噬菌体表达短肽模拟旋毛虫抗原表位及其抗血吸虫保护性免疫研究

目的　从噬菌体随机肽库中筛选出模拟旋毛虫特异性抗原表位的短肽分子 ,探讨其抗血吸虫的交叉免疫保护效果。　方法　以纯化的旋毛虫感染鼠血清IgG为配基 ,亲合筛选法富集特异性噬菌体 ,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性 ;混合噬菌体克隆经皮下免疫小鼠 3次 ,攻击感染后第 4 5天剖杀小鼠 ,观察减虫和减卵效果。　结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体得到了有效的富集 ,第三轮洗脱噬菌体的产量约为第一轮的 15 0倍。随机挑取 2 4个噬菌体克隆经ELISA测定 ,有 2 1个克隆能与旋毛虫感染鼠血清IgG特异性反应。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率与减卵率分别为 4 2 8%与 6 6 3% (P <0 0 0 1)。　结论　利用噬菌体随机肽库技术可获得模拟旋毛虫特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导明显的抗血吸虫的保护性免疫。     

日本血吸虫雌虫抗原模拟表位的筛选及免疫保护性

目的　筛选日本血吸虫雌虫抗原的模拟表位 ,并探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。　方法　用日本血吸虫雌虫免疫兔血清IgG作配体对噬菌体随机 12肽库进行 3轮亲和筛选 ,随机挑取 18个噬菌体克隆用Dot ELISA检测其特异性 ,并对其中的 4个阳性克隆进行测序。分别在 0、2、4周用混合噬菌体克隆免疫小鼠 3次 ,第 6周每鼠经腹部感染 40条日本血吸虫尾蚴 ,42d后剖杀冲虫 ,计数虫数和每克肝卵数。　结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体富集了 2 0 0多倍 ,随机挑取的 18个克隆经Dot ELISA鉴定有 17个能与雌虫抗原免疫兔血清呈阳性反应。DNA自动测序的 4个序列与GenBank的已知序列均无同源性。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为 2 6.5 7% ,减卵率为 65 .3 4%。　结论　采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫。     

噬菌体表达短肽模拟血吸虫致弱尾蚴特异性抗原表位的研究

目的　从噬菌体随机肽库中筛选模拟血吸虫致弱尾蚴特异性抗原表位的噬菌体克隆 ,并探讨其免疫保护效果。方法　用紫外线致弱尾蚴免疫兔血清IgG筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体外壳蛋白Ⅲ表达的随机 7肽库 ,三轮免疫筛选后获得的噬菌体克隆经皮下免疫小鼠 3次 ,攻击感染 45d后剖杀 ,观察减虫和减卵效果。结果　经三轮筛选 ,特异性结合的噬菌体富集增加了 10 0多倍 ,随机挑取 2 4个噬菌体克隆经ELISA测定 ,有 2 2个克隆能与致弱尾蚴免疫兔血清IgG特异性反应。混合噬菌体克隆免疫小鼠试验的减虫率与减卵率分别为 33.5 7%和 5 6 .0 7% (P均 <0 .0 0 1)。结论　采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟致弱尾蚴特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫     

日本血吸虫雌虫抗原模拟表位的筛选及免疫保护性

目的筛选日本血吸虫雌虫抗原的模拟表位，并探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。方法用日本血吸虫雌虫免疫兔血清IgG作配体对噬菌体随机12肽库进行3轮亲和筛选，随机挑取18个噬菌体克隆用Dot-ELISA检测其特异性，并对其中的4个阳性克隆进行测序。分别在0、2、4周用混合噬菌体克隆免疫小鼠3次，第6周每鼠经腹部感染40条日本血吸虫尾蚴，42d后剖杀冲虫，计数虫数和每克肝卵数。结果经3轮筛选，特异性噬菌体富集了200多倍，随机挑取的18个克隆经Dot-ELISA鉴定有17个能与雌虫抗原免疫兔血清呈阳性反应。DNA自动测序的4个序列与GenBank的已知序列均无同源性。与对照组相比，混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为26．57％，减卵率为65．34％。结论采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫特异性抗原表位的短肽分子，这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫。     

