石蜡包埋表皮组织中β-连环蛋白基因扩增技术的建立

目的∶建立从石蜡包埋表皮组织中提取DNA ,进行 β 连环蛋白基因 3号外显子聚合酶链反应 (PCR)扩增的方法。方法∶从 14例不同重量、不同年代石蜡包埋皮肤鲍温氏病病变组织中提取DNA ,再进行 β 连环蛋白基因 3号外显子PCR扩增。结果∶5mg组织提取DNA的PCR扩增未获成功 ,而用 10mg和 2 0mg组织提取的DNA可成功扩增 ;已包埋 10年以上的 5例标本仅 2例成功扩增 ,而 9例 10年以内的标本全部成功。结论 :10mg及 10mg以上且 10年以内的石蜡包埋表皮组织可用于目标基因PCR扩增。     

石蜡包埋胃镜组织幽门螺杆菌菌体DNA探索性研究

目的探讨从石蜡包埋胃镜组织中提取幽门螺杆菌菌体DNA的方法和策略。方法选取2008年5月~2010年5月中国医科大学263例胃癌术后石蜡包埋标本及2011年6月~2014年6月医学院附属中心医院和沈阳医学院附属第二医院206例幽门螺杆菌阳性石蜡包埋标本,利用试剂盒提取菌体DNA、PCR扩增,对扩增的结果进行统计分析。结果 263例胃癌大体标本中,231例检测出随意选取基因片段,阳性率为87.83%;206例胃镜标本中,194例检测出幽门螺杆菌cag A基因,阳性率为89.81%。胃大体标本和胃镜标本DNA提取阳性率之间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论从石蜡包埋胃镜组织中提取幽门螺杆菌菌体DNA是高效可行的。     

用显微切割-PCR检测石蜡标本微小病灶DNA异常

目的 :探讨在石蜡切片中行显微切割 PCR检测微小病灶基因突变和微卫星不稳定的方法及意义。方法 :选取本室实验性大鼠肺鳞癌浸润癌伴有支气管粘膜上皮增生、鳞状化生和 或不典型增生的蜡块标本 19例 ,分别切割各病变阶段组织并提取DNA用作PCR模板 ;SSCP检测P5 3基因第 5～ 8外显子突变及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测微卫星点ADRB2 的不稳定现象。结果 :7例支气管粘膜上皮增生 ,1例鳞状化生 ,12例不典型增生 ,19例浸润癌组织都分别成功地显微切割并提取DNA。除 1例上皮增生及 2例不典型增生组织PCR扩增失败外 ,其余切割组织P5 3外显子及微卫星点PCR扩增均获成功。 19例浸润癌组织 10例有P5 3基因突变 ,增生及鳞状化生组织未发现P5 3基因突变 ,10例不典型增生组织有 3例P5 3基因突变 ,这 3例标本中的浸润癌组织也都有相同外显子的突变。所有扩增成功微卫星点均未发现不稳定现象。结论 :在石蜡标本中进行显微切割 PCR检测DNA异常可获得较满意结果。联合应用连续切片 HE染色 显微切割 PCR 银染技术使定点对位分析肿瘤发生发展各阶段微小病灶中基因异常得以实现 ,对于研究癌前病变、不典型增生组织中DNA分子变化有重要应用价值     

石蜡包埋组织中DNA甲基化特异性PCR技术

目的 以石蜡包埋组织提取的DNA为模板进行DNA甲基化特异性PCR(MSP)检测,研究其可行性.方法 35例石蜡包埋肺癌组织DNA样品制备和亚硫酸氢盐修饰后进行MSP扩增检测.结果 石蜡包埋组织MSP检出率与文献采用新鲜组织标本报道一致.结论 MSP通过选择合适的实验条件,可适用于石蜡包埋组织DNA甲基化分析.     

