胞Livin蛋白表达90%被阻断.结论:成功构建高效阻断Livin基因表达的RNAi慢病毒表达载体,为应用RNAi进一步研究Livin基因的生物学功能奠定基础.     

脑肿瘤

周期蛋白依赖性激酶1在胶质瘤组织中的表达及其沉默对胶质瘤细胞恶性表型的影响；矢状窦旁脑膜瘤的手术治疗；经脑沟入路切除中央区肿瘤（附24例临床分析）；婴幼儿后颅凹肿瘤43例临床分析；内镜下切除伴有蝶窦变异的垂体瘤手术中神经导航的应用；昕神经瘤手术并发症的防治体会（附119例报告）；     

RNA干扰Livin 基因表达增强骨肉瘤MG-63 耐药细胞对多柔比星的化疗敏感性

目的：研究凋亡抑制蛋白基因Livin 在逆转骨肉瘤耐药中的作用。方法：应用多柔比星逐步诱导法诱导人骨肉瘤MG-63 细胞建立耐药细胞株,MTT实验检测耐药细胞株的耐药指数,Western blotting 法检测MG-63 细胞和耐药细胞中Livin 蛋白表达的差异。构建Livin shRNA 真核表达载体,应用LipofectmineTM 2000 转染至耐药骨肉瘤细胞中,Real-time PCR 和Western blotting 分别检测Livin shRNA转染前后MG-63 耐药细胞中Livin 基因和蛋白表达的变化,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,MTT法检测对多柔比星化疗敏感性的变化。结果：成功构建重组质粒pSilencer3.1-H1 neo-Livin si。诱导的耐药细胞MG-63/R 对多柔比星的耐药指数为81.32±5.33。Livin shRNA可抑制MG-63 细胞中Livin 基因和蛋白表达,明显低于空白对照组和非特异性转染组（分别下调72%和69%,P<0.05）。特异性转染Livin shRNA组MG-63/R 细胞的凋亡率显著高于未转染组和非特异性转染组[(22.4±3.2)% vs (4.2±1.1)% 、(4.7±0.6)%,P<0.05]。3 组细胞在加入多柔比星后增殖均受到不同程度的抑制,且呈明显的时间-效应关系,但特异性转染组细胞的存活率均显著低于其他两组（P<0.05）。结论：应用RNA干扰技术下调Livin 的基因表达可有效促进耐药MG-63 骨肉瘤细胞的凋亡,从而增加其对化疗药物的敏感性。     

乳腺癌中Livin的表达与癌细胞凋亡相关性的研究

目的：探讨凋亡抑制基因Livin在乳腺癌组织中的表达与细胞凋亡的关系。方法：采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测乳腺癌组织中LivinmRNA的表达,并用westernblot分析Livin蛋白的表达。应用流式细胞术检测乳腺癌细胞的凋亡水平。结果：40例乳腺癌组织中有26例Livin表达,阳性率为65．00％,而13例癌旁正常乳腺组织中Livin低表达,阳性率为15．39％（P〈0．01）。40例乳腺癌组织中,26例乳腺癌组织Livin表达阳性者,肿瘤细胞早期细胞凋亡率为（4．27±0．72）％;14例Livin表达阴性者,肿瘤细胞早期细胞凋亡率为（4．56±0．76）％,两者比较差异有显著性（P〈0．05）。结论：Livin在乳腺癌组织中的异常表达与乳腺癌细胞凋亡有关,有望成为乳腺癌基因治疗的新靶点。     

颅脑

表达VEGFR-2的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗诱导特异性抗胶质瘤血管免疫应答；脑星形细胞瘤MRI定量参数评价血管内皮生长因子表达的价值；133例经单鼻孔蝶窦入路治疗垂体腺瘤的经验；神经导航系统在颅内病变活检术中的应用；磁共振成像3种增强新技术在颅内肿瘤诊断中的应用；经鼻内镜颅底病变的外科手术；神经内镜下经鼻蝶窦入路垂体腺瘤切除术（附36例报告）；核磁共振脑功能成像指导切除脑功能区肿瘤（附6例报告）；功能区胶质瘤的术中直接电刺激判断核心手术技术。[编者按]     

胶质瘤BOLD-fMRI临床应用研究现状

目的：总结国内外血氧水平依赖性功能磁共振（blood oxygenation level dependant functional magnetic resonance imaging,BOLD-fMRI）在胶质瘤患者治疗中的应用。方法：应用PubMed及CNKI期刊全文数据库检索系统,以“血氧水平依赖性功能磁共振、胶质瘤、治疗”为关键词,检索2008-01-2014-01的中英文相关文献。纳入标准：1）BOLD-fMRI在胶质瘤外科手术中的应用;2）BOLD-fMRI在胶质瘤放疗中的价值。符合分析的文献41篇。结果：BOLD-fMRI立体功能成像所获得结果与术中对大脑皮层进行电刺激所获得的结果具有较高的一致性,能够在术前能准确直观的显示运动及语言等功能区位置,评估手术的可行性。并且通过术中解剖和功能定位联合神经外科手术导航仪进行术中导航,在治疗过程中有效的避开重要的脑部功能区,提高了手术方案的准确性,缩短了手术时间并同时最大化切除胶质瘤。根据胶质瘤患者手术前后无创的BOLD-fMRI图像对比,能够全面评估手术效果及判断其预后,为术后放疗靶区的勾画及计划的制定提供重要的参考信息。结论：BOLD-fMRI是一种能够灵敏、准确评价脑局部区域血氧水平的磁共振功能影像技术,在胶质瘤手术治疗的选择、放疗计划的制定以及判断预后等方面具有潜在的临床意义。