用日本血吸虫感染新模型兔血清筛选噬菌体随机肽库的初步研究

目的在建立一种有成虫寄生但无虫卵肉芽肿形成的日本血吸虫感染小鼠及家兔新模型,并观察其具有较高的抗攻击感染保护力的基础上,用新模型兔血清筛选噬菌体随机12肽库,并初步鉴定阳性噬菌体克隆诱导小鼠抗日本血吸虫感染的免疫保护作用.方法用大肠杆菌抗原吸收后的新模型兔血清,经抗体捕获法筛选噬菌体12肽库,经3轮亲和筛选、富集后获得阳性多克隆.用常规ELISA法检测阳性多克隆噬菌体的抗原性.用滴度为1×1014pfu的阳性多克隆噬菌体按0-2-4周方案皮下多点注射免疫小鼠,末次免疫4周后,用日本血吸虫尾蚴攻击感染,同时设立常规感染兔血清筛获的阳性克隆免疫组、原始肽库免疫组、攻击感染对照组.结果①新模型兔血清筛获的多克隆噬菌体(滴度为1×1014pfu)与新模型兔血清(稀释度为1:400)反应为强阳性,与常规感染兔血清(1:400)反应为弱阳性,与正常兔血清(1:400)反应为阴性.②用新模型兔血清筛获的多克隆噬菌体、常规感染兔血清筛获的多克隆噬菌体及原始肽库分别免疫小鼠后诱导抗攻击感染的减虫率及每克肝脏减卵率分别为27.2%和38.8%、17.8%和35.0%、4.5%和6.0%.结论与用日本血吸虫常规感染模型兔血清筛获的多克隆噬菌体比较,经新模型兔血清筛获的含有模拟日本血吸虫抗原表位的多克隆噬菌体能诱导小鼠更高的抗攻击感染减虫率(P＜0.05)及相似的减卵率(P＞0.05);与原噬菌体随机肽库相比较,能诱导小鼠较高的抗攻击感染减虫率(P＜0.01)及减卵率(P＜0.05).     

日本血吸虫抗原模拟表位免疫学活性的初步研究

目的　研究从噬菌体 12肽库中筛选得到的日本血吸虫抗原模拟表位的免疫学活性。　方法　以日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白 (Ig)作为靶分子 ,筛选噬菌体 12肽库。经过 3轮吸附 -洗脱 -扩增的淘筛过程 ,在筛选得到的阳性噬菌斑中随机挑取 42个扩增 ,用ELISA检测不同寄生虫病患者和正常人血清 ,以分析其敏感性和特异性。并进一步免疫昆明株小鼠 ,经日本血吸虫尾蚴攻击感染后剖检 ,计算减虫率和减卵率 ,以分析其在小鼠体内诱导的免疫保护性。　结果　在挑取的 42个阳性克隆中 ,有 9个与日本血吸虫急感患者血清有不同程度的结合 (6.2 5 %～ 10 0 % )。除其中 1个灵敏性较低的克隆与其它寄生虫病患者血清有一定的交叉反应外 ,其余均未发现。而经其免疫后的小鼠也分别获得了 2 9.3 %减虫率和 3 5 .9%减卵率。　结论　从噬菌体 12肽库中筛选到的日本血吸虫抗原模拟表位具有较高的特异性和敏感性 ,并能够在小鼠体内诱导一定的免疫保护力。     

日本血吸虫抗原模拟表位免疫学活性的初步研究

目的研究从噬菌体12肽库中筛选得到的日本血吸虫抗原模拟表位的免疫学活性。方法以日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白(Ig)作为靶分子，筛选噬菌体12肽库。经过3轮吸附-洗脱-扩增的淘筛过程．在筛选得到的阳性噬菌斑中随机挑取42个扩增，用ELISA检测不同寄生虫病患者和正常人血清，以分析其敏感性和特异性。并进一步免疫昆明株小鼠，经日本血吸虫尾蚴攻击感染后剖检，计算减虫率和减卵率，以分析其在小鼠体内诱导的免疫保护性。结果在挑取的42个阳性克隆中，有9个与日本血吸虫急感患者血清有不同程度的结合(6．25％～100％)。除其中1个灵敏性较低的克隆与其它寄生虫病患者血清有一定的交叉反应外，其余均未发现。而经其免疫后的小鼠也分别获得了29．3％减虫率和35．9％减卵率。结论从噬菌体12肽库中筛选到的日本血吸虫抗原模拟表位具有较高的特异性和敏感性，并能够在小鼠体内诱导一定的免疫保护力。     