T细胞受体γ基因重排用于蕈样肉芽肿的分子生物学诊断

目的：探讨检测T细胞受体γ(TCR-γ)基因重排的方法用于蕈样肉芽肿(MF)早期辅助诊断。方法：采用“一步法”提取10％福尔马林固定、石蜡包埋组织的DNA作为模板，聚合酶链反应／琼脂糖凝胶电泳方法，检测46例蕈样肉芽肿，19例可疑蕈样肉芽肿，10例湿疹皮炎，5例类银屑病及5例正常皮肤石蜡包埋组织的TCR-γ(V1～V8和V9)基因重排。结果：与非MF病人相比，81％的二期蕈样肉芽肿病人显示TCR-γ基因重排，而非MF病人未见TCR-γ基因重排。结论：“一步法”提取的石蜡包埋组织的DNA作为模板的PCR技术可用于检测MF石蜡包埋组织的。TCR-γ基因重排，且是一种灵敏度和特异性均较高的方法，可用作MF疾病的早期诊断指标。     

关于甲醛固定石蜡包埋组织提取DNA质量的探讨

目的:探讨甲醛固定石蜡包埋组织(FFPET)提取DNA后PCR扩增产物检测率的提高。方法:应用从FFPET提取的DNA,PCR反应扩增β-Globin(110bp),分析纯化前后DNAPCR产物的检测率。结果:纯化后的DNA模板PCR反应取得高质量目的基因。结论:纯化后能有效去除不能通过蛋白酶K消化和有机萃取法去除的PCR反应抑制因子,利于PCR反应成功。     

简易提取石蜡包埋组织DNA

DNA的提取是 PCR成功与否的关键 ,而 DNA提取最好是用新鲜标本 ,但对回顾性研究只能从石蜡包埋组织中提取。传统的石蜡包埋组织 DNA提取是用二甲苯脱蜡 ,酚 -氯仿反复多次的抽提 ,这样使得 DNA不断破坏 ,大量丢失 ,操作非常繁琐 ,费时费试剂 ,不适宜处理大量标本 ,且试剂对人体有毒害作用 ,而得到的 PCR反应的结果阳性率低 ,污染严重。为此 ,本室将传统的石蜡包埋组织 DNA提取法进行改良 ,介绍如下。1　材料与方法1.1　材料　本室 1996～ 2 0 0 0年存档的手术切除的甲状腺癌标本 41例。水浴恒温振摇器 (SHA- C型 ,深圳天南海北实…     

石蜡标本DNA提取优化方案

目的 :探索从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取出高纯度、高浓度DNA的优化方案,为临床DNA的常规检测提供快速、经济、实用的方法。方法 :选取2011年~2013年间于湖南省某大型医院收集的598例卵巢组织石蜡标本进行切片、脱蜡、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳及分析。结果 :提取的DNA中,69.4%的纯度能达到标准值,99%以上标本能扩增出内参。结论 :选择适合的切片厚度,脱蜡时间和方法,合理的消化酶浓度及时间,试剂的选取等均可改善提取DNA的质量。     

石蜡包埋组织中RNA提取方法的改进和完善

目的：建立和完善石蜡组织RNA提取的方法。方法：收集临床病理诊断用石蜡包埋组织块共100例，经RNA灭活处理后，进行组织切片、脱蜡、清洗、消化等一系列提取前预处理，用TRIZOL试剂提取组织的RNA，并在-20℃长时间沉淀RNA。对提取的RNA以核酸测定仪检测RNA的浓度和纯度，并通过RT—PCR检查提取RNA的β-actin基因，以检测提取RNA的质量。结果：100例石蜡包埋组织中提取的RNA经过核酸测定仪测定后，浓度在20～50mmol／L，260nm及280nm光密度比在1．75～2．0；经过RT—PCR反应，提取的RNA都能扩增出190bp的pactin目的片段。结论：通过RNA提取前对材料的一系列合理处理，从福尔马林固定、石蜡包埋档案组织材料中提取小片段RNA进行目的基因mRNA检测，可以成为一种稳定成熟的方法应用于临床病理诊断。     

石蜡包埋组织快速DNA提取方法在诊断病理PCR分析中的应用研究

目的 改良石蜡组织DNA快速提取方法的流程,评价其提取效率,探讨其应用于病理诊断PCR分析的可行性.方法 选取包括淋巴瘤及反应性病变的52例存档蜡块,以缓冲液煮沸方法快速提取DNA,并以传统酚-氯仿抽提法和试剂盒提取法作为对照,采用PCR反应扩增看家基因β-Globin以确定模板DNA质量,并通过测序确定结果的可靠性;同时根据临床病理诊断选择性的进行免疫球蛋白重链基因(IgH)或T细胞受体γ基因(TCRγ)重排检测.结果 快速法提取DNA的浓度虽低于对照方法,但β-Globin扩增效率与对照方法相比差异没有统计学意义(P＞0.05),对IgH和TCRγ重排的检出率与对照相比差异亦没有统计学意义(P均＞0.05).测序结果显示扩增片段与目的基因序列完全符合.DNA可在-20 ℃保存至少4周.结论 快速DNA提取法可以从存档的石蜡包埋组织中提供足量的PCR反应模板,结果稳定可靠,且省时省力,在病理诊断PCR分析中具有应用价值.     

