日本血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基全长cDNA的克隆与功能分析

目的 对用表达序列标签(EST)策略从日本血吸虫(Schistosoma japonicum)尾蚴cDNA文库中筛选出的新基因进行全长cDNA克隆及功能预测。方法 将插入于pTriplEx2质粒上的cDNA进行测序，测序结果经BLAS Tn程序搜索，发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫真核生物翻译起始因子2α亚基(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha subunit，elF2α)基因高度同源。根据该EST序列设计与pTriplEx2质粒上的5′端测序引物相匹配的PCR下游引物，从该cDNA文库中扩出包含eIF2α全长ORF的cDNA片段。将PCR产物纯化后克隆到pGEM-T载体上，并对此克隆进行测序得到其全长cDNA序列。用NCBI站点的BLASTx及BLASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索；用blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较。同时用网上分析软件进行基序和保守区域的搜索。结果 发现一个与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源的日本血吸虫新基因，核苷酸与氨基酸水平的同一性分别为87％和79％，编码由327个氨基酸组成的蛋白序列。结论 用EST策略筛选到一个日本血吸虫新基因，编码eIF2α亚基，全长编码序列与曼氏血吸虫eIF2α亚基mRNA高度同源。     

日本血吸虫新基因—腺苷酸激酶基因的发现与克隆

目的：将用表达序列标签（expression sequence tag,EST)策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因－腺苷酸激酶（adenylate kinase,AK)cDNA克隆到表达质粒，pET32a( )上，为下一步研究该基因的功能做准备，方法：将插入于pTriplEx2质粒上的cDNA进行,测序，用BLASTn程序搜索测序结果，根据表达质粒pET32a( )上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物，将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上，将重组T载体经EcoR I/Xho I双酶切后切下的SjAK基因导入原核一表达质粒pET32a( )中，结果：本研究所发现的新基因与曼氏血吸虫AK基因的同一性达86％，PCR产物的片段长度与预期大小一致，重组T载体及表达质粒经EcoR I及Xho I双酶切后有具有与目标片段工度相符的插入片段，结论：发现日本血吸虫的cDNA与曼氏血吸虫AKcDNA高度同源，并且成功地构建出重组表达质粒pET32a( )-SjAK。     

日本血吸虫新基因——腺苷酸激酶基因的发现与克隆

目的将用表达序列标签(expression sequence tag, EST)策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK)cDNA克隆到表达质粒pET32a(+)上,为下一步研究该基因的功能做准备。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,用BLASTn程序搜索测序结果,根据表达质粒pET32a(+)上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后切下的SjAK基因导入原核可溶性表达质粒pET32a(+)中。结果本研究所发现的新基因与曼氏血吸虫AK基因的同一性达86%,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoR I及XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论发现日本血吸虫的cDNA与曼氏血吸虫AK cDNA高度同源,并且成功地构建出重组表达质粒pET32a(+)-SjAK。     

日本血吸虫尾蚴（中国大陆株）表达序列标签的获取及同源性分析

目的：了解日本血吸虫尾蚴cDNA文库中基因的基本情况,为新基因的筛选鉴定提供依据。方法：日本血吸虫尾蚴cDNA文库中的噬菌体侵入大肠杆菌BM25．8后环化成质粒。筛选出转入质粒的菌株。提取质粒DNA,用质粒上的一段测序引物序列进行一次性测序,得到一个表达序列标签（EST0。通过BLASTx及BLASTn公共数据库经编辑分析的EST序列进行同源性比较。经过分析编辑后的新EST序列,以编写好的程序和E-mail方式递交,以获得GenBank登录号,通过对同源性比较结果的总结,对该文库的基本情况进行分析。结果与结论：在测出的58个EST中有3个核苷酸序列与日本血吸虫已知基因高度同源,有2个核苷酸序列与曼氏血吸虫较高度同源,有7个EST的蛋白质序列与其他物种有较高同源性而核苷酸序列同源性很低,有27个EST的蛋白质核苷酸序列同源性都很低。     