日本血吸虫22.6kDa有效抗原表位对小鼠免疫保护性的研究

目的研究日本血吸虫(中国大陆株)22.6 kDa有效抗原表位对小鼠的免疫保护性,预测其在抗血吸虫感染中的作用.方法用纯化的抗Sj 22.6 kDa的多克隆抗体IgG对噬菌体12肽库进行5轮免疫学筛选,挑取克隆,经Western-blot免疫识别、动物初筛及序列分析后,将获得的阳性克隆免疫BABL/c小鼠.结果共获得4个有效抗原表位,各免疫组和对照组相比,4种表位混合免疫组小鼠,获得了39.5%(P＜0.05)的减虫率及57.1%(P＜0.01)肝总减卵率;4种表位分别免疫4组小鼠,各组分别获得了27.5%(P＜0.05)、5.4%(P＜0.05)、22.8%(P＜0.05)、11.6%(P＜0.05)的减虫率及41.4%(P＜0.01)、29.7%(P＜0.05)、32.2%(P＜0.05)、30.9%(P＜0.05)肝总减卵率.结论所获得4种有效抗原表位均可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力,可望为血吸虫疫苗研究增加新的内容.     

日本血吸虫保护性抗原模拟表位的筛选及其免疫保护作用的研究

目的在前期已建立日本血吸虫感染兔新模型的基础上,用该血清从噬菌体随机12肽库中筛选阳性单克隆噬菌体,并鉴定其诱导小鼠的免疫保护效果。方法通过给感染日本血吸虫家兔注射酚氧化酶抑制剂,抑制其体内日本血吸虫雌虫产卵,建立无虫卵肉芽肿的日本血吸虫感染动物新模型,用其血清筛选出阳性多克隆噬菌体,经与可溶性虫卵抗原(SEA)免疫兔血清充分吸附后,从中随机挑取14个单克隆分别纯化、扩增,用常规ELISA法检测阳性单克隆噬菌体的抗原性;挑选出与新模型兔血清呈强阳性反应,但与SEA免疫兔血清呈阴性或弱阳性反应的单克隆噬菌体,按1×1015pfu/次剂量,0-2-4周方案,皮下多点注射免疫小鼠。末次免疫4周后,每鼠经腹部皮肤攻击感染(40±1)条日本血吸虫尾蚴,感染42d后观察减虫率及减卵率。结果所选14个单克隆噬菌体均能与新模型兔血清和常规感染模型兔血清反应,尤其是第8号和第13号2个克隆与新模型兔血清呈强阳性反应,但与SEA免疫兔血清呈阴性反应;8号、13号单克隆噬菌体及原始噬菌体肽库免疫小鼠后诱导抗攻击感染的减虫率及每克肝脏减卵率分别为35.81%和63.32%、32.09%和52.02%、14.90%和30.64%。结论阳性多克隆噬菌体与SEA免疫兔血清免疫吸附后能去除大部分表达SEA抗原模拟表位的克隆,所选14个单克隆噬菌体均表达     

日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和表位疫苗联合免疫诱导的保护性免疫研究

目的 探讨日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和日本血吸虫抗原表位疫苗联合免疫对昆明感染鼠的免疫保护作用。方法 将制备的日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和用特异性抗体筛选噬菌体随机12肽库获得的日本血吸虫抗原表位疫苗联合或单独免疫昆明鼠,共3次,分别在0、2、4周进行。每次背部皮下多点注射50μg重组铁蛋白和/或10~(13)pfu表位疫苗,第6周每鼠经腹部感染(40±1)条日本血吸虫尾蚴。攻击感染后42d剖杀冲虫,计数成虫及肝虫卵数。在免疫前和末次免疫后从小鼠尾静脉采血,分离血清,用间接ELISA法检测抗体反应。结果 联合免疫组与对照组相比,获得了32.8％的减虫率和63.0％的减卵率;单独重组铁蛋白疫苗免疫组的减虫率为21.6％,减卵率为49.5％;单独表位疫苗免疫组减虫率和减卵率分别为17.1％和44.3％,显著低于联合组(P<0.05);联合免疫组小鼠体内IgG的抗体水平明显高于其他各组。结论 日本血吸虫重组铁蛋白疫苗和表位疫苗联合免疫的效果优于单独应用铁蛋白免疫和表位疫苗免疫。     

Phage displaying peptides mimic schistosoma antigenic epitopes selected by rat natural antibodies and protective immunity induced by their immunization in mice

