应用实时荧光定量PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病

本研究旨在应用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD),采用B系ALL18对引物、T系ALL8对引物进行PCR反应扩增Ig/TCR基因重排,以Ig/TCR基因重排作为追踪的分子标记,应用SYBR Green I染料法对儿童ALL-MRD水平进行定量。研究结果表明:9例B-ALL患儿中有8例重排,找到患儿重排标记(marker)的机率为88.8%;并对诱导化疗后(第33天)骨髓MRD检测发现,其MRD水平明显下降。结论:本研究证实Ig/TCR基因重排可作为检测儿童ALL MRD标记,SYBR green I实时荧光定量PCR是一种可靠的、相对敏感的、并且比较容易的作为常规检测。     

流式细胞术检测儿童B细胞急性淋巴细胞白血病微小残留病

目的建立流式细胞术检测白血病微小残留病(minimal residue disease，MRD)的方法，初步探讨其临床价值。方法用多种四色荧光抗体组合对患儿初发时的白血病细胞进行检测，同时对照多份正常骨髓标本的检测结果，以能够使白血病细胞在双参数点图上出现的位置完全不同于正常骨髓细胞的位置的抗体组合作为有效组合，以这些有效抗体组合对患诱导治疗结束后的骨髓标本进行监测。对58例B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿初诊时的骨髓标本进行了抗体组合有效性的筛选，并对其中的30例患儿诱导治疗结束后的骨髓细胞进行了监测。结果有52例(89．7％)B-ALL患儿都可找到适用于MRD检测的抗体组合。四色组合由CD10／CD34/CD39外加一个有效标志如CD38、CD65、CD66c、CD21等组成。该方法的敏感度为0．01％，远高于形态学检测法。实验中8例患儿诱导治疗结束后的骨髓细胞形态学检测未见白血病残留细胞，但该方法检测结果白血病残留细胞分别为0．028％，1．430％，3．050％，0．015％，5．660％，2．700％，，0．027％和0．069％。结论流式细胞术检测MRD能提高对临床缓解期间患体内残存白血病细胞数量的评估能力。     

流式细胞术检测急性白血病微小残留病的研究进展

近年来,随着新的化疗药物的出现,急性白血病在治疗上取得很大进展,患者的完全缓解率达50％-80％。尽管如此,从诊断开始的3—5年内仍有部分患者复发,目前认为其主要原因与微小残留病（MRD）的存在相关。多参数流式细胞术（FCM）是目前检测MRD的有效方法之一。它通过多参数分析白血病细胞与正常细胞表面不同的免疫表型,将两种细胞区分,具有快速、灵敏度高、定量准确的优点。通过FCM对急性白血病MRD的监测．不仅有助于判断疗效、指导个体化治疗,对预测疾病复发也具有重大意义。本文将对FCM检测急性白血病MRD的优势、面临的挑战、临床意义及应用前景进行综述。     

儿童急性B淋巴细胞白血病微小残留病检测及其预后意义

摘要：目的：建立检测急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）微小残留病（MRD）的流式细胞术,评估监测MRD对于判断B ALL预后的价值。 方法：用四色荧光抗体组合流式细胞术对33例确诊并接受SCMC-ALL-2005方案治疗的B-ALL患儿进行MRD检测,并随访5年,分析监测结果、复发率、5年无事件生存率。 结果：建立了正常骨髓细胞分布的分析模板;流式细胞术检测结果表明,18例MRD阳性患儿的白血病复发率为55. 6%(10/18)、15例MRD阴性患儿复发率为13.3%(2/15),差异有统计学意义（P＜0.05）。其5年无事件生存率分别为44%和93%,差异有统计学意义（χ²=6.37,P＜0.05）。 结论: 监测MRD对于B-ALL患儿预后评估有重要意义,并为治疗方案的选择提供依据。     

