造血干细胞移植植入存活检定技术的应用性研究

目的 探讨荧光标记短串联重复(STR)复合扩增技术在造血干细胞移植(SCT)存活检定中的应用价值。方法 用荧光标记引物对15个STR位点和1个性别位点牙釉质蛋白基因(amelogenin)进行聚合酶链反应(PCR)复合扩增，再用DNA自动测序仪对PCR产物进行分离及分型，并对30例移植后病人做存活鉴定检测。结果 有20例移植后病人的15个STR位点的分型完全表现供者源性，与受者移植前不同；3例表现为供／受体干细胞混合嵌合状态，7例未表现出供者源性细胞在受者体内的植入。结论 荧光标记STR复合扩增体系特异性强，个体识别力高，检测灵敏、快速、简便，可作为SCT存活的可靠指标。     

猕猴造血嵌合体检测方法的建立与应用

在受体内检测到供体细胞嵌合是判断动物移植模型成功建立的关键。为了研究猕猴移植模型中的造血细胞嵌合状态，本研究利用多聚酶链反应（PCR）扩增猕猴Y特异性序列，建立检测性别不同供受者猕猴移植模型嵌合体的方法；用体外雄性、雌性DNA混合稀释实验研究该方法的敏感性；用染色体分析法验证该方法的准确性，并对1例异基因外周血造血干细胞移植的猕猴和1例间充质干细胞（MSC）异体输注的猕猴进行嵌舍监测。结果表明：雄性猕猴DNA扩增产物长度为176bp，雌性无扩增产物，敏感性达0．05％（雄性／雌性DNA比例）。对异基因外周血造血干细胞移植的猕猴，用Y特异性序列分析法和性别染色体检测法于移植后7及14天均检测到雄性供者嵌合。输注非亲缘雄性MSC的雌性猕猴，输注后1小时的外周血和30天的骨髓用本方法检出雄性供体嵌合．结果性别染色体检测未发现雄性供体嵌合。结论：采用PCR法扩增猕猴Y特异性序列检测猕猴移植模型嵌合体方法简便，样本需要量少，敏感性高。该法可用于猕猴各种异体器官移植和细胞输注实验的嵌合状态评价。     

STR-PCR对造血干细胞移植后植入证据的检测

本研究采用STRPCR检测方法，观察比较15例异基因造血干细胞移植术后患者的植入情况。提取15例异基因造血干细胞移植术患者及其供者移植前的以及患者移植术后的不同时期的外周血或骨髓DNA，PCR扩增5个具有高度多态性的STR位点，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，分析其植入情况。结果表明：15例患者均有不同程度植入，其中完全供者植入10例，供受者混合嵌合体5例。持续缓解10例，死亡4例，1例复发但仍存活。混合嵌合体中供者DNA比例的下降预示着早期排斥或复发。Ⅱ度以下急性移植物抗宿主病的发生与混合嵌合体有明显相关性。结论：STRPCR是分析异基因造血干细胞移植后供体是否植入的灵敏、准确度高的方法，混合嵌合状态对白血病复发有预警作用。嵌合状态的变化对疾病的治疗有指导作用。     

非清髓异基因造血干细胞移植术后荧光STR-PCR血细胞嵌合体定量检测

非清髓异基因造血干细胞移植（allo—NST）后，明确判定残余宿主细胞与供者细胞嵌合状态对于疗效评估及供者淋巴细胞输注（DLI）时机的把握是至关重要的。由于短片段串联重复（STR）的核心序列短小，不易受DNA降解及优势扩增的影响，因而STR可作为异基因造血干细胞移植后嵌合体检测的灵敏度高，且易于操作的技术方法。我们对29例allo—NST后供一受者的嵌合体分析，研究嵌合体与微量残留病（MRD）、疾病复发、移植物抗宿主病（GVHD）等的相关性。     

荧光标记短串联重复序列复合扩增监测嵌合体的应用研究

本研究采用荧光标记的多重PCR复合扩增短串联重复序列(STR)结合全自动毛细管电泳检测异基因造血干细胞移植后嵌合体水平,并探讨该方法动态监测对移植患者预后判断的作用。采集30例异基因造血干细胞移植患者及其供者移植前后骨髓或外周血的DNA,采用Profiler Plus试剂盒进行PCR扩增,产物经ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,通过供受者基因位点差异和峰面积进行嵌合体的定量检测。结果表明,29例患者在移植后28天形成完全供者嵌合体(complete chimerism,CC),1例形成混合嵌合体(mixed chimerism,MC)。在长期随访中,22例表现为持续完全供者嵌合体,8例混合嵌合体患者中7例原病复发,从完全供者嵌合体转为混合嵌合体。完全供者嵌合体组移植物抗宿主病(GVHD)的发生率明显高于混合嵌合体组。结论 :荧光标记多重复合扩增STR检测嵌合体具有快速、自动化高、可定量及灵敏度高等优点,动态定量监测嵌合体可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD均有预警作用,对实施临床干预治疗有指导价值。     