AIM: To obtain the short peptides mimic antigenic epitopes selected by rat natural antibodies to schistosomes, and to explore their immunoprotection against schistosomiasis in mice. METHODS: Adults worm antigens (AWA) were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and enzyme-linked transferred immunoblotting methods with normal SD rat sera (NRS). The killing effects on schistosomula with fresh and heat-inactivated sera from SD rats were observed. Then the purified IgG from sera of SD rats was used to biopan a phage random peptide library and 20 randomly selected positive clones were detected by ELISA and 2 of them were sequenced. Sixty female mice were immunized thrice with positive phage clones (0, 2nd, 4th wk). Each mouse was challenged with 40 cercariae, and all mice were killed 42 d after challenge. The worms and the liver eggs were counted. RESULTS: NRS could specifically react to the molecules of 75 000, 47 000, 34 500 and 23 000 of AWA. Sera from SD rats showed that the mortality rate of schistosomula was 76.2%, and when the sera were heat-inactivated in vitro, the mortality rate was decreased to 41.0% after being cultured for 48 h. The specific phages bound to IgG were enriched about 300-folds after three rounds of biopanning. Twenty clones were detected by ELISA, 19 of them bound to the specific IgG of rat sera. Immunization with these epitopes was carried out in mice. Compared with the control groups, the mixture of two mimic peptides could induce 34.9% (P = 0.000) worm reduction and 67.6% (P = 0.000) total liver egg reduction in mice. Two different mimic peptides could respectively induce 31.0% (P= 0.001), 14.5% (P= 0.074) worm reduction and 61.2% (P= 0.000), 35.7% (P = 0.000) total liver egg reduction. The specific antibody could be induced by immunization of the mimic peptides, and the antibody titer in immunized mice reached more than 1:6 400 as detected by ELISA. CONCLUSION: Specific peptides mimic antigenic molecules can be obtained by biopanning the phage random peptide library and a partially protective immunity against schistosome infection can be stimulated by these phage epitopes in mice.     

随机肽库筛选弓形虫特异性抗原表位诱导保护性免疫的研究

目的　从噬菌体随机肽库中筛选出模拟弓形虫特异性抗原表位的短肽分子 ,并探讨其对弓形虫的保护性效果。方法　以纯化的弓形虫免疫兔血清IgG为配基 ,亲和筛选法富集特异性噬菌体 ,随机挑取噬菌体克隆用夹心ELISA法和Dot-ELISA法检测其特异性 ,混合 4个阳性克隆免疫小鼠 ,1月后攻击感染 ,观察小鼠发病时间和死亡时间。结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体得到了有效富集 ,第 3轮洗脱噬菌体的产量为第 1轮的 16 7倍 ,随机挑取 2 7个噬菌体经Dot -Bloting和夹心ELISA法检测 ,有 2 4个能与弓形虫免疫兔血清及单克隆抗体特异反应。用致死量弓形虫攻击感染经阳性克隆免疫的小鼠 ,存活时间明显长于对照组。结论　免疫筛选噬菌体随机多肽库可获得具有保护性的弓形虫抗原表位 ,为弓形虫疫苗研制提供了新途径。     

用噬菌体随机肽库鉴定日本血吸虫22.6kDa抗原分子的表位

目的　筛选和鉴定日本血吸虫 (中国大陆株 ) 2 2 .6kDa抗原 (Sj2 2 .6)的表位。　 方法　用纯化的抗Sj2 2 .6的多克隆抗体IgG对噬菌体十二肽库进行 5轮免疫学筛选 ,挑取克隆 ;采用Westernblotting免疫识别 ,将获得的阳性克隆免疫小鼠 ,并采用dot ELISA筛选能刺激小鼠产生较高滴度抗Sj2 2 .6抗体的阳性克隆 ;测定核苷酸序列 ,分析其表位与Sj2 2 .6抗原的同源性。　结果　经 5轮免疫学筛选后挑取的 1 4个克隆 ,用Westernblotting方法均能被抗Sj2 2 .6抗体识别。经动物免疫初步实验筛选 ,共获得 6个免疫原性较强的阳性克隆 ,测序结果获得 4种不同表位 ,其中 1种表位与Sj2 2 .6抗原具有较高的同源性 ,其余 3种表位与其无一级结构的同源性。　结论　获得的 4种日本血吸虫中国大陆株抗原表位 ,1种可能为结构表位 ,3种为模拟表位     