多参数流式细胞术对急性白血病微小残留病变的研究

目的探讨多参数流式细胞术检测外周血造血前体细胞的方法及其在急性白血病微小残留病变中的应用价值.方法单克隆抗体直接免疫荧光标记法和流式细胞仪多参数分析技术.结果淋巴细胞设门内各种造血前体细胞的参考值(1)CD34+总干祖细胞占0.16%±0.14 %,(2)髓系前体细胞CD34+/CD33+0.08%±0.06%、CD33+1.32%±1.28%、MPO+0 67%±0.88%,(3)淋巴系前体细胞CD45dim/CD19+0.75%±0.62%,CD45dim/CD10+0.45%±0.11%;CD45dim/CD7+0.24%±0.14%,CD45dim-/CD2+0.22%±0.13%.鉴别异常细胞的敏感度可达10-3,发现1例完全缓解期髓细胞性白血病患者外周血中髓系前体细胞有异常,3个月后临床证实复发.结论流式细胞术对正常人外周血中各系造血前体细胞的定性定量检测有可能用于急性白血病微小残留病变的检出和早期诊断复发.     

基于细胞表型异常的流式细胞术检测急性前体B细胞白血病微小残留病

为了建立一种基于细胞表型异常的流式细胞术以检测急性前体B细胞白血病微小残留病，对35份precursor—B—ALL病人骨髓和19例正常对照骨髓应用BIOMED-1推荐的5种3色抗体组合（TdT／CD10／CD19，CD10／CD20／CD19，CD34／CD38／CD19，CD34／CD22／CD19和CD19／CD34／CD45）进行了流式免疫分型，以确定前体B细胞正常和异常抗原表型流式图形特征。在35例患者中初诊病人13例，完成诱导缓解后的病人15例，完成巩固治疗的患者7例。应用不同比例的正常骨髓单个核细胞和带有CD34／CD38／CD19阳性白血病细胞进行了系列稀释试验。结果显示：在正常对照组中流式细胞术分析显示了3群CD19阳性细胞，代表了B细胞的3个连续成熟阶段。在precursor—B—ALL患者中这3群细胞消失，代之以大量的白血病细胞，而这些白血病细胞的表型特征与正常B细胞不同。当病人获得完全缓解时，这3群细胞会重新出现，而且具有与正常CD19阳性细胞几乎相同的表型特征。用5组3色抗体组合检测病人时，初诊患者12／13（92．3％）可检出抗原表型异常，也即在0．01％的敏感性水平每个患者至少有1种抗体组合的异常。在本研究初诊病人中这些抗体组合的异常频率：CD10／cD20／CD19为8／13（61．5％）；CD34／CD38／CD19为5／13（38．5％）；CD10／TdT／CD19为4／13（30．8％）：CD34／CD22／CD19为3／13（23．1％）；CD34／CD45／CD19为2／13（15．4％）。刚获得完全缓解的患者抗原表型异常的检出率为5／15（33．3％），其中初诊和缓解时同时检出异常者3／8（37．5％）。稀释试验表明，从1：1至1：400000的范围，流式细胞术检出与已知加入的CD34／CD38／CD19阳性白血病细胞数有良好的线性相关（r=0．80，P〈0．05）。结论：BIOMED—1协作组建议的基于细胞表型异常的流式细胞术用于precursor—B—ALL微小残留病的检测在本研究中能较好地实现。在10^4个正常骨髓细胞中可以有效检出1个precursor—B-ALL白血病细胞。     

定量PCR方法监测急性髓系白血病微小残留病的临床意义

随着实时定量PCR方法学的发展,越来越多的医院已将其应用于白血病微小残留病的监测,并且显示出较好的临床价值,但同时也存在许多问题.本文就实时定量PCR监测急性髓系白血病微小残留病的方法以及临床意义等方面的进展进行综述.     