日本血吸虫新基因-Ⅲ8kDa钙结合蛋白基因的发现与克隆

目的 将用EST策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因－Ⅲ8kDa钙结合蛋白（Calcium-binding protein,CBP)cDNA克隆到表达质粒pET32a( )上，为下一步对该基因的功能进行研究做准备。方法 将插入于pTripIEx2质粒上的cDNA进行测序，测序结果经BLASTn程序搜索，发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫钙结合蛋白cDNA高度同源。根据表达质粒pET32a( )上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物，将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，将重组T载体经EcoRI/XhoI双酶切后切下的SjCBP基因亚克隆入原核可溶性表达质粒pET32a( )中。结果 所发现的新基因与曼氏血吸虫8kDa CBP基因的同源性达82％，PCR产物的片段长度与预期大小一致，重组T载体及表达质粒经EcoRI及XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论 所发现的cDNA与曼氏血吸虫8kDa CBP cDNA高度同源，并且已成功地构建出重组表达质粒pET32a( )－SjCBP。     

日本血吸虫(中国大陆株)成虫表达序列标签的获取及分析

随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库单个重组克隆进行部分测序以获得EST（ex-pressed　sequence　tag）,获得的EST通过 BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GeneBank数据库进行比较及同源性分析。结果在随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库150个单个重组克隆中,获得了56个有价值的EST序列,其中47个在GeneBank dbEST中登录。7.1％EST序列为日本血吸虫已知序列,3.6％为日本血吸虫同源序列,曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占25％,未知序列占55.6％。通过同源性分析可知,大多数同源序列具有看家基因功能。另外,也发现了几个有价值的基因。     

抗日本血吸虫病天然分子疫苗免疫猪血清筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库结果分析

目的通过天然分子疫苗免疫猪血清作为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,应用表达序列标签获得日本血吸虫新基因.方法制备天然分子免疫猪血清,将筛选的尾蚴cDNA文库中大肠杆菌XL1-Blue侵入大肠杆菌BM25.8后环化成质粒,筛选出已转入质粒的菌株.提取质粒DNA,进行测序,得到一个表达序列标签(EST).通过NCBI网站的BLASTx及BLASTn公共数据库,编辑分析EST序列并进行同源性比较.结果从26个克隆样品中筛选出8个阳性克隆,其中有一个新基因(GenBank登录号DQ097517),该基因全长861 bp,有完整的阅读框架,与蜜蜂(Apis mellifera)SMC3蛋白编码的mRNA基因序列同源性最高.结论疫苗免疫猪血清可作为筛选日本血吸虫新基因的有效探针,新发现1个日本血吸虫相关基因.     

Generation and analysis of 113 adult stage Schistosoma japonic um (Chinese strain) expressed sequence tags

目的：运用表达序列标签（Expressed Sequence Tag,EST）技术快速、节约、有效地获得有关日本血吸虫（中国大陆株）成早表达基因的知识。方法：随机挑取日本血吸虫（中男大陆株）成虫cDNA库单个重组克隆进行部分测序以获得EST,获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GeneBank数据库进行比较及同源性分析。结果：本研究共随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库单个重组克隆314个,获得了132个有EST价值的序列,其中113个成功在GeneBank dbEST中登录。7.6％有EST价值的序列为日本血吸虫已知序列,4.5％为日本血吸虫同源序列。曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占有EST价值的序列的23.5％,未知序列占57.6％。通过同源性分析,发现了几个令人感兴趣的基因,另外,大多数同源序列具有看家基因功能。结论：EST方法具有快速、有效地获得有关日本血吸虫（中国大陆株）成虫表达基因的知识的价值。     

日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的获得和序列分析

目的 从日本血吸虫(Schistosorna japonicum,Sj)成虫cDNA文库中筛选日本血吸虫新基因，为日本血吸虫病的防治提供药物靶标或候选疫苗。方法 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行DNA测序，再对新基因序列进行步移法测序获取全长cDNA，并利用生物信息学技术对其进行分析。结果 获得了1个编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶新基因的cDNA序列(AY226980)，全长594bp，编码157个氨基酸，编码蛋白与人类或鸽、鸡、鼠及果蝇的核苷二磷酸激酶高度同源。结论 利用表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术三者相结合，成功获得了编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的cDNA序列。     