短串联重复序列检测在异基因造血干细胞移植植入状态中的应用

背景:移植后造血干细胞植活的判断主要依赖于体内各种遗传标记,其在敏感性和有效性方面各不相同,故亟待建立一种鉴别力强、敏感性高、不受性别限制的检测方法。目的:观察异基因造血干细胞移植供受者移植前及受者移植后不同时间段的血样DNA短串联重复序列遗传位点检测情况。设计:观察测量实验。单位:深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传重点实验室。对象:选择2004-02/2005-12在深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传实验室配型成功并进行造血干细胞移植的18对供受者血样,18例患者中,男10例,女8例,平均35岁。接受血缘关系供者移植6例,无关供者移植12例。所有受试对象均对检测项目知情同意。方法:采用荧光标记复合扩增短串联重复序列(STR)检测技术,对18例进行造血干细胞移植的血液病患者移植后的系列血样及移植前供、受者的血样进行15个STR位点和1个性别位点的检测,找出供受者间的差异基因,观察移植后供者的STR基因在受者体内的植入情况及变化过程,找出最早检测到供者STR基因的时间及完全嵌合体最早出现的时间。主要观察指标:①观察移植前供受者差异基因。②供者STR基因及完全嵌合体最早出现时间。结果:供受者18对均进入结果分析。①供受者中能区分出彼此差别的平均STR差异位点数为12.4(8～15)个。②患者移植后最早可检测到供者STR基因的平均时间为8(5～14)d,由受者型向完全供者型转化的平均时间为14(9～23)d。植入状态由供受者嵌合型转为完全供者嵌合型。结论:荧光标记复合扩增STR检测方法可精确地描述异基因造血干细胞移植植入状态及其演变过程,可为临床提供一个准确、可靠的实验依据。     

Profiler体系用于异基因造血干细胞移植植活测定

目的探讨应用Profiler体系进行短串联重复序列（STR）基因位点检查在异基因造血干细胞移植中的作用。方法采用荧光标记STR-PCR复合扩增、毛细管电泳基因分型技术，对11例异基因造血干细胞移植的供者和受者移植前、后STR基因进行检测，了解造血干细胞的植入情况。结果11例异基因造血干细胞移植受者移植后STR基因型与受者移植前STR基因型不同，与供者STR基因型完全相同，提示供者造血干细胞的植入。结论应用Profiler体系进行STR基因位点检查可用于判断异基因造血干细胞移植的植入情况。     

STR-PCR定量检测嵌合体供者嵌合率准确性探讨

目的探讨用荧光标记复合扩增短串联重复序列(STR-PCR)结合序列分析仪毛细管电泳法检测嵌合体供者细胞嵌合率的准确性。方法采集健康献血者外周血按白细胞比例两两混合制备不同供受者比例的体外嵌合体模型,对15个STR位点进行荧光标记复合扩增,扩增产物进行序列分析仪毛细管电泳,计算嵌合率。结果实验测得嵌合率与扩增前样本嵌合率呈显著直线相关,r=0.999 7,最小检出供者细胞嵌合率<1%。供者嵌合率≥5%的嵌合体模型嵌合率的检测值与理论值差别无统计学意义(P>0.05),<5%的模型嵌合率检测值与理论值差别有统计学意义(P<0.05)。结论荧光标记复合扩增STR基因结合序列分析仪毛细管电泳检测嵌合率方法个体识别力高、特异、敏感,当供者嵌合率≥5%时能准确反映异基因造血干细胞移植后患者的嵌合状态。     

微卫星DNA在异基因干细胞移植植入监测中的应用

目的探讨微卫星DNA多态性分析技术在异基因干细胞移植植入监测中的应用。方法对68例异基因干细胞移植的受者进行移植监测。采用荧光标记引物复合扩增15个微卫星DNA多态性进行基因分型，比较受者移植前后的基因型变化。结果经移植后检测微卫星DNA多态性，9例移植后DNA多态性为受者型；55例表现出单一供者型；1例检测出2个供者的混合供者型；3例检测出受者和供者基因型的混合嵌合型。结论复合扩增微卫星DNA技术在异基因干细胞移植植入监测中十分有效，检测方法灵敏、可靠、快速、简便，具有重要的应用价值。     