定量PCR方法检测儿童ALL微小残留病

为深入研究儿童急性淋巴细胞性白血病(ALL)微小残留病(MRD)的生物学特性及病程中MRD的动力学变化,有必要对体内MRD水平进行定量。本文拟就国外近年来定量PCR方法检测儿童ALL MRD的研究进展作一简介,主要对各种方法的原理、特点及定量MRD检测的临床意义予以综述。     

流式细胞术检测儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病研究进展

多参数流式细胞术（FCM）检测白血病微小残留病（MRD）具有快速、敏感、可定量的优势。联合抗原受体基因重排的聚合酶链反应检测,可检测几乎所有儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的MRD,可评估早期治疗反应,预示复发,实施个体化治疗,提高生存质量。本文重点介绍多参数FCM检测MRD的原理、优缺点及临床意义。     

流式细胞术检测微小残留病预测儿童急性B淋巴细胞白血病复发的意义

目的:探讨流式细胞术在儿童急性B淋巴细胞白血病(B-lineage acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)患者化疗全程检测微小残留病(minimal residual disease,MRD),观察其在预测复发中的意义。方法:采用四色多参数流式细胞术对我中心291例B-ALL患儿在化疗第19天、第35天、第55天(中高危组)、第14～17周、第28～36周、第52～54周、第78～83周、第102～107周、停药及停药后分别进行MRD检测。结果:①291例患儿中MRD1%分别有169例、35例、44例和43例,其7年累计复发率分别为4.1%、17.1%、29.5%和62.8%。4组复发率差异有统计学意义(P﹤0.0001)。②各时间点MRD阳性组复发率均高于MRD阴性组,差异均有统计学意义(第19天,P=0.0021;第55天,P=0.0008;停药后,P=0.0025,余P均<0.0001)。③第35天MRD阳性在早期复发和晚期复发患儿中均常见;14～17周MRD阳性对预测早期复发意义较大;停药后MRD阳性对预测晚期复发意义较大。结论:采用流式细胞术检测MRD阳性情况在一定程度上可预测白血病复发。各时间点MRD阳性与复发均有一定相关性,且预测复发的意义不同。     

四色流式细胞术检测B细胞急性淋巴细胞白血病微量残留病的临床意义

目的探讨利用四色流式细胞术（FCM）检测B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）微量残留病（MRD）的临床意义.方法采用以抗CD34/CD10/CD45/CD19为主的两种四色荧光标记抗体组合,对98例B-ALL患者的671份骨髓标本和1份脑脊液标本进行FCM多参数MRD检测,98例随访患者中26例无发病初期的免疫分型资料.结果FCM检测显示白血病细胞＜0.0001（MRD阴性）的标本为579份;白血病细胞＞0.0001的样本数为93份,其中64份骨髓标本白血病细胞比例＜0.05,29份标本白血病细胞比例＞0.05,我们将其归为复发病例（包括治疗后未达CR的病例）.共20例患者复发,其中19例血液学复发,1例中枢神经系统复发.15例血液学复发者在复发前7～17周发现MRD阳性,包括发病时免疫分型资料不明者6例,MRD水平均＞0.0001;2例分别在复发前3个月和9个月检测MRD为阴性,此后中断检测.在诱导治疗结束和治疗3个月时,如果MRD水平＞0.0001,复发率为50%（12例中有6例复发）,而MRD阴性组复发率为7.5%（40例中有3例复发）（P=0.000）.结论利用FCM进行MRD跟踪监测可预测复发,治疗初期患者MRD＞0.0001,复发的危险性较高.而在掌握了正常B祖细胞抗原表达规律的基础上,可不完全依赖于发病时的免疫表型资料.     

动态监测儿童B系急性淋巴细胞白血病微量残留病的临床意义

目的 探讨动态监测儿童白血病微量残留病(MRD)对指导B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)治疗的临床意义.方法 以2004年1月至2009年12月确诊并完成诱导治疗的81例B-ALL患儿作为研究对象.初诊时用流式细胞术(FCM)筛选白血病细胞标志,随后定时随访.结果 81例患儿中80例诱导治疗获缓解,5年无事件生存(EFS)率为(76.80±5.70)%,其中标危组(89.40±5.90)%,中危组(66.99±13.60)%.81例患儿中68例筛选出特异性白血病细胞抗原作为MRD监测标志,13例未筛选出特异性白血病细胞抗原标志,两者5年EFS率分别为(79.10 ±6.20)%和(62.50±15.10)%,差异无统计学意义(P>0.05).诱导治疗第35天MRD检测显示68例患儿中MRD阴性(残留白血病细胞<0.01%)52例,5年EFS率为(88.50±4.90)%;MRD阳性(残留白血病细胞≥0.01%)16例,5年EFS率为(42.10±20.10)%,差异具有统计学意义(P<0.05),单因素分析提示MRD监测结果与危险度分层相关.诱导治疗第55天MRD监测显示,诱导第35天MRD阴性的52例患儿中,51例仍为阴性,1例阳性;而16例MRD阳性患者中14例(87.50%)转为阴性,2例仍阳性(后经加强治疗转为阴性).68例缓解患儿1年内MRD阳性9例(3例复发),1年后MRD阳性4例(2例复发),持续MRD阴性55例(4例复发).差异有统计学意义(P<0.05).结论 动态监测B-ALL患儿MRD,可判断预后,及时调整治疗方案,具有重要临床意义.

