PCR-反向点杂交法检测 HBV 耐药变异与基因型的探讨

目的：探讨 PCR-反向点杂交法检测 HBV 耐药变异与基因型的相关性及 HBV 变异位点与肝功能指标、HBVDNA病毒载量的关系。方法筛选符合条件的462例服用核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本,用 PCR-反向点杂交法检测 HBV 的耐药突变位点以及基因型,并对 HBV 耐药变异与基因型、肝功能检测指标、HBV DNA 病毒载量等指标进行相关性分析。结果在462例服用核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎患者血清中检测耐药变异株45例,变异率约为9．74％;其中180M 和204I/V 突变株16例,35．5％;204V 突变株6例,13．3％;204I 突变株13例,28．9％;180V 突变株3例,6．7％;181V 突变株3例,6．7％;207I 突变株1例,2．2％,236T 突变株3例,6．7％。HBV 基因型中 B 基因型105例,C 基因型337例,B 基因型和 C 基因型联合感染4例,D 基因型0例,其他基因型2例。将检测结果与临床资料进行相关性分析：乙肝患者的耐药变异位点与基因型、肝功能指标 ALT 无相关性（P ＞0．05）,与 HBVDNA 病毒载量有一定相关性（P ＜0．05）。结论1．茂名地区的 HBV 基因型可能与其他南方地区的基因型有差异,以 HBV-C 基因型为主;2．PCR-反向点杂交法是一种快速、准确发现核苷类药物治疗后耐药位点的检测方法;3．通过临床资料分析显示乙肝患者的耐药变异位点与肝功能指标 ALT 间差异无统计学意义（P ＞0．05）,即无相关性,HBV-DNA 病毒载量间差异有统计学意义（P ＜0．05）,即有一定相关性。     

浙江省义乌市登革病毒核酸及IgM抗体检测结果分析

目的对浙江省义乌市义亭镇等部分辖区内登革热疑似病例及其周围人群(未发病)进行登革病毒核酸及IgM抗体检测,及时查找病原,明确病因,为登革热疫情的防制工作提供技术支持。方法分别用实时荧光定量PCR法检测登革病毒核酸和ELISA法检测登革病毒IgM抗体。结果登革热疑似病例血清标本98份,检出登革3型病毒核酸阳性标本57份,阳性检出率为58.16%(57/98);发病后1~3 d采血与4~6 d采血进行核酸检测,阳性检出率差异有统计学意义(χ2=6.6147,P0.05);登革病毒核酸检测阴性标本进行登革病毒IgM抗体检测,阳性检出率为56.10%(23/41);病例周围人群监测登革病毒IgM抗体,阳性检出率为22.73%(83/365)。结论此次传染病疫情由登革3型病毒引起,实时荧光定量PCR法更适合登革病毒感染者的早期诊断。周围人群中存在登革病毒隐性感染者。     

乙型肝炎病毒表面抗原阴性271例隐匿性感染的研究

目的了解在乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性人群中隐匿性感染情况。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应检测271例重庆黔江区HBsAg阴性住院患者血清中HBV-DNA含量。结果271例HBsAg阴性人群血清HBV—DNA阳性率为10．7％，HBV-DNA含量均低于10^3 copy／mL。HBV—DNA检出率与性别、年龄无关。在HBV-DNA阳性人群中抗-HBc抗体出现率较高，抗-HBs阳性或乙型肝炎病毒标志物全阴性也可检出HBV-DNA。结论血清HBsAg阴性者存在一定比例的隐匿性感染，对不明原因的肝损害、输血、器官移植等应结合灵敏度高的HBV-DNA检测结果再作判断。     

从石蜡包埋的淋巴瘤组织提取DNA并定量检测EB病毒

目的 定量检测石蜡包埋的淋巴瘤组织中EB病毒（EBV）的表达,方法 对TES水浴DNA提取法进行了改良,从石蜡包埋的淋巴瘤组织中提取高质量的基因组DNA,以实时荧光定量PCR方法检测淋巴瘤组织EBV。结果在60例标本中平均提取DNA量为3．97ng（10／μm厚切片2片）,86．7％（52／60）标本DNA的纯度（260nm／280nm）≥1．6,其中50％（30／60）淋巴瘤组织EBV呈阳性表达（10^0～10^6拷贝／ngDNA）。结论 采用改良TES水浴法能获取石蜡包埋组织中高质量基因组DNA,使用该新的实验技术可有效地利用现有的标本资源进行与疾病相关科学的研究。     

