蛋白激酶C与培养神经元缺氧后caspase-3表达及细胞凋亡关系的研究

目的 探讨蛋白激酶C（PKC）对神经元缺氧调亡的影响及作用机制。方法 建立体外培养Wistar胎鼠皮层神经元模型及培养神经元缺氧模型,用3种不同浓度的PKC催化亚基特异性抑制剂Calphostin C预孵育培养神经元后进行缺血处理,观察神经元下述指标的改变;神经元存活率、caspase-3（CPP32）和细胞凋亡的规律。结果 随着缺氧时间的延长和Calphostin C浓度的增加,培养神经元的存活数量显著下降、caspase-3和TUNEL荧光染色阳性率及平均荧光强度均显著升高。结论 ①PKCt caspase-3均参与了缺氧神经元调亡;②PKC抑制剂Calphostin C可加重缺氧神经元凋亡;且该作用是通过caspase-3信号转导途径实现的。③PKC的激活在缺氧神经元凋亡中起保护作用。     

大鼠海马神经元缺氧/复氧后caspase-3活性的变化

目的：研究caspase-3在体外培养的海马神经元缺氧／复氧损伤中的作用及其抑制剂的干预效果，为缺血性脑损伤的治疗提供实验资料。方法：诱导体外培养的大鼠海马神经元缺氧3h，再复氧12－4，并在缺氧前1h用不同剂量的caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CMK进行干预处理，应用MTT比色法测定细胞存活率，底物裂解法caspase-3活性。结果：缺氧／复氧后大鼠海马神经元存活率逐渐降低，caspase-3活性明显增强，复氧24h达高峰；用Ac-DEVD-CMK预处理的海马神经元caspase-3活性降低，细胞存活率增高，并呈剂量依赖性。结论：体外培养的大鼠海马神经元缺氧及缺氧／复氧后出现迟发性死恨，caspase-3介导的细胞凋亡机制在这种损伤过程中起一定的作用，通过抑制其活性可产生神经保护作用。     

脑缺血后大脑皮质神经元NT-3的表达变化

为探讨NT－3与局灶性脑缺血后大脑皮质神经元损伤修复的关系。采用免疫组织化学ABC法观察了缺血1h后大鼠大脑皮质NT－3的变化。结果：NT－3样免疫阳性反应物主要分布于大脑皮质第3，5层的神经元，脑缺血1h后，NT－3在皮质神经元的表达明显减少（P＜0．05），提示NT－3可能通过不同于其它生长因子的调节方式参与脑缺血后大脑皮层神经细胞的损伤修复。     

硫氧还蛋白对缺氧/复氧大鼠海马神经元caspase-3活性的影响

目的：探讨硫氧还蛋白（Trx)和caspase-3在鼠海马神经元缺氧／复氧损伤中的作用。方法：原代培养10d的新生鼠海马神经元缺氧3h复氧12h,24h和48h，分为正常对照组、缺氧／复氧组和Trx组，用MTT比色法测定各时点的神经元存活率；底物裂解法检测caspase-3活性。结果：缺氧／复氧组海马神经元复氧12－48h，海马神经元caspase-3样蛋白酶活性明显增高，以复氧24h为最高，而存活率进行性下降；Trx组caspase-3样蛋白酶活性曲线与缺氧／复氧组相似，但明显下降，细胞存活率较缺氧／复氧组明显提高。结论：海马神经元缺氧／复氧后，caspase-3样蛋白酶被激活，参与神经元损伤过程；Trx对神经元有保护作用。     

缺氧缺血新生鼠脑caspase-3活性的变化

目的 了解缺氧缺血对新生鼠脑组织caspase-3活性的影响并探讨其意义。方法 7d龄Wistar大鼠分为假手术组、缺氧缺血脑损伤(HIBD)组。HIBD组新生鼠行左颈总动脉结扎后，吸入氧氮混合气(氧浓度为8％)1L／min持续2h。于1、12、24、48h取脑组织在低温下进行匀浆，离心后取上清用四肽荧光底物法测定其荧光强度。结果 HIBD后1h caspase-3活性已升高，24h达高峰，48h明显下降。各时间点左侧脑组织荧光强度之间比较，差异有显著性；各时间点与假手术组比较，左侧脑组织荧光强度差异有显著性。结论 HIBD新生鼠脑组织中caspase-3明显激活。可能为临床新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)脑损伤的重要原因。     

