重组pEGFP/Ang-1质粒转染兔骨髓基质干细胞及其表达的实验研究

目的 制备稳定高效表达血管生成素-1(Ang-1)的转基因工程骨髓基质干细胞。方法 应用基因重组的方法构建Ang-1真核表达质粒pEGFP／Ang-1，利用脂质体将pEGFP／Ang-1转入骨髓基质干细胞，用流式细胞仪检测转染率，用荧光显微镜和免疫细胞化学方法检测蛋白质的表达。结果 质粒酶切电泳显示重组质粒构建成功，转染pEGFP／Ang-1质粒的骨髓基质干细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光；流式细胞仪检测转染率约50％；免疫细胞化学检测可见转基因骨髓基质干细胞表达Ang-1蛋白。结论 成功制备表达外源性基因Ang-1的骨髓基质干细胞，制备方法是可行的。     

GDNF基因转染诱导神经干细胞向神经元分化的作用

目的探索转染GDNF基因到大鼠神经干细胞(neural stemcell,NSC)的方法,并研究其诱导大鼠神经干细胞向神经元和多巴胺能神经元分化的作用。方法体外扩增GDNF基因,并构建带有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体PcDNA3-GDNF-GFP质粒。悬浮培养大鼠胚胎神经干细胞,脂质体介导PcDNA3-GDNF-GFP质粒转染神经干细胞,荧光显微镜观察转染及表达情况;免疫细胞化学鉴定β-微管蛋白Ⅲ(β-Tubulin III)和酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH),以确定神经干细胞的分化为神经元和多巴胺能神经元情况。结果转染后72 h,荧光蛋白大量表达。脂质体介导PcDNA3-GDNF-GFP质粒转染神经干细胞后,神经干细胞分化为神经元和多巴胺神经元的比例明显增高。结论脂质体介导GDNF基因转染神经干细胞的方法简单、有效,是一较为理想的基因转染方法。GDNF基因能明显促进神经干细胞分化为神经元和多巴胺神经元的比例。     

增强型绿色荧光蛋白-C1转染示踪骨髓间充质干细胞

目的：应用增强型绿色荧光蛋白-C1（enhanced green fluorescent protein,pEGFP-C1）标记骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MMSCs）,以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法：在体外分离培养大鼠MMSCs,流式细胞仪检测细胞表型,以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因,荧光显微镜观察基因表达。结果：pEGFP-C1在基因转染24 h后开始表达,48-72 h达高峰,12-14 d后有较多的表达。结论：由脂质体介导的质粒pEGFP-C1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。     

胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共转染神经干细胞实验研究

目的 探讨神经干细胞转染的新方法,并观察转染后目的 基因的表达情况.方法 原代培养神经干细胞,运用jet PEI转染试剂将目的 基因胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和内皮素B受体基因(EDNRB基因)共转染至神经干细胞内,免疫荧光显微镜观察、流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,测定转染效率,RT-PCR检测目的 基因表达情况.结果 成功培养出可用于基因转染的神经干细胞,转染后24h即可在免疫荧光显微镜下观察到GFP表达,流式细胞仪显示24、48和72 h转染效率分别为15.36%、24.67%和25.73%.RT-PCR显示目的 基因在神经干细胞内成功表达.结论 运用iet PEI成功将目的 基因转染至神经干细胞内,为相关神经变性痍病的基因治疗打下了实验基础.     

稳定表达的人自身免疫调节因子HeLa细胞的建立及鉴定

目的 :建立稳定表达人自身免疫调节因子 ( autoimmune regulator,AIRE)的细胞株。方法 :用 Fu GENE6转染试剂将含 AIRE c DNA的真核表达载体转染 He La细胞 ,经 G41 8筛选阳性克隆。继续培养 4周 ,用荧光显微镜观察、流式细胞仪 ( FACS)检测和免疫印迹法检测 AIRE基因在 He La细胞中的稳定表达情况。结果 :经荧光显微镜、流式细胞仪及免疫印迹法检测 ,证实 AIRE基因得到了稳定表达。结论 :在 Fu GENE6转染试剂的介导下 ,AIRE基因在 He La细胞内获得稳定表达     

脂质体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的脂质体介导IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞（MSCS），并研究对MSCS成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法以密度梯度离心结合全骨髓培养法获得纯化骨髓间充质干细胞（MSCs），经流式细胞仪检测，细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，但是CD14和CD45表达阴性。采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3．1-IGF-1转染MSCs，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达行Western blot检测。结果获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞（MSCs）；脂质体为介导将全长兔IGF-1目的基因导入MSCs，Western blot鉴定转染成功，转染后的MSCs较未转染MSCs成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