荧光标记引物复合扩增短串联重复序列技术用于异基因造血干细胞移植植活测定

目的　探讨荧光标记引物复合扩增短串联重复序列技术(fm PCR -STR)在分析异基因造血干细胞移植(allo- SCT)后植活状态中的作用。方法　用fm -PCR- STR技术对 15例allo SCT患者的 15个STR位点和 1个性别位点 (牙釉蛋白基因 )进行分析。结果　12例(5例接受HLA全相合allo- SCT和 7例接受HLA半相合allo SCT)的受者移植后均持续表达完全供者型。1例HLA全相合allo -SCT和 1例HLA半相合allo -SCT在fm PCR -STR动态观察中早期均表现为完全供者型,分别于 82d和 381d转为嵌合型。1例HLA半相合首次移植 31d表达完全受者型(反映移植失败),再次移植 29d表达完全供者型。结论　fm -PCR- STR可敏感且精确地分析allo SCT后移植物植活状态,亦可作为白血病复发的监控手段。     

嵌合体的动态定量检测在异基因造血干细胞移植中的应用

目的　建立荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列 (STR PCR)结合毛细管电泳 ,定量检测供体细胞 (DC)嵌合率的方法 ,并探讨该方法的连续定量检测对异基因造血干细胞移植 (allo HSCT)后转归的预警作用。方法　采集 31例接受骨髓移植 (BMT)或非清髓外周血干细胞移植 (NST)患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓。DNA样本用ProfilerPlus商品化试剂盒扩增后 ,用ABI 310遗传分析仪进行毛细管电泳 ,确定基因位点及峰面积 ,根据供受体基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果　 31例患者中 15例 (48.4 % )为性别相合移植 ,只能通过STR PCR进行嵌合体的定量分析 ;性别不合移植患者用STR PCR和荧光原位杂交两种方法定量测得的DC嵌合率一致 ;31对供受体中能区别出供受差别的STR位点有 6 .7(2～ 10 )个 ,所有患者均在移植后 7天 ( 7天 )出现供体来源的细胞 ,BMT组 7天、 14天和 1个月DC中位数均明显低于NST组 ,而在移植中后期无显著性差异。 2 1天时BMT和NST患者均达稳定嵌合 ,DC在 92 %以上 ;中位随访 17(3.5～ 2 9.0 )个月 ,2 6例患者DC≥90 % ,均获得持久植入 ,至今均为无白血病生存。另有 5例患者出现不稳定混合嵌合 (MC)状态 (DC为2 7.3%～ 6 2 .7% ) ,其中 4例复发 ,1例出现移植物被排斥。上述 5例患者均     

STR-PCR分析嵌合体在同种异基因造血干细胞移植中的应用

利用荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列（STR-PCR）结合毛细管电泳检测供者细胞嵌合率（DC）,以探讨该方法的连续检测对异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后转归的预警作用,采集27例清髓性外周血干细胞移植患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓,DNA样本用Profiler Plus和Cofiler Plus商品化试剂盒扩增后,用ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果表明：两种试剂盒测得的DC嵌合率一致;在27对中能区别出供受差别的STR位点,Profiler Plus为6.3（4-9）个,Cofiler Plus为4.9（2-6）个。26例患者均在移植后28天出现供者细胞,1例患者未出现供者细胞。14例患者DC100%,均获得持久植入,至今仍无白血病生存;另有9例患者出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0%-90.2%）,其中5例为血液学复发。27例病人中有6例死亡。上述5例复发患者均在出现临床症状前发生DC量下降;供者细胞完全嵌合组移植物抗宿主病（GVHD）的发生率高于MC组。结论：动态检测DC可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD的发生均有预警作用,对早期实施临床干预治疗有重要的指导意义。     

异基因造血干细胞移植后复发慢性髓系白血病患者嵌合体和融合基因的动态观察

本研究利用STR—PCR结合RT—PCR定量和定性检测异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）后患者嵌合体和融合基因的表达，分析其植入和微小残留病变情况，评价其对复发的预测价值。采用STR—PCR结合毛细管电泳进行定量检测嵌合体供体细胞嵌合率，采用RT—PCR方法检测融合基因转录本bcr／abl mRNA。结果表明：4例患者在移植后28天均为100％供者型嵌合，融合基因bcr／abl mRNA均为阴性。但在以后的随访过程中发现4例患者在不同时间出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0％-80．4％），融合基因bcr／abl mRNA阳性；其中2例复发后一直处于混合嵌合状态，另外2例在临床干预治疗后又转变为完全嵌合状态，目前处于分子生物学缓解状态。上述4例复发患者均在出现临床症状前发生供体细胞嵌合率（DC）下降；融合基因表达阳性。结论：STR—PCR在敏感范围内，其结果与RT—PCR的结果符合率高，两种技术的结合是一种检测异基因造血干细胞移植后供体是否植入的有效手段，对判断疾病复发及GVHD均有预警作用，对实施临床干预治疗有重要指导价值。     