大鼠脑出血后神经元凋亡与caspase-3表达的关系

目的　研究大鼠实验性脑出血模型中神经细胞凋亡发生的规律以及与caspase 3表达的关系 ,观察caspase抑制剂zVADfmk对出血性脑损伤的保护作用。方法　应用立体定向技术 ,将自体不凝血注入大鼠尾状核区制备脑出血模型 ,将动物随机分为假手术组、出血组和zVADfmk干预组 ,分别在不同时间点断头取脑 ,连续切片作TUNEL染色和caspase 3免疫组化染色。 结果　脑出血后 6h血肿内部及周边组织出现TUNEL阳性细胞 ,72h达高峰 ,2周时仍有少量表达 ;caspase 3在脑出血后 6h表达明显增高 ,2 4h达到高峰 ,各组与假手术组之间差异显著 (P <0 .0 5 )。脑出血后的TUNEL阳性细胞与caspase 3的表达呈正相关 (r =0 .6 0 7,P <0 .0 5 ) ,且caspase 3的高峰时间早于凋亡的发生。经caspase 3抑制剂干预 ,血肿周围组织TUNEL阳性细胞明显减少 ,与对照组相比差异显著 (P <0 .0 5 )。结论　凋亡机制参与了脑出血后继发性损伤的过程 ,而caspase 3的激活在其中起着重要作用 ,通过阻断caspase的激活可以减少脑出血后神经细胞凋亡的发生     

缺血神经元损伤修复相关基因转录产物mRNA的研究

脑缺血的基因治疗与传统的药物治疗相比有其独特的优势。基因转移可高效、长程、稳定地发挥作用,并且反义核酸治疗具有剂量调节效应,容易控制治疗进程。但现阶段的基因治疗带有一定程度的盲目性,即只注重用于治疗的某基因是否有助于对抗损伤或有利于修复而改善功能,却忽视了该基因正常状态下的表达水平及缺血缺氧后其表达程度的动态变化。     

挤压伤脊髓腹角神经元NT-3表达的变化

运用免疫组化ＡＢＣ法探讨了脊髓挤压伤后不同时间腹角ＮＴ－３的表达变化。结果：对照组可见ＮＴ－３免疫反应阳性细胞分布于腹角的大神经元和少量小神经元,胞核、胞浆均染色。此外,亦见少量阳性胶质细胞。     

大鼠海马神经元缺氧/复氧后caspase-3活性的变化

细胞凋亡过程是受基因调控的级联反应过程 ,其中caspase -3在此过程中起关键作用 ,它可促进脑部发育过程中的神经元死亡 ,在缺血性脑损伤中也起重要作用。本研究应用培养的海马神经元 ,观察在缺氧或缺氧再复氧后不同时间caspase -3活性的动态变化及caspase -3抑制剂预处理对其影响 ,研究caspase -3在体外培养的海马神经元缺氧 /复氧损伤中的作用及其抑制剂的干预效果 ,为缺血性脑损伤的在体针对性治疗提供一定的实验研究资料。取当天出生 (P1)的SD大鼠 ,分离海马神经元进行体外培养。诱导体外培养 10d的大鼠海马神经元缺氧 3h ,再复氧 12～ 48h ,并在缺氧前 1h用不同剂量的caspase -3抑制剂Ac -DEVD -CMK进行干预处理 ,同时用溶剂DMSO处理进行对照 ,应用MTT比色法测定细胞存活率 ,底物裂解法检测caspase -3样蛋白酶活性。用方差分析 (ANOVA)进行统计学分析处理。结果发现 ,缺氧 /复氧后大鼠海马神经元存活率逐渐降低 ,caspase -3活性明显增强 ,复氧2 4h达高峰 ;溶剂DMSO处理后神经元存活率及caspase -3活性与缺氧 /复氧神经元相比无显著性差异 ;用Ac -DEVD -CMK预处理的海马神经元caspase -3活性降低 ,细胞存活率增高 ,并呈剂量依赖性 ,但抑制caspase -3样蛋白酶的活性并不能完全逆转神经元的死亡。本研     

雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠神经元caspase3和caspase9蛋白表达的影响

目的 :通过检测海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达,探讨雷公藤内酯抑制神经元凋亡的机制。方法 :结晶紫染色观察海马神经元形态,免疫组化法检测海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平。结果 :结晶紫染色结果显示,海人酸组中,海马神经元变性或丢失,胞体皱缩,形态不规则。雷公藤内酯干预组中海马神经元的数量和形态与对照组相似,胞浆清晰淡染,核仁清楚。免疫组化染色显示,与对照组比较,海人酸组海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平显著增高(P<0.05);与海人酸组相比,雷公藤内酯干预组神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平显著减少(P<0.05)。结论 :雷公藤内酯可下调海人酸致痫大鼠海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达,从而抑制神经元凋亡。     

全身亚低温对脑缺血再灌流损伤神经细胞凋亡及Caspase-3的影响

目的 探讨亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌流后神经细胞凋亡及Caspase-3基因表达的影响。方法 应用原位末端标记(TUNEL)和原位杂交技术分别观察亚低温组、常温组脑缺血再灌流不同时间点神经细胞凋亡的变化及Caspase-3 mRNA的表达。结果 (1)常温组脑缺血再灌流后凋亡神经细胞主要分布于缺血周围区，随着再灌流时间的延长凋亡细胞数逐渐增加，至24小时达高峰，2天后开始下降，14天时仍高于假手术组；(2)亚低温组脑缺血再灌流后，凋亡神经细胞也主要位于缺血周围区，数量相对较少，其变化规律与常温组相似，同一时间点相比较，亚低温组均显著低于常温组；(3)常温组脑缺血再灌流2小时后，神经细胞Caspase-3 mRNA开始表达，并随着再灌流时间的延长而增强，24小时达高峰，2天后逐渐下降，至14天略高于假手术组；(4)亚低温组脑缺血再灌流后，神经细胞Caspase-3 mRNA的表达也主要位于缺血周围区，其变化规律与常温组相似，同一时间点相比较，亚低温组均显著低于常温组。结论 脑缺血再灌流后。缺血周围区神经细胞的凋亡是一个动态的渐进过程，Caspase-3基因在介导脑缺血损伤神经元凋亡过程中起关键作用。亚低温对短暂性脑缺血后的神经元凋亡有明显的抑制作用，亚低温可能通过Caspase-3 mRNA途径抵抗脑缺血损伤。     

氧-糖剥夺致皮层神经元一氧化氮的变化及对Caspase-3的影响

目的 观察氧-糖剥夺致皮层神经元一氧化氮(NO)的变化及对Caspase-3的影响.方法 体外原代培养神经元,选取培养7d的神经元随机分为3组:正常对照组(A组),氧-糖剥夺损伤组(B组),细胞损伤+L-N-硝基精氨酸甲脂(L-NAME)干预组(C组).采用硝酸还原法检测各组培养液中NO的含量,Western blot检测Caspase-3、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)蛋白表达,半定量RT-PCR检测Caspase-3 mRNA表达.结果 B组培养液中NO的含量为(1.77±0.17) μmoL/L,与A组(0.93±0.15) μmoL/L和C组(0.99±0.10) μmol/L比较差异有统计学意义(均P＜0.05);同时,B组的Caspase-3蛋白和mRNA表达明显高于A组和C组,B组的NSE蛋白表达明显低于A组和C组.结论 氧-糖剥夺可导致皮层神经元NO产生过量,并造成神经元的损伤;L-NAME能减少NO的产生,从而减弱氧-糖剥夺导致皮层神经元损伤.     