一种高效转染西藏小型猪胚胎成纤维细胞的方法

目的应用Nucleofector II核转染仪将外源基因EGFP导入西藏小型猪胚胎成纤维细胞(PEFs),并与脂质体转染的方法进行比较,寻求一种高效转染猪胚胎成纤维细胞的方法。方法使用Lonza公司的Nucleofector II核转染仪,参考已报道的转染程序与相应的转染试剂,将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入西藏小型猪PEFs,并与脂质体转染的方法进行对比研究,比较两种方法的转染效率。结果转染5 h后,核转染仪组镜下即可见绿色荧光,转染效率高达80%,远远高于脂质体转染的方法。结论用Nucleofector II核转染仪能实现西藏小型猪PEFs的高效转染,为高效制备转基因克隆西藏小型猪提供了可靠的方法。     

两种方法介导外源基因稳定转染大鼠肝癌细胞株的有效性及其对细胞生长影响的比较

目的探讨磷酸钙共沉淀法与阳离子脂质体试剂形成复合物法两种基因转染方法构建大鼠肝癌细胞克隆株的有效性及对生长影响的比较。方法将携带增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1分别用脂质体形成复合物法、磷酸钙共沉淀法导入大鼠肝癌CBRH-7919细胞,G418筛选基因稳定转染阳性单细胞克隆株。RT-PCR法检测EGFP基因在细胞中的表达。结果两种方法转染CBRH-7919细胞24h后,倒置相差荧光显微镜下观察均见绿色荧光。G418加压筛选14d后均形成阳性克隆,倒置相差荧光显微镜下可见绿色荧光,脂质体法的细胞克隆荧光强度强于磷酸钙。阳性克隆株经RT-PCR法检测,750bp于450bp处均有特异性条带。结论两种细胞转染方法均可使增强型绿色荧光蛋白基因稳定转染CBRH-7919,为今后探讨外源目的基因对靶细胞生长特性的影响奠定前期实验基础。     

电离辐射对不同启动子驱动的GFP报告基因表达的影响

目的 研究电离辐射调控脂质体介导的EGR-1基因启动子，CMV启动子驱动的GFP报告基因在人肝癌7402细胞内的表达。方法 利用CMV启动子，EGR-1基因启动子构建pcDNA3-CMV-GFP,pcDNA3-EGR-GFP重组质粒，经阳离子脂质体LipofectAMINE介导转染人肝癌7402细胞株，对脂质体转染条件进行优化，在最佳转染条件下，分别给予不同浓度H2O2，不同剂量γ射线处理转染细胞，用荧光显微镜，流式细胞仪（FAC）检测GFP的表达情况。结果 FACS检测显示氧自由基，电离辐射可诱导FGR-1基因启动子驱动的GFP基因表达。而不诱导CMV启动子驱动的GFP表达。结论 EGR-1基因启动子具有电离辐射诱导特性。     

脂质体介导转染bcl-2反义核酸进入HL60细胞的动力学模式和生物学效应

bcl- 2基因是重要的抗凋亡和耐药基因 ,在造血系统恶性肿瘤细胞中普遍高表达。利用 bcl- 2反义核酸有望抑制bcl- 2基因的表达 ,促进细胞凋亡 ,提高肿瘤对化疗的敏感性。　目的　应用阳离子脂质体介导或寡核苷酸直接转染技术 ,建立 HL6 0细胞摄入荧光素标记的 bcl- 2寡核苷酸的动力学模式 ,研究脂质体介导下 bcl- 2反义核酸对 HL6 0细胞的生物学效应 ,初步探讨脂质体的生物学作用。　方法　应用荧光素标记的寡核苷酸 ,凝胶电泳观察脂质体寡核苷酸复合物的形成 ,流式细胞仪测定细胞内的平均荧光强度和 bcl-2蛋白的表达 ,荧光显微镜观察细胞内荧光物质的分布 ,3H-Td R掺入法和 MTT法检测 HL6 0细胞的生长 ,RT- PCR法检测细胞内 bcl- 2 m RNA的表达水平。　结果　 (1)当脂质体与寡核苷酸的质量比合适时 ,两者可形成复合物。(2 )脂质体介导转染法显著提高 HL6 0细胞对寡核苷酸的摄入 ,当脂质体与寡核苷酸的质量比 (μg/ μg)为 2 .0 / 1时 ,细胞内相对平均荧光强度可达寡核苷酸直接转染时的 40倍 ,而且 HL6 0细胞对寡核苷酸的摄入与其浓度和作用时间有关 ,未标记的寡核苷酸竞争性抑制细胞对标记寡核苷酸的摄取。 (2 )细胞内的寡核苷酸可向胞外转运 ,脂质体介导转染后 ,胞内荧光强度衰减缓慢 ,t1 /2 约为 4h,