STR-PCR联合RT-PCR技术在慢性髓细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后微小残留病变检测中的应用

为了探究STR PCR联合bcr/abl融合基因转录本RT PCR定性检测技术对慢性髓细胞白血病 (CML)异基因造血干细胞移植 (allo HSCT)后复发的预测价值 ,对接受allo HSCT的 2 4例CML患者进行微小残留病变(MRD)的动态检测 ,对供体细胞嵌合率 (DC)采用复合扩增荧光标记STR PCR结合毛细管电泳方法进行定量检测 ,对bcr/abl融合基因转录本采用巢式RT PCR方法检测。结果显示 :移植后长期处于完全供体细胞嵌合状态(FDC)即DC≥ 95 %的患者bcr/abl均转为阴性 ,MRD消失 ;稳定混合嵌合状态 (MC)即 90 %≤DC <95 % ,并且bcr/abl阴性的患者 ,也可达到分子水平的缓解并长期生存 ;但是bcr/abl的阳性结果并不总是与复发相关 ,只有当DC进行性下降 (DC <90 % ) ,而同时bcr/abl阳性时 ,才有复发或植入失败的可能 ,对该类患者应尽早实施临床干预性治疗。本研究中有 5例患者出现DC下降和MRD阳性 ,其中 3例为分子水平复发 ,1例为细胞遗传学水平复发 ,1例为植入失败。结论 :STR PCR在敏感范围内 ,其结果与RT PCR的结果符合率高 ,两种技术的结合是一种检测MRD高度敏感的手段 ,可检出allo HSCT后发生分子生物学或细胞遗传学复发的高危患者。     

Bone marrow transplant relapse with loss of an allele

BACKGROUND: Detection of the extent of chimerism after transplantation is an important method for monitoring the engraftment of donor stem cells or diagnosing relapse. METHODS: The AmpFlSTR Identifiler amplification kit (Applied Biosystem, CA) was used to perform STR-PCR for the study of engraftment. RESULTS: At 6 months post-transplantation, the peripheral blood genotype shows a mixture of donor and recipient alleles, consistent with disease relapse. Interestingly, the D18S51 locus shows 2 donor alleles and only 1 recipient allele, the other recipient allele is missing. To further confirm chromosome loss, we used the D18S53 and D18S1129 in the ABI PRISM Linkage Mapping Sets. The D18S53 locus showed the recipient allele (179 bp) and shared allele (171 bp). Interestingly, the D18S1129 locus showed almost only 1 recipient allele (243 bp); the other recipient allele and shared allele (251 bp) is missing. CONCLUSION: The case illustrates that chromosome loss in tumor cells during the course of disease may cause corresponding loss of an STR locus. This circumstance is a potential source of error in the interpretation of engraftment analysis, especially if only one informative allele is used to monitor engraftment.     

游离缘指甲DNA检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合状态的变化

目的 探讨异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后用患者指甲游离缘标本进行短片段重复序列(short tandem repeat,STR)基因分型和供受者嵌合率检测的适用性,并观察移植后患者指甲中供受者嵌合状态变化.方法 选取2009年7月至2011年9月在北京市道培医院行allo-HSCT的25例患者及25名供者.采集患者及其供者外周血、骨髓、指甲游离缘和口腔黏膜标本.提取标本中基因组DNA,进行15个STR位点的基因分型和嵌合状态分析.将患者分为2组:第1组包括12例患者,在接受allo-HSCT后1个月内分别同时采集患者的指甲游离缘标本和口腔黏膜标本,并做嵌合状态的比较;第2组包括13例患者,观察患者行allo-HSCT后3个月指甲标本中的嵌合状态,并对其中3例患者进行多次指甲标本采集和嵌合状态检测.结果 在第1组12例患者中,指甲标本均检测为患者自身的STR基因型;在4份口腔黏膜标本中检测到供受者混合嵌合状态,供者STR基因型所占比例分别为16.7％、32.1％、35.8％和60.7％.在第2组13例患者中,5例患者存在供受者细胞的混合嵌合状态,即受者指甲中出现供者的STR基因型,嵌合率在6.7％至82.6％之间.3例行allo-HSCT后多次检测指甲嵌合率的患者中,1例始终未检测到供者基因型的嵌合,另2例患者中检测到持续存在的供者基因型的嵌合.结论 移植后1个月内采集的指甲游离缘标本可用于患者STR基因型鉴定和供受者嵌合率分析,优于口腔黏膜标本.供者的移植物中具有可以分化成为皮肤组织的细胞,部分患者移植后皮肤中可长期存在供者来源细胞的嵌合状态.     