Abstract：

Objective To study the clinical significance of sequentially monitoring minimal residual disease( MRD)in childhood B-cell acute lymphoblastic leukemia( B-ALL). Method Eighty one B-ALL cases were enrolled in the study from January 2004 to December 2009. Leukemia cell markers were detected by flow cytometry at diagnosis, then regularly followed-up. Results Of 81 cases, 80 achieved complete remission (CR) after induction therapy, 5-year event-free survival (EFS) was (76.80 ±5.70)%. Among them, the EFS was (89.40±5.90) % in standard risk group and(66.99 ±13.60)% in intermediate risk group. Eight cases were screened for leukemia markers for MRD monitoring and identified in 68; and 5-year EFS was (79. 10 ±6.20) % and (62.50 ± 15. 10) % (P>0.05, respectively). MRD detection at day 35 in induction therapy showed that 52 of 68 cases were MRD negative (leukemia cells < 0.01%), the 5-year EFS being (88. 50 ± 4. 90)% , and 16 were MRD positive (leukemia cells ≥ 0. 01% ), the 5-year EFS being (42. 10±20. 10)% (P>0. 05). Univariate analysis confirmed that there was a correlation between MRD monitoring and risk stratification. MRD detection at day 55 showed that among the 52 day 35 MRD negative cases, 51 were still negative, 1 positive, among 16 day 35 MRD positive cases, 14(87. 50% ) turned negative, 2 still positive. Of the 68 cases, 9 were MRD positive within one year after CR (3 relapsed), 4 MRD positive after one year (2 relapsed) and 55 MRD negative (4 relapsed) (P > 0.05). Conclusions Sequential monitoring MRD can find out treatment outcome and adjust therapy in time.     

三染色-流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病微量残留病的研究

目的 建立三染色－流式细胞术检测微量残留白血病细胞。方法 利用三染色－流式细胞仪检测急性B淋巴细胞白血病患独骨髓中的CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型白血病细胞。结果 在23例急性B淋巴细胞白血病患儿骨髓中均可检测到CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型细胞,检测敏感度约为10^－4。正常人骨髓、化疗后再和髓和长期完全缓解的白血病患儿的未检测到CD10^ CD22^ CD45^-或dim表现型细胞。该法可在化疗后50d内监测到白血病细胞的变化,并且在骨髓细胞形态学确认复发之前即可检测到白血病细胞逐渐增加。结论 利用三染色－流式细胞仪检测骨髓中的CD10^ CD22^_CD45^-或dim表现型白血病细胞可以敏感地监测到急性B淋巴细胞白血病患儿微量残留病的变化。     