日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位的发现与克隆

目的将用EST策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位（proteasome activatorPA28 subunit,PA28）cDNA克隆到表达质粒pET32a（+）上,为下一步对该基因进行功能研究做准备。方法将插入于pTrip1Ex2质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTx程序搜索,发现该插入cDNA序列所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源。根据表达质粒pET32a（+）上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRI/XhoI双酶切后切下的SjPA28基因导入原核可溶性表达质粒pET32a（+）中。结果所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白的同一性达41％,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoRI/XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论本研究所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源,并且已成功地构建出重组表达质粒pET32a（+）-SjPA28。     

曼氏血吸虫与日本血吸虫交叉免疫原性的血清学实验研究

以曼氏血吸虫的虫卵和成虫免疫家兔后所产生的特异性抗体,可用以日本血吸虫虫卵、尾蚴和成虫为抗原分别进行的COP,CHR和ELACIEP测出,表明两种人体血吸虫存有显著的交叉抗原成分。应用此种血清交叉反应性,以检测抗异种人体血吸虫的抗体,似有效而可取的,可用以辅助诊断援外回国人员是否感染国外人体血吸虫病。     

基因芯片检测日本血吸虫及其现场应用

目的:建立敏感、特异的检测日本血吸虫的基因芯片并对其应用价值进行评价。方法:根据日本血吸虫高度保守的编码免疫原性毛蚴抗原5D基因,筛选、设计聚合酶链反应(PCR)的引物和基因探针,制成日本血吸虫基因芯片。采用基因芯片对江西、湖南和安徽三省现场采集的钉螺进行检测。检测时抽提待测钉螺的DNA,进行PCR扩增及不对称PCR荧光标记,然后与检测芯片杂交,最后进行扫描及分析。结果:建立的基因芯片能特异、敏感地检测出感染性钉螺,江西、湖南感染性钉螺的检出率为100％,安徽省品系的感染性钉螺检出率略低。结论:成功地建立了检测日本血吸虫的基因芯片,具有较高的实际应用价值。     

日本血吸虫副肌球蛋白T细胞表位的预测和鉴定

目的鉴定日本血吸虫副肌球蛋白的T细胞表位。方法用SYFPEITHI软件预测日本血吸虫(中国大陆株)副肌球蛋白的T细胞表位，候选表位分别命名为P20、P21、P22、P23、P24。设计并合成候选表位的编码核苷酸，定向克隆入融合表达载体pET-32c( )，经酶切及测序鉴定出重组克隆。阳性克隆经IPTG诱导表达，表达产物以Ni^2 -NTA柱亲和层析及透析纯化。纯化后的硫氧还蛋白(Trx)融合蛋白体外刺激C3H／HeJ及C57BL／6小鼠腹股沟淋巴结或脾脏单个核细胞，^3H-TdR掺入法检测其增殖。结果候选表位中P20、P21、P22、P23能有效刺激C3H鼠致敏淋巴细胞细胞增殖，P20、P22能刺激C57鼠致敏淋巴细胞增殖。结论P20和P22可能是日本血吸虫副肌球蛋白的通用性T细胞表位。     

日本血吸虫Calpain蛋白免疫原性研究

目的：探讨日本血吸虫疫苗候选分子Calpain蛋白的抗原性及其所诱导的免疫应答类型。方法：用Genetyx—MAC9．0分析Calpain肽链的亲水性，在亲水性区域以9个氨基酸为肽链单位的固相重叠肽链库(每相邻两个肽链之间仅有一个氨基酸不同)被Auto—spot Robot制备，用Dot—ELISA在合成的肽链库上筛选B细胞表位，含有B细胞表位的肽链免疫BALB／c小鼠，ELISA鉴别特异性IgG抗体亚类的产生。结果：由758个氨基酸组成的日本血吸虫Calpain蛋白含有两个主要的亲水区，其存在区域分别在氨基酸229～375和555～613；测定合成的肽链文库，在亲水区内筛选出4个B细胞的表位，分别是氨基酸234～251(YAHISGGT)；290～297(CLMGCSIH)；338～346(PWGDSHEW)：358～364(AWCDGA PQ)；与对照组比较，免疫组鼠血清中IgG1、IgG2a和IgG2b特异性抗体有显著性意义的上升。结论：日本血吸虫Calpain是一个具有免疫原性的蛋白，能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白，提示Calpain可以发展成为日本血吸虫病的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子。     