Association of E-cadherin and β-catenin with metastasis in nasopharyngeal carcinoma

Background This study was designed to detect methylation of E-cadherin gene promoter and gene mutation of β-catenin in exon 3 and their expression of protein and mRNA in primary tumor and lymph node metastatic tumor of nasopharyngeal carcinoma (NPC), and investigate the mechanism of invasion and metastasis of neoplastic cells in NPC. Methods Fourty-two fresh biopsy samples were taken from untreated NPC patients at the Affiliated Hospital of Sun Yat-sen Medical College, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China during the period of 1999 -2002. Among them 21 were taken from primary tumors and the other 21 from lymph node metastatic tumors. The gene promoter methylation of E-cadherin was detected by methylation-specific PCR (MSP). The mutation in exon 3 of β-catenin was detected by direct sequencing analysis. RT-PCR, Western blot and immunohistochemical staining were used to detect the mRNA and protein expression patterns in both primary and metastatic tumors of NPC. Results Down-regulated expression of E-cadherin in metastatic tumor was compared with that in primary tumor. Reduced expression of E-cadherin was found to be correlated with lymph node metastatic tumor of NPC ( P = 0. 004) ; but there was no obvious correlation between primary and metastatic tumors in the expression of β-catenin (P = 0. 698). The mRNA expression level of Ecadherin in metastatic tumors decreased significantly compared with that in primary tumors. However, little change was observed in the mRNA level of β-catenin in different tumor tissues. Only 4 samples (19. 1%) displayed gene promoter methylation of E-cadherin in primary tumor and 10 samples (47. 6%) showed methylated form of E-cadherin. The gene promoter methylation of E-cadherin was more common in metastatic tumor than in primary tumor of NPC ( P =0. 024). Only 2 (4. 76% ) of the 42 samples showed mutations in exon 3 of β-catenin at 41 (T41A, ACC→GCC) and codon 47(S47T, AGT→ACT). The cytoplasmic and nuclear expression of β-catenin in tumor was not found in any samples of NPC. Conclusions The results suggest that the downregulation of E-cadherin results from the gene promoter aberrant methylation of E-cadherin and that the methylation of E-cadherin plays an important role in invasion and metastasis of tumor cells in NPC. However, β-catenin mutation is an infrequent event in NPC, and β-catenin is not a critical factor influencing the invasion and metastasis of tumor cells in NPC.     

应用原位多聚酶链反应检测喉癌组织中p53基因

采用原位多聚酶链反应技术检测了５例喉癌石蜡组织切片中ｐ５３基因，结果在全部标本中９０％以上的癌细胞检测到ｐ５３基因，平均拷贝数为２．２４±０．２３。表明该技术可用于单拷贝基因研究，并对其改进和应用进行讨论。     

快速高效从石蜡包埋肿瘤组织中提取micro-RNA方法的研究

目的探索一种从石蜡包埋组织标本中快速、便捷、低成本的提取miRNAs的方法。方法收集2年内石蜡包埋的人乳腺癌组织和保存6个月的MMTV基因工程小鼠乳腺癌组织石蜡样本,同时选用进口A公司生产的提取石蜡组织miRNAs试剂盒作为对照;通过2种方法提取人和鼠的石蜡切片中miRNAs做对比分析,包括采用凝胶电泳验证,检测miRNA纯度、浓度分析。为了进一步验证其提取效果,采用定量PCR对所提取的总miRNAs进行miRNA-375和miR-218检测。结果①采用本实验方法从石蜡包埋乳腺癌组织中提取的miRNAs其纯度在1．86—2．210D之间,其浓度可以满足常规实验要求（最低38．50mg／L）;②荧光定量PCR能够检测到miRNA-375和miRNA-218,其拷贝数与对照组比较,2种方法差异无统计学意义（P〉0．05）。③该方法提取时间短、成本低,成本是试剂盒法的1／10,提取时间至少节省1／3。结论从石蜡包埋组织标本中提取miRNAs方法切实可行,为从石蜡组织样本提取miRNA进行分子诊断和肿瘤相关的研究提供了便利,对采用回顾性石蜡标本研究miRNAs提供了有力的帮助。     