异基因造血干细胞移植前巩固化疗对第一次形态学完全缓解且微小残留病阴性中/高危急性髓系白血病患者预后的影响

目的探讨异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)前巩固化疗对第1次形态学完全缓解且微小残留病阴性(CR1/MRD-)中/高危急性髓系白血病(AML)患者预后的影响。方法对2010年1月至2019年3月在CR1/MRD-状态下接受allo-HSCT的155例中/高危AML(不含急性早幼粒细胞白血病)患者进行回顾性分析。结果全部155例患者中,102例获得CR1/MRD-后接受移植前巩固化疗(巩固组),53例获得CR1/MRD-后直接行allo-HSCT(非巩固组),两组中位年龄分别为39(18~56)岁、38(19~67)岁。巩固组、非巩固组移植后5年总生存率分别为(59.3±7.5)%、(62.2±6.9)%(P=0.919),无复发生存率分别为(53.0±8.9)%、(61.6±7.0)%(P=0.936),累积复发率分别为(21.9±5.4)%、(18.3±6.0)%(P=0.942),非复发死亡率分别为(22.4±4.3)%、(28.4±6.5)%(P=0.464)。多因素分析显示,移植前是否接受巩固化疗及其疗程(<2个/≥2个)对预后无显著影响。结论中/高危AML患者可在获得CR1/MRD-后直接进行allo-HSCT。     

异基因造血干细胞移植治疗复发难治性急性淋巴细胞白血病的临床研究

目的 探讨异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)对复发难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的疗效及治疗相关毒性.方法 观察并分析47例复发难治性ALL患者对allo-HSCT治疗的耐受情况、移植相关并发症、总生存率以及无病存活率.其中HLA相合同胞间移植(sib-HSCT)19例,HLA相合的无血缘关系移植(URD-HSCT)18例,单倍型移植(Hi-HSCT)10例.预处理方案:42例采用改良TBI+CY方案,5例采用改良BU/CY方案.移植物抗宿主病(GVHD)的预防:环孢素(CsA)联合短程甲氨蝶呤(MTX)、Hi-HSCT和URD-HSCT加用霉酚酸酯(MMF)及抗胸腺细胞免疫球蛋白(ATG).定期监测微量残留病变(MRD),明确有分子生物学或细胞遗传学复发趋势的患者接受供者淋巴细胞输注(DLI).结果 所有患者均完成移植治疗,出现了不同程度黏膜炎;2例患者在应用CsA过程中有肾功能损害;1例患者发生药物性癫痢.移植后出现Ⅲ～Ⅳ度急性GVHD 7例;慢性GVHD22例;致命性肺部感染9例(包括间质性肺炎3例);出血性膀胱炎4例.有13例患者移植后再次复发.移植后造血重建的中位时间为移植后第17天.术后有19例接受DLI,6例疾病未再进展.中位随访期43(10～77)个月,预期5年总生存率为49.65%,无病存活率为46.55%.结论 统 allo-HSCT能有效治疗复发难治性ALL,改善其预后,治疗失败的主要原因是移植后复发,其次为致命性肺部感染和重度急性GVHD.DLI可能有助于减少移植后复发.     

四色流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病残留细胞

目的探讨利用多参数流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病(BALL)残留细胞的方法和意义。方法采用四色流式细胞术,以4～6组四色抗体组合检测213例BALL患者免疫分型;以CD34、CD10、CD45、CD19为主的2种四色荧光标记抗体组合监测50例297份BALL患者骨髓标本微量残留白血病细胞,同时检测分析26份化疗后处于再生期骨髓标本中B祖细胞的免疫表型特点,并以相对定量方法比较了再生期B祖细胞与B系白血病细胞CD10、CD19和CD34表达量的差异。结果213例BALL患者中,71.8%患者存在CD45、CD34、CD19、CD10表达量的异常,只存在CD38弱阳性及髓系标志患者占8.1%。微量残留白血病细胞监测的50例患者中,12例患者存在0.06%～7.73%的白血病细胞,其中11例残留白血病细胞以CD45、CD34、CD19、CD10异常表达为主。50例患者中5例临床复发,4例在复发前7～17周微量残留病(MRD)检测阳性,且均>0.1%,1例MRD检测阴性。再生期B祖细胞依据CD45、CD34、CD19、CD10、CD22和CD20表达不同可分为3期。结论多参数流式细胞术检测MRD具有快速、敏感可定量的优势,对白血病复发有更强的预测性。     