Caspase-3在心衰兔模型细胞凋亡过程中的变化

目的 研究caspase-3在导管术致超容量负荷型心衰兔模型细胞凋亡中的变化.方法 运用导管术造成兔的超容量负荷型心衰模型,然后分别于造模后24 h和造模后7 d处死兔,取心脏组织做电镜检查;通过流式细胞仪检测心肌细胞凋亡情况、caspase-3试剂盒检测其活性、Western blot法检测caspase-3 蛋白水平的表达.结果 ①电镜检查表明:正常组心内膜完整无损伤,有少量红细胞附着;造模24 h后和造模7 d后均出现大量红细胞附着和血栓,且造模7 d的血栓较造模24 h减少.② AnnexinV联合PI染色结果表明:正常组凋亡率较低(3.72±1.92)%,随着时间推移,凋亡细胞所占比例呈上升趋势,造模7 d(10.73±2.27)%明显高于造模24 h(7.62±1.70)%.③Caspase-3活力测定:随时间推移,caspase-3活力呈上升趋势,造模7 d明显高于造模24 h,指数分别为2.7±0.31和2.15±0.32.④Western Blot检测结果表明:正常组基本检测不到激活的caspase-3蛋白酶,在造模后24 h和造模后7 d caspase-3蛋白酶均有明显表达, 但造模7 d有所下降.结论 超容量负荷型心衰兔模型的细胞凋亡与caspase-3有密切相关.     

奥沙利铂致大鼠后根神经节神经元凋亡及对Caspase-3的影响

目的：探讨奥沙利铂致大鼠后根神经节神经元凋亡及对Caspase-3表达的影响。方法：采用20mg/kg3、0 mg/kg剂量的奥沙利铂腹腔注射48只Wistar雄性大鼠,于注射后0、12 h,1、2、3、7 d取后根神经节,经光镜、免疫组化技术,研究奥沙利铂致大鼠后根神经节神经元凋亡的特点、Caspase-3表达。结果：20mg/kg组大鼠后根神经节神经元在1～2 d观察到神经节边缘有少量凋亡神经元;而30 mg/kg组腹腔注射后12 h～2 d,凋亡的细胞进行性增多,2 d达高峰,3 d后明显减少,凋亡的神经元大多在神经节周边;5～8d大鼠全身衰竭明显,全部死亡。凋亡的细胞核染色质浓缩、边集。注射1～2 d,Caspase-3于神经元胞浆中表达进行性增加,2 d达高峰,3 d基本恢复至正常水平。结论：细胞凋亡是奥沙利铂致大鼠后根神经节神经元死亡的主要方式,Caspase-3表达增加,参与后根神经节神经元凋亡的过程。     

葛根素对大鼠肝缺血再灌注后Caspase-3和Bcl-2表达的影响

目的：探讨葛根素对肝缺血再灌注损伤Caspase-3、Bcl-2表达及肝细胞凋亡的影响。方法：建立大鼠肝脏部分缺血再灌注模型,以葛根素预处理,免疫组化法检测Caspase-3和Bcl-2表达,透射电镜观察肝细胞凋亡的超微结构改变。结果：肝缺血再灌注后发生了显著的细胞凋亡现象,Caspase-3表达升高,Bcl-2蛋白表达减少,6h恢复正常,其后逐渐升高。葛根素预处理使细胞凋亡明显减轻,Caspase-3表达明显下降,Bcl-2持续高表达。结论：葛根素可上调Bcl-2的表达,抑制Caspase-3的表达,减少肝细胞凋亡,对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用。     

大鼠永久性脑缺血及缺血再灌注后半暗带caspase—3 mRNA表达变化

目的 研究大鼠永久性脑缺血及缺血再灌注半暗带caspase-3转录水平表达规律。方法 用插线法建立大鼠局灶性脑缺血及再灌注模型,剥取缺血半暗带及中心区皮质组织,采用半定量逆转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）,测定永久性缺血和缺血1．5h再灌注各时间段caspase-3 mRNA水平的变化。结果 永久性缺血组皮质半暗带在缺血8h caspase-3 mRNA开始升高,24h达到峰值,1周恢复正常水平。缺血中心区早期caspase-3 mRNA无明显变化,缺血24h时低于正常。再灌注组半暗带缺血后8h后升高,16h达到高峰并持续至24h。再灌注组caspase-3 mRNA峰值高于永久缺血组,两者具有显著性差异。结论 局灶性脑缺血半暗带caspase-3 mRNA上调,再灌注可诱导caspase-3 mRNA表达。     