石蜡包埋淋巴瘤组织线粒体DNA的提取及PCR扩增

目的:探讨从石蜡包埋组织标本获取线粒体DNA (mtDNA)并进行PCR扩增的有效方法。方法:选取27例石蜡包埋的淋巴瘤组织,分别使用二甲苯/乙醇和0.5% Tween-20进行脱蜡,改进裂解缓冲液的成分及浓度,酚/氯仿抽提以获取mtDNA并进行电泳和PCR分析。结果:0.5% Tween-20法获取mtDNA纯度及浓度含量明显高于二甲苯/乙醇法(P<0.01);二甲苯/乙醇法和0.5% Tween-20法获取的mtDNA PCR扩增成功率分别为11.1%和40.7%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:二甲苯/乙醇和0.5% Tween-20两种方法都可以扩增出mtDNA的目的片段,但0.5% Tween-20法操作简便,PCR扩增成功率高,不用接触二甲苯等有毒化学试剂,是一种较为理想的mtDNA提纯方法。     

昆明地区Rh阴性者RhD假基因（RhD ψ）和杂交RhD-CE-D基因的检测和医学应用

目的用PCR基因分型技术分析研究昆明地区常住人口Rh阴性血型的D基因多态性,建立和完善本地区Rh血型的PCRRhD基因检测方法。方法收集46例Rh阴性血型样本,首先采用外显子-SSP进行PCR扩增,筛选出5例D基因部分存在型,再采用内含子-SSP进行PCR扩增,扩增产物用于DNA测序。结果在46例Rh阴性血型样本中,D基因完整缺失者29例（63％）;D基因完整存在者12例（26．1％）,存在全部外显子;D基因部分存在者5例（10．9％）。DNA测序结果显示,2例仅存在D基因的第10外显子的样本均为RhD—CE（3—9）-D杂合基因,1例存在D基因的第4、6外显子为RhD—CE（2—3,5,7—9）-D杂合基因,是新发现的变异等位基因。结论（1）昆明地区常住人群存在高频率的RhD—CE（3—9）-D杂合基因。（2）在昆明人群发现一种新型D变异等位基因即RhD—CE（2—3,5,7—9）-D杂合基因。     

人肝细胞癌中PTEN基因的DNA杂交及突变分析

目的　研究人肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因缺失及第５、第８外显子突变。方法　应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测人肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因限制性片段长度多态性和纯合性缺失、半合性缺失、片段缺失。应用聚合酶链单链构象多态性（ＰＣＲＳＳＣＰ）检查ＰＴＥＮ基因的第５、第８外显子的突变。结果　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果显示,所有３４例肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因未见限制性片段长度多态性或纯合性缺失、半合性缺失、片段缺失。ＰＣＲＳＳＣＰ检测发现,２例肝细胞癌第５外显子ＰＣＲ产物均显示１条额外电泳迁移带,突变率为５．９％（２／３４）。另２例肝细胞癌第８外显子ＰＣＲ产物呈现额外电泳迁移带,突变率为５．９％（２／３４）,合计突变率为１１．８％（４／３４）。结论　所检３４例人肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因未见纯合性缺失、半合性缺失、片段缺失,但存在突变。     

实时荧光定量PCR方法检测石蜡包埋组织microRNA表达的方法探讨

目的:探讨从石蜡包埋组织中运用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)方法检测microRNA表达的可靠性和敏感性。方法:选取2005年至2010年从石河子大学医学院第一附属医院、新疆伊犁哈萨克族自治州友谊医院收集的97例福尔马林固定、石蜡包埋食管癌组织样本,提取组织总RNA,RT-PCR逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法检测microRNA表达。结果:97例食管癌组织样本中,RNA提取成功90例,7例失败,运用实时荧光定量PCR成功检测了83例microRNA表达,7例检测不准确。RNA提取成功率明显高于失败率,实时荧光定量PCR检出的定量准确例数高于定量不准确例数,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:实时荧光定量PCR(RQ-PCR)方法是检测石蜡包埋组织中microRNA表达的一种有效方法。