一种基于单核苷酸多态性位点的定量检测异基因造血干细胞移植后嵌合率的新方法

目的 建立一种单核苷酸多态性-聚合酶链反应(SNP-PCR)定量检测异基因造血干细胞移植后供受嵌合率的新方法 ,探讨其可行性、准确性及优越性.方法 利用18个SNP位点筛选移植前每一对供、受者,采用实时定量PCR(RQ-PCR)对筛选出的差异位点行嵌合率定量分析,通过倍比稀释、模拟嵌合与微卫星重复序列-PCR(STR-PCR)、性染色体双色荧光原位杂交(XY-FISH)和融合基因的定量检测,比较、验证方法 的准确性及敏感度.结果①利用内参质粒标准品扩增的17次标准曲线,平均斜率为-3.39,平均截距为39.97,相关系数均＞0.995,扩增效率接近理想水平;批内差及批间差分别为0.50%和1.10%,在可控范围;与模拟混合嵌合相关系数在0.99以上;可重复敏感度达0.01%.②40例移植患者中,95%以上可以筛选出供、受者差异SNP位点;SNP-PCR与STR-PCR结果吻合率达96.7%,与XY-FISH结果比较差异无统计学意义(P＞0.05);SNP-PCR与特定白血病融合基因检测结果比较,完全嵌合(CC)标本均未检出肿瘤相关的融合基因,部分嵌合(MC)标本融合基因均为阳性.结论 SNP-PCR检测嵌合率准确、敏感、易行,具有极高的临床应用前景,克服了STR-PCR竞争抑制及扩增平台期偏倚的缺点,可以替代其进行临床常规检测.     

异基因造血干细胞移植后细胞嵌合状态动态监测的临床意义

目的 研究异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后各系细胞嵌合状态与移植物植入、急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物被排斥和疾病复发的关系.方法 对65例患者进行allo-HSCT,在移植后定期采集所有患者的外周血和骨髓.用流式细胞术分选了65例患者的CD3+T淋巴细胞,52例分选了CD3-CD56+CD16+NK细胞,32例分选了CD15+粒细胞,20例分选了CD19+B淋巴细胞.进行PCR扩增短串联重复序列检测各系细胞嵌合状态.结果 移植后NK细胞早期植入比例(55.5%)最高,T细胞最晚(+21 d)达到完全供者嵌合状态.+7 d T淋巴细胞供者嵌合比例(DC)≥70%和+14 d T淋巴细胞DC≥95%属aGVHD发生的高危患者.除急性淋巴细胞白血病外,出现移植物被排斥的分子生物学征象者和疾病复发者,都以T淋巴细胞供者嵌合状态下降为主.在过继免疫治疗中,动态检测嵌合状态可以判断疗效和指导进一步的治疗.结论 allo-HSCT后T淋巴细胞嵌合状态动态检测可以早期预测发生aGVHD的高危患者、判断移植物植入、发现移植物被排斥和疾病复发并指导免疫调节治疗的时机和疗效.     

STR-PCR和FISH在监测异性别异基因造血干细胞移植后嵌合状态中意义的比较

本研究比较短串联重复序列PCR（STR—PCR）和荧光原位杂交（FISH）两种方法在异基因造血干细胞移植后血细胞嵌合状态监测中的意义。对38例接受异性别异基因造血干细胞移植的患者,采用STR—PCR和FISH定量测定移植后14、28天和3个月的骨髓或外周血细胞嵌合状态。结果表明,14天时STR—PCR和FISH同时检测的30例中分别有14例和8例达到完全嵌合（CC,P〉0．05）。28天时两者同时检测的31例中分别有26例和15例达到CC（P〈0．01）。3个月时两种方法共同监测的24例中分别有22例和17例达到CC（P〉0．05）。连续监测3个月以上的28例患者中14倒发生移植物被排斥或复发,其中9例由FISH首先检出（P〈0．05）。结论：FISH检测比STR—PCR更为准确地反映移植早期造血细胞嵌合状态,有助于监测移植物被排斥和疾病复发。