局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑皮质中Caspase-3蛋白的表达

目的：观察局灶性脑缺血再灌注（FCIR）大鼠大脑皮质Caspase-3的表达。方法：雄性SD大鼠42只，分为假手术组和缺血再灌注（IR）组，IR组又分为缺血2h再灌注2h、6h、12h、24h、48h、72h组，每组6只。IR组采用线栓法建立FCIR模型，假手术组仅插线1cm；于脑视交叉平面向后7～11mm处取脑组织。HE染色观察各个时间点细胞形态学变化，免疫组织化学SP法观察不同时间Caspase-3的表达，TUNEL法检测细胞凋亡。结果：脑缺血2h再灌注6hCaspase-3表达升高，再灌注24h达到高峰，再灌注72h开始下降。凋亡细胞数的变化与Caspase-3表达变化一致。结论：Caspase-3参与了脑缺血再灌注神经元的死亡过程，该作用可能与细胞凋亡有关。     

Caspase-3蛋白在喉癌中的表达及其临床意义

目的研究喉癌中Caspase-3的表达与相关病理生物学行为及其对临床预后的影响。方法应用免疫组化法检测68例原发喉癌组织中Caspase-3基因蛋白的表达情况。结果68例喉癌中Caspase-3呈阳性反应34例,占50.0%。其中,48例声门上型喉癌中呈现Caspase-3阳性反应占45.83%(22/48),20例声门型喉癌占60.0%(12/20);Caspase-3的阳性表达与喉癌颈淋巴结转移呈负相关。结论Caspase-3在喉癌中低表达,其原位检测对喉癌淋巴结转移和预后估计具有参考价值。     

芦荟多糖对脑缺血大鼠Caspase-3蛋白表达的影响

目的探讨芦荟多糖对局灶性脑缺血大鼠的神经保护作用机制。方法采用线栓法阻断大鼠一侧大脑中动脉(MCAO),制备局灶性脑缺血模型,观察芦荟多糖对MCAO模型大鼠脑缺血后神经功能缺损导致的行为变化,用免疫组化法检测大脑皮质细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。结果芦荟多糖能抑制MCAO模型大鼠大脑皮质Caspase-3蛋白的表达。结论芦荟多糖对大鼠局灶性脑缺血具有保护作用,其机理与其影响、抑制Caspase-3的表达有关。     

Caspase-3与Caspase-6蛋白在肾透明细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨Caspase-3、Caspase-6蛋白在肾透明细胞癌（RCCC）的表达及与预后的关系。方法采用免疫组化（SP法）对75例RCCC及其癌旁组织、15例正常肾组织标本中的Caspase-3、Caspase-6蛋白的表达进行研究，分析与RCCC临床病理特征及其术后生存率的关系。结果Caspase-3蛋白在RCCC中阳性表达率低于癌旁对照组，差异有显著性（P〈0．01）；在病理分级中的阳性表达率G3低于G1；在临床分期中的阳性表达率Ⅲ～Ⅳ期低于Ⅰ期；在淋巴结转移阳性组中阳性表达率低于阴性组，差异均有显著性（P〈0．05）。Caspase-6蛋白在RCCC中阳性表达率低于癌旁对照组，差异有显著性（P〈0．05）；在不同病理分级和临床分期中阳性表达率差异均无显著性（P〉0．05）；在淋巴结转移阳性、阴性组中的阳性表达率差异无显著性（P〉0．05）。在RCCC中，统计学显示Caspase-3与Caspase-6蛋白表达无相关性（C=0．0921，P〉0．05）。在35例随访患者中，Caspase-3、Caspase-6蛋白表达阳性、阴性的术后3年死亡率差异均无显著性（P〉0．05）。结论Caspase-3蛋白在RCCC中的阳性表达率低于癌旁和正常肾组织，与临床分期、病理分级呈负相关，其低表达与淋巴转移有关。Caspase-6蛋白在RCCC中的阳性表达率低于癌旁和正常肾组织，但与临床分期、病理分级及淋巴转移无关。在RCCC中，Caspase-3蛋白的表达与Caspase-6蛋白的表达无相关性。