重组日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团对小鼠免疫保护作用的研究

目的探讨重组日本血吸虫四跨膜蛋白第二亲水基团融合蛋白（GST-TSP2HD）抗血吸虫感染免疫保护效果。方法采用Glutathione sepharose 4B胶亲和层析法大量制备GST-TSP2HD蛋白。实验组以GST-TSP2HD融合蛋白的福氏佐剂抗原免疫C57BL/6J小鼠,同时设置佐剂对照组及GST蛋白免疫对照组,每2周加强免疫1次。加强免疫2次后每只小鼠经腹部皮肤感染（45±2）条血吸虫尾蚴。感染42 d后剖杀小鼠,经生理盐水静脉灌注收集成虫,计数减虫率,用KOH溶液消化肝组织收集虫卵,计算减卵率。组织切片观察小鼠肝组织病理变化,通过酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中的抗体水平。结果与佐剂对照组相比,GST-TSP2HD融合蛋白免疫组的减虫率为27.10%,减卵率为32.30%;与GST蛋白免疫组相比,GST-TSP2HD融合蛋白免疫组可获得39.57%的减虫率,43.53%的减卵率。GST-TSP2HD融合蛋白免疫组肝组织中的虫卵肉芽肿数量明显减少,单个虫卵肉芽肿平均直径比佐剂对照组、GST蛋白免疫组分别下降了27.08%（P〈0.05）和40.53%（P〈0.01）,差异均有统计学意义。GST-TSP2HD能诱导高水平抗TSP2HD蛋白的特异性抗体IgG,其中IgG1、IgG2b和IgG2c亚类可能在小鼠抗血吸虫感染保护性免疫中发挥重要作用。结论日本血吸虫四跨膜蛋白是一个有效的日本血吸虫病疫苗候选分子。     

日本血吸虫rSj338及膜蛋白rSj22.6抗原表位联合免疫对小鼠的保护性研究

目的 观察日本血吸虫（中国大陆株）的线粒体相关蛋白rSj338及膜蛋白rSj22.6有效抗原表位混合后对小鼠的免疫保护性，为将来复合疫苗的研制提供理论依据。方法 分别用特异性抗rSj338抗体和抗rSj22.6的抗体筛选噬菌体随机12肽库，将获得的rSj338的有效抗原表位与rSj22.6有效抗表位混合后免疫BALB／c小鼠，并与rSj338的有效抗原表位混合免疫组进行比较。结果 rSj338的4种表位和rSj22.6抗原的4种表位混合免疫组小鼠获得了45．4％（P＜0．01）的减虫率及59．1％（P＜0．01）肝总减卵率，rSj338的4种表位混合免疫组小鼠获得了34．2％（P＜0．01）的减虫率及46．8％（P＜0．01）肝总减卵率；rSj338 4种表位和rSj22.6的4种表位混合免疫组获得的减虫率和肝总减卵率均高于rSj338的4种表位混合免疫组，差异有显著性（P＜0．05）。结论 两种抗原分子的有效抗原表位联合免疫的效果优于单个抗原分子的有效抗原表位。     

日本血吸虫云南品系SIEA对小鼠感染皖鄂品系血吸虫的免疫保护作用

目的观察日本血吸虫云南品系未成熟卵可溶性抗原SIEA免疫小鼠后攻击感染皖鄂品系血吸虫尾蚴,是否也能诱导出免疫保护效果。方法20只ICR小鼠随机分为免疫组和对照组,经日本血吸虫云南品系SIEA免疫后攻击感染皖鄂品系血吸虫尾蚴,感染后46d观察减虫率、粪卵减少率、雌虫子宫内虫卵数、肝表面虫卵结节数、肝脏各期虫卵数及各期虫卵构成比。结果SIEA免疫后粪卵及雌虫子宫内虫卵减少率分别为34．45％,23．69％（P〈0．05）;肝表面虫卵结节密度下降29．03％（P〈0．05）;肝组织内虫卵减少29．07％（P〈0．05）,成熟虫卵减少48．41％（P〈0．05）。肝组织内成熟虫卵比例下降,未成熟卵比例增加（P〈0．05）。结论日本血吸虫（云南品系）未成熟卵可溶性抗原（SIEA）的抗原性较强,小鼠经云南品系SIEA免疫后攻击感染皖鄂品系血吸虫尾蚴也诱导小鼠产生了抗卵胚发育及抗雌虫生殖免疫力,结果提示将来在中国大陆使用SIEA疫苗时,似可不必考虑血吸虫品系的影响。