女性生殖道人乳头瘤病毒与解脲支原体感染之间的相关性研究

目的：探讨女性人乳头瘤病毒（HPV）感染情况及与解脲支原体（UU）感染之间的相关性。方法采用 PCR-反向点杂交基因分型技术对412例女性患者宫颈分泌物进行23种 HPV 亚型感染检测;将 HPV 阳性的患者设为观察组,同时随机选取50例 HPV 阴性的患者作为对照组,运用实时荧光 PCR 同时检测上述2组 UU 的感染情况。结果HPV 总的感染率为12．86％（53/412）,有16种型别被检出,感染率最高的为高危 HPV 52型。HPV 阴性对照组的 UU 阳性率为30．00％（15/50）,而 HPV阳性观察组中 UU 的阳性率为60．38％（32/53）,明显高于 HPV 阴性对照组,差异有统计学意义（P ＜0．05）。结论HPV 感染与UU 感染具有一定的相关性,在临床治疗中应予以重视。     

慢性HBV感染患者血清中HBsAg与抗-HBs两种标志物同时阳性罕见模式的分析

目的 通过分析慢性HBV感染患者乙型肝炎病毒（HBV）血清学标志物HBsAg与抗-HBs同时阻性这种罕见模式的病例，来探讨其存在的原因及临床价值。方法 采用电化学发光法（ECLIA）检测患者血清中的HsBAg，抗-HBs，HBeAg，抗-HBe，抗-HBc，5种标志物，采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测HBV DNA。结果 HBsAg与抗-HBs同时阳性的罕见模式组仍有病毒复制。应用HBIG治疗失败时可以出现HBsAg与抗-HBs同时阳性。结论 HBsAg和抗-HBs同时阳性并非疾病真正好转的指标。     

套式PCR法检测外周血肺炎衣原体DNA

目的探讨外周血单个核细胞(PBMC)中肺炎衣原体(Cpn)DNA的检测方法.方法用淋巴细胞分层法和低渗溶血法提取PBMC.设计2对引物用套式PCR(nPCR)法测定150例冠心病患者(冠心病组)外周血PBMC中Cpn-DNA.同期临床55例非冠心病患者作对照组.结果冠心病患者肺炎衣原体DNA阳性率32.7%,对照组阳性率为1.8%,两组差异显著(P＜0.001),OR 26.2,95%CI 3.52～194.98.冠心病组中无症状组阳性率为29.1%,不稳定型心绞痛组阳性率为39.6%,急性心肌梗死组阳性率为29.9%,各亚组间差异不显著(P＞0.05).结论用nPCR法检测PBMC中Cpn-DNA,可为临床Cpn感染的诊断提供依据.     

噻唑橙光化学法对红细胞中病毒及细菌灭活作用的研究

目的探讨噻唑橙(TO)光化学法对红细胞中病毒及细菌灭活效果。方法以伪狂犬病毒(PRV)和辛德毕斯(Sindbis)病毒为指示病毒,分别加入红细胞比积为20%的红细胞悬液中,TO孵育1 h后做476 nm光照射处理;研究病毒灭活动力学特征;做TO浓度(C)、光照强度(I)、光照时间(T)三因素三水平正交试验确定最优灭活条件;最优条件下检测裸照、密闭血袋中、密闭血袋充氧后的病毒灭活效果;最优条件下检测血液污染常见细菌小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌灭活效果。结果病毒灭活动力学研究显示:在60μmol/LTO、1.06E-01 w·m-2·nm-1光强条件下,照射5 min可将大部分PRV和Sindbis病毒灭活,20 min灭活作用达峰值,分别为5.88和5.12 LogTCID50;正交试验显示:裸照时PRV及Sindbis病毒灭活最优条件均为I=1.33E-01 w·m-2·nm-1,T=20 min,C=80μmol/L;在此条件下,可灭活红细胞中PRV≥6.13LogTCID50(裸照,n=4)、(4.75±0.62)LogTCID50(密闭血袋,n=4)、(6.06±0.16)LogTCID50(密闭血袋充氧,n=4);可灭活红细胞中Sindbis病毒(5.41±0.12)LogTCID50(裸照,n=4)、(3.72±0.77)LogTCID50(密闭血袋,n=4)、(5.76±0.25)LogTCID50(密闭血袋充氧,n=4)。在此条件下细菌灭活效果:小肠结肠炎耶尔森氏菌(5.91±0.13)Log10、金黄色葡萄球菌6.8Log10、表皮葡萄球菌6.0 Log10。结论 TO光化学法可有效灭活红细胞中病毒,有氧情况下(裸照或充氧)病毒灭活效果好于密闭无氧。TO光化学法可有效灭活红细胞中细菌。     