日本血吸虫中国大陆株副肌球蛋白编码基因的PCR扩增

根据已知的日本血吸虫菲律宾株的副肌球蛋白分子的部分ｃＤＮＡ序列，设计两对寡核苷酸引物（引物１／２和引物３／４），以聚合酶链式反应（ＰＣＲ），用引物１／２从本室两个日本血吸虫中国大陆株ｃＤＮＡ库中均扩增出与预期大小（９２７ｂｐ）一致的特定ＤＮＡ片段。巢式ＰＣＲ——以第一扩增产物为模板，用引物３／４扩增出约５００ｂｐ的单一条带，与预期片段（４９４ｂｐ）大小一致。表明ＰＣＲ产物为编码副肌球蛋白的目的基因片段。     

日本血吸虫未成熟卵对小鼠肝肉芽肿形成的免疫学影响

目的探讨日本血吸虫未成熟卵诱导宿主产生抗雌虫生殖和抗卵胚免疫的效果及其对小鼠肝肉芽肿形成的影响。方法采用未成熟虫卵可溶性抗原（ＳＩＥＡ）及其不同组分抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，检测小鼠产生的抗病免疫能力。结果经ＳＩＥＡ和ＳＩＥＡ２６～２８０００分子抗原免疫后，均可明显地降低攻击感染后免疫鼠的肝肉芽肿数目和大小。与对照组比较，上述两者免疫后的小鼠，其肝肉芽肿平均直径分别下降了２９．２６％和４９．６４％，尤以ＳＩＥＡ２６～２８０００分子抗原的免疫效果为佳，且感染鼠脾重明显下降（Ｐ＜０．０１）。但是成熟虫卵可溶性抗原以及ＳＩＥＡ－１分部抗原免疫对降低肝卵肉芽肿数量和大小以及脾肿大程度均无明显作用，甚至刺激肉芽肿反应增强。结论ＳＩＥＡ和ＳＩＥＡ２６～２８０００分子抗原免疫可诱导宿主产生抗雌虫生殖和抗卵胚发育的作用，并明显抑制虫卵肉芽肿的形成。     

江滩型地区不同季节人畜血吸虫感染规律的研究

目的了解在当前农村社会、经济状况下江滩型地区人畜血吸虫感染规律,为制定符合该类地区特点的血吸虫病防治对策提供依据。方法分别在2002年6、9月下旬和12月上旬用单纯随机抽样的方法在三联村5周岁以上常住沿江居民中随机抽取500人,利用Kato-Katz法进行1粪3检,阳性者计算虫卵数,对该村所有耕牛用棉析孵化法检查是否感染,以判断春、夏、秋不同季节人畜血吸虫感染情况。结果总体看来,人群感染率夏季为12.93%,显著高于春(4.23%)、秋(2.69%)季,春季略高于秋季,但差异无显著性。不同性别、职业、文化程度人群夏季感染率均显著地高于春秋季,除农民春季明显高于秋季外,其余春秋季之间差异均无显著性。病人感染度秋季(178.14±147.44)最高,夏季(127.03±186.52)次之,春季(18.96±13.54)最低。耕牛感染率夏季(42.62%)显著高于春(7.41%)、秋(1.75%)季,春季略高于秋季,但差异无显著性。结论江滩型地区人畜感染血吸虫的主要季节在夏季,秋季感染率最低。     

永胜县山区鼠类感染日本血吸虫调查研究

目的:了解鼠类的种群组成,探讨鼠类在血吸虫病传播上的作用。方法:鼠类分类鉴定,解剖肉眼观察肝脏表面的日本血吸虫虫卵结节,取结节压片镜下观察虫卵。用尼龙袋集卵孵化法作定性检查,改良加藤法作虫卵计数。同时采用常规方法对人群和家畜进行调查。结果:捕获鼠类3目3科6属10种713只,以褐家鼠为优势种,占67.88％。检验710只,其中1只大足鼠自然感染日本血吸虫,鼠类感染率为0.14％,EPG(x)为0.32。人群感染率为5.93％,EPG(x)为1.29。家畜感染率为1.05％,EPG(x)为0.04。结论:鼠类仅为偶然宿主。在该地血吸虫病的传播上无明显作用。