Id4基因甲基化在急性白血病微量残留病检测中的意义

目的探讨Id4基因甲基化作为检测急性白血病（AL）微量残留病变指标的可行性.方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）技术对细胞系中不同比例的白血病细胞以及正常人、初诊和完全缓解期的AL患者骨髓进行Id4基因甲基化状态检测.结果MS-PCR方法可在低于1%白血病细胞中检测到Id4基因甲基化.Id4基因在正常骨髓中呈完全性非甲基化状态,初治急性髓系白血病（AML）和急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中甲基化比例分别为84%和86%.Id4基因在完全缓解的ALL患者中甲基化比例达60.9%,高于完全缓解状态的AML患者.Id4基因甲基化检测阳性的14例ALL患者中有8例在12个月内复发,而甲基化检测阴性的9例ALL患者仅有1例复发.Id4基因呈甲基化状态的8例AML患者中有5例在12个月内复发,而Id4基因呈非甲基化的20例AML患者中12个月内仅有2例复发.结论MS-PCR检测Id4基因甲基化有可能作为AL微量残留病的检测方法.     

CD+4 Foxp3+调节性T淋巴细胞在儿童急性白血病中的表达及其与微小残留病的关系

目的 研究调节性T淋巴细胞(regulatory T cell,Treg)在白血病患者体内的表达情况,探讨Treg的增高与白血病疗效监测与白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD)预后指标之间的关系.方法 建立Foxp3-FITC/CD-25PE/CD4-PerCP/CD3-APC四色流式细胞术检测Treg的方法 ;比较10例正常骨髓标本以及33例白血病初发患者[急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)17例,急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)9例,急性髓细胞白血病(AML)7例]骨髓标本中Treg的数量;结合56例临床缓解患者MRD监测结果 ,评估Treg作为白血病患者预后判断评价指标的价值.结果 正常骨髓组Treg占CD+4T淋巴细胞的比例中位数(M)为8.09%,初发自血病组M为12.77%,两者差异有统计学意义(U=3.41,P<0.01);而在B-ALL、T-ALL和AML组的差异无统计学意义(H=1.22,P>0.05).Treg数量与临床病理学参数无显著相关性.此外,Treg数量在MRD阳性组(M=14.74%)与MRD持续阴性组(M=11.3%)中的差异有统计学意义(t=252.5,P<0.05).结论 白血病初发患儿体内的Treg数量显著增高,且患儿中Treg表达水平与MRD有关联.高水平Treg预示白血病患儿预后较差,存在复发的可能.     

异基因造血干细胞移植治疗急性淋巴细胞白血病

目的　回顾性分析了急性淋巴细胞白血病 (ALL)异基因造血干细胞移植 (allo HSCT)的疗效及影响疗效的相关因素。方法　 10 0例患者中男 6 9例 ,女 31例 ,中位年龄 2 9.5岁 (4～ 4 7岁 )。移植前处于第 1次完全缓解 (CR1 )者 6 9例 ,复发后多次CR者 13例 ,复发 18例。预处理方案采用全身照射加环磷酰胺 (Cy TBI)方案 4 5例 ,白消安加环磷酰胺 (BUCY)方案 5 5例。移植方式为HLA配型相合的同胞allo HSCT 86例 ,包括骨髓移植 (BMT ) 6 4例 ,外周血造血干细胞移植 (PBSCT) 2 2例 ;HLA配型相合的无血缘关系BMT 8例 ,无血缘关系脐血移植 (CBT) 6例。移植物抗宿主病 (GVHD)预防采用长程甲氨蝶呤 (MTX)方案 4例 ;经典环孢菌素A(CsA)加短程MTX 96例。平均随访时间为 38.1个月。结果　allo HSCT后 5年累积总体生存率 (OS)为 5 3.4 % ,无病生存率 (DFS)为 5 0 .5 %。移植前处于CR1 者 ,5年OS为 70 .5 9% ,DFS为 6 9 8% ,显著高于移植前处于复发后多次CR和复发患者 (P <0 .0 0 1)。同胞BMT与PBSC比较 ,3年OS分别为 5 6 2 %和 6 2 .0 % (P >0 .0 5 ) ,DFS分别为 5 6 .2 %和 5 7.9% (P >0 .0 5 ) ,无显著性差异。多因素分析表明 ,移植前处于CR1 期 ,且缓解时间 >6个月者长期生存率明显提高。比较两种预处理方案患者 5年