Multiplex PCR for the simultaneous detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus,classical swine fever virus,and porcine circovirus in pigs

A multiplex polymerase chain reaction (PCR) was designed for the simultaneous detection of three viruses involved in reproductive and respiratory failure in pigs: porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), classical swine fever virus (CSFV) and porcine circovirus type 2 (PCV-2). Each target produced a specific amplicon with a size of 718 bp (PRRSV), 288 bp (CSFV), or 466 bp (PCV-2). The sensitivity of the multiplex PCR using purified plasmid constructs containing the specific viral target fragments was 2.0 × 10⁴, 2.5 × 10³, and 6.0 × 10² copies for PRRSV, CSFV, and PCV-2, respectively. Non-specific reactions were not observed when other viruses, bacteria, and PK-15/Marc-145 cells were used to assess the multiplex PCR. Among 82 clinical samples from Fujian province, co-infection by PRRSV and CSFV was 12.19%, co-infection by PRRSV and PCV-2 was 21.95%, CSFV and PCV-2 was 13.41%, and co-infection by the three viruses was 3.66%. In conclusion, the multiplex PCR should be useful for routine molecular diagnosis and epidemiology. The multiplex PCR was effective in detecting various combinations of one or more of these viruses in pig specimens.     

探讨乙型肝炎病毒携带产妇HBV-DNA水平对新生儿的影响

目的探讨乙型肝炎病毒携带产妇血清HBV－DNA水平对乳汁和新生儿HBVDNA水平的影响,以此指导孕期处理和喂养方式。方法选择2012年1～12月的乙型肝炎病毒携带产妇120例,检测产妇血清、乳汁和新生儿血清中的HBV-DNA水平,对结果进行综合分析。结果64例产妇血清HBV－DNA〈500copies／mL,其乳汁HBV－DNA检出阳性为1例,新生儿血清HBVDNA检出阳性1例;29例产妇血清HBV－DNA水平为500copies／mL至1．0×106copies／mL,其中4例乳汁HBVDNA检出阳性,新生儿血清HBV-DNA检测均为阴性;27例产妇血清HBV-DNA水平大于或等于1．0×106copies／mL,其中25例乳汁HBV-DNA阳性,1例新生儿血清HBV-DNA检测阳性。结论产妇血清HBV-DNA水平大于或等于1．0×106copies／mL时,产妇乳汁中的HBV-DNA阳性检出率将大幅度增加,应该禁止母乳喂养;产妇血清中HBV-DNA水平对于宫内传播无明显影响。     

血液病患者血液中肺炎支原体和发酵支原体的检出

目的　探讨血液病患者血液中肺炎支原体和发酵支原体的分离检出。方法　分别对101例确诊为血液病患者和65名非血液病对照者的血液标本进行肺炎和发酵支原体分离培养和聚合酶链反应鉴定,阳性标本进一步经电镜确认。 结果　101例血液病患者血液标本中共计检出肺炎和发酵支原体17例（16.8%）,其中肺炎支原体9例（8.9%）,发酵支原体8例（7.9%）,体检对照组血液中未检出肺炎和发酵支原体（0.0%）,组间差异有统计学意义（IP/I0.01）。 结论　血液病患者血液中肺炎支原体和发酵支原体的检出显著高于非血液病对照组,确切机制有待进一步探讨。     

外周血游离LUNX mRNA检测在非小细胞肺癌患者辅助诊断中的意义

目的：检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血细胞外游离 LUNX mRNA,探讨其在 NSCLC 辅助诊断中的意义。方法选择原发性NSCLC患者65例,将体检正常的50例健康者设为对照组。采用实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测其外周血游离LUNX mRNA,评价该指标对NSCLC辅助诊断的价值。结果65例肺癌患者38例外周血游离LUNX mRNA 检出阳性,阳性率显著高于健康体检者,差异有统计学意义（P＜0．01）;低分化以及晚期肺癌患者该基因检出阳性率高于中高分化及早期肺癌患者,差异有统计学意义（P＜0．01）;LUNX mRNA阳性率与患者性别、年龄、肿瘤组织类型、发生部位及患者吸烟与否无关。结论外周血游离LUNX mRNA检测对NSCLC具有特异辅助诊断价值。     

兰州地区慢性乙型肝炎与人类白细胞抗原-DRB1等位基因关系的初探

目的　探讨人类白细胞抗原(HLA) DRB1基因频率与乙型肝炎病毒感染的相关性。方法　用聚合酶 链反应/序列特异性引物法对兰州地区汉族健康者48例、慢性乙型肝炎患者53例和急性乙型肝炎感染者21例进行 HLA DRB1等位基因分型,并作相关性分析。结果　兰州地区慢性乙型肝炎组HLA DRB1 07X的频率明显高于健 康对照组和急性自限性感染组(P<0.05)。结论　HLA DRB1 07X可能与兰州地区汉族慢性乙型肝炎感染相关, 免疫遗传因素参与慢性乙型肝炎的发病机制。     

外周血中检测乳腺癌细胞株hMAM表达的方法探讨

目的建立逆转录结合荧光定量PCR(FQ-PCR)检测外周血乳腺癌细胞hMAM基因表达方法,了解其监测乳腺癌细胞微转移的应用价值。方法克隆目的片段,制备标准品并作测序验证。培养乳腺癌MDA-MB453、MCF7细胞株,制成血液标本模型,GAPDH基因为内对照,逆转录结合FQ-PCR检测乳腺癌细胞株血标本模型和10例乳腺癌患者外周血的hMAM表达。结果电泳和测序证实,克隆产物系预期的目的片段。FQ-PCR标准曲线的相关系数为-1.0;用103copies/μl标准品重复检测5次,x±s:718.9±120.5,CV16.7%;MDA-MB453细胞的血标本作灵敏度试验,相当于104个血细胞中含1个乳腺癌细胞可检出阳性。未检测到MCF7细胞的hMAM表达。10例乳腺癌患者,淋巴结转移的5例中,3例hMAM表达阳性、2例阴性;无淋巴结转移的5例中,1例hMAM表达阳性、4例阴性。结论本方法可有效监测外周血中微转移的乳腺癌细胞,发现不同乳腺癌细胞系hMAM表达程度差异大。     

儿童病毒性脑膜炎、脑炎中肠道病毒感染的分子生物学分型检测及临床研究

目的探讨儿童病毒性脑膜炎、脑炎中肠道病毒感染的分子生物学分型。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及简并引物扩增并测序,利用Genbank核对分型,检测东营地区2008年1月-2012年2月63例临床诊断为病毒性脑膜炎、脑炎患儿脑脊液中的肠道病毒(EV)RNA,并结合临床特点进行分析。结果 63例病毒性脑膜炎、脑炎患儿的脑脊液经RT-PCR检测,EV感染阳性率为74.6%(47/63)。利用通用引物筛选出的阳性标本,并采用简并引物经两次PCR共获得阳性结果 31例(66.0%)。随机抽取23条阳性片段进行克隆测序,测序结果与Gen Bank标准EV毒株进行同源性对比分析,相关序列同源性均在97%以上。肠道病毒引起中枢神经系统感染的临床特征在各个年龄组有所不同,33例急性期EV患儿脑脊液中白细胞数不同程度增高(均数76×106/L)。结论 EV是儿童无菌性脑膜炎、脑炎的最主要的病原体。采用RT-PCR可以快速准确的检测出中枢神经系统感染的肠道病毒;采用分型引物扩增并测序,将EV的VP1部分序列与GENBANK中的EV标准毒株进行对比,根据基因序列的同源性进行EV型别鉴定是一种切实可行的方案。EV引起的病毒性脑膜炎临床症状一般较轻、无特异性,多数患儿CSF中白细胞高于正常范围。     

荧光定量PCR法和基因芯片分型法检测人乳头瘤病毒的敏感度比较研究

目的：比较荧光定量聚合酶链反应法（简称荧光定量法）与基因芯片分型法（简称基因芯片法）在检测人乳头瘤病毒（H PV ）中的敏感度。方法选取2010年2月至2013年2月来该院妇科门诊就诊的患者305例,收集其宫颈脱落细胞,分别用荧光定量法和基因芯片法检测 H PV ,对结果不一致的病例采用测序法进行确证。305例病例均进行液基细胞学检测。结果荧光定量法检测 HPV敏感度为33．8％,基因芯片法检测HPV敏感度为37．6％,两种方法具有较高的一致性,HPV感染率随宫颈脱落细胞异型性增加而增加。结论荧光定量法和基因芯片法检测 H PV具有较高的一致性,其中基因芯片法敏感度较高。宫颈细胞学改变的严重程度与 HPV感染情况呈正相关。     

温抗体型自身免疫性溶血性贫血患者外周血B细胞激活因子的变化及意义

目的 探讨温抗体型自身免疫性溶血性贫血(warm autoimmune hemolytic anemia,WAIHA)患者外周血B细胞激活因子(B cell activating factor,BAFF)的变化及意义.方法 采用ELISA法检测30名健康成人(对照组)和43例WAIHA患者治疗前后血清可溶性BAFF(sBAFF)水平,采用实时定量PCR法榆测外周血单个核细胞(PBMNC)BAFF mRNA表达水平.结果 WAIHA患者治疗前血清sBAFF水平和PBMNC中BAFF mRNA表达水平分别为2311(825-6523)as/L和884(463～2346)ng/L,较治疗后患者组[分别为1201(358～5014)ng/L和486(138～2699)ns/L]和对照组[分别为1128(590～3201)ns/L和341(102～965)ng/L]增高,差异均有统计学意义(P值均<0.01),而治疗后患者组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).治疗前有效组和无效组血清sBAFF水平和PBMNC中BAFF mRNA表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05).有效组治疗前后血清sBAFF水平和PBMNC中BAFF mRNA表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.01);无效组治疗前后相比,差异无统计学意义(P>0.05).治疗前后患者血清sBAFF水平和PBMNC中BAFF mRNA表达水平呈正相关(均P<0.05).结论 血清sBAFF水平和PBMNC中BAFF mRNA表达水平在WAIHA患者明显增高,其动态变化与病情变化有关.     

Evaluation of RNA and E2 antibodies in prospectively followed recipients of hepatitis G virus-infected blood

BACKGROUND: Hepatitis G virus (HGV) has recently been cloned and tests for HGV RNA and envelope antibodies (anti-E2) have been developed. HGV infection is widespread among blood donors worldwide, but the clinical and serologic outcome of transfusion-associated HGV infection has not been fully characterized. STUDY DESIGN AND METHODS: Consecutive blood donors (n = 2210) were investigated for HGV markers (RNA and anti-E2). The recipients of HGV RNA-positive blood were followed for 1 year after transfusion. RESULTS: Forty-two blood donors (1.9%) were positive for HGV RNA. Eight recipients of HGV RNA-positive blood were retrospectively identified within 2 weeks of transfusion and prospectively followed. In four patients, the presence of anti-E2 before transfusion or an early antibody response protected them from reinfection or prevented HGV persistence, while, in the remaining four patients, transient or persistent viremia was detected shortly after exposure. None of the infected recipients had any evidence of liver disease. CONCLUSION: These results do not support the screening of donors to prevent transfusion-associated HGV infection.