RNA干扰及其在胶质瘤基因治疗中的应用

RNA干扰（RNA interference。RNAi）是双链RNA（double—stranded RNA，dsRNA）降解特异性靶基因转录出的mRNA。从而抑制靶蛋白表达的现象。自从二十世纪九十年代发现RNAi这一现象以来，RNAi已被广泛应用于研究基因功能、信号转导通路和基因治疗等方面。随着分子生物学、分子遗传学等学科的发展．发现了许多与肿瘤发生、发展和预后密切相关的基因。经过大量临床前期试验表明，针对特异性靶基因的小干扰RNA（short／small interfering RNA．siRNA）治疗胶质瘤是行之有效的。为基因治疗胶质瘤提供了新的思路。[第一段]     

RNA干涉技术在胶质瘤基因治疗研究中的进展

RNA干涉(RNA interfernce,RNAi)机理为利用双链RNA(dsRNA)特异性地降解相应序列的mRNA成为siRNA,从而特异性地阻断靶基因的表达,最近对其在应用于胶质瘤基因治疗方面的研究也有进展。本文介绍了RNA干扰的分子机制、技术应用及在胶质瘤基因治疗方面的进展和广阔的发展前景。     

RNA干扰技术在胶质瘤治疗中的应用

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是生物体中普遍存在的、细胞本身固有的对抗外源基因侵害的一种自我保护现象。其作为新兴的基因表达阻断技术，目前已成功用于基因功能和肿瘤相关基因等方面的研究，为临床上特异性的基因干预治疗开辟了一条新的途径。     

RNA干扰技术原理及其在脑胶质瘤治疗中的应用

RNA干扰是dsRNA在转录后水平特异性降解目的基因mRNA,导致该基因沉默的现象。脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,传统的手术、放、化疗均不能达到彻底治愈的目的。RNA干扰在脑胶质瘤治疗中的应用,可能会取得更好的效果。本文就RNA干扰技术原理及其在脑胶质瘤治疗中的应用的研究进展作一综述。     

胶质瘤治疗的靶分子CDC2 RNA干扰的体外实验研究

目的 探讨抑制细胞周期依赖性激酶CDC2基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响,并为其作为胶质瘤发生发展相关基因在胶质瘤治疗方面的应用价值提供实验依据.方法 利用本实验室基因重组构建的CDC2 shRNA逆转录病毒表达质粒对体外培养的人脑胶质瘤细胞进行转染.倒置显微镜观察细胞形态和数量变化;RT-PCR及荧光实时定量PCR检测CDC2 mRNA表达;Western blot检测CDC2蛋白表达;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化;透射电子显微镜观察细胞超微结构.结果 人脑胶质瘤细胞系U251在转染针对CDC2的shRNA逆转录病毒表达质粒48h后,贴壁生长的细胞逐渐漂浮,细胞生长受到抑制,CDC2 mRNA下调均达98%以上,蛋白表达下调达92%以上,同时出现了明显的细胞G2/M期阻滞,细胞凋亡由0.57%上升到13.01%,并且超微结构受损明显.结论 CDC2 shRNA逆转录病毒表达质粒介导的RNA干扰能有效的抑制U251细胞的增殖,CDC2可作为胶质瘤基因治疗靶分子作进一步研究.     

RNA干扰胰岛素样生长因子结合蛋白2基因治疗胶质瘤的体外实验研究

目的 研究与胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGF-BP2)对胶质瘤的抑制作用.方法 化学合成3条针对IGF-BP2的siRNA和1条阴性对照siRNA,采用小分子干扰RNA技术使胶质瘤U251细胞的IGF-Bit2基因沉默.通过逆转录PCR和免疫组化的方法检测IGF-BP2的表达,用MTT法检测干扰后U251细胞的增殖活性变化.结果 逆转录PCR检测表明转染后24 h IGF-BP2的mRNA表达明显降低,空白对照、阴性对照、脂质体、siRNA1、siRNA2、siRNA3组中IGF-BP2 mRNA水平分别为:0.88±0.02,0.87±0.03,0.84±0.02,0.65±0.03,0.55±0.04和0.64±0.02.48 h分别为0.93±0.04.0.90±0.04,0.93±0.03,0.76±0.04,0.58±0.03和0.75±0.02,72 h为0.95±0.04,0.95±0.03,0.94±0.02,0.78±0.05,0.60±0.02和0.76±0.03.3条siRNA中siRNA2作用最显著.免疫组织化学方法检测表明IGF-BP2的蛋白表达阳性率也由92.3%明显降低至24 h的15%,至48 h为52.5%,仍低于正常胶质瘤细胞.RNA干扰后胶质瘤细胞的MTT值虽在缓慢升高,于24 h相对于对照组差异无统计学意义,但至48 h和72 h均低于对照组(P＜0.05).结论 理想的IGF-BP2小分子干扰RNA序列能够抑制该基因的mRNA和蛋白的表达并能抑制胶质瘤细胞的增殖活性.     

RNA干扰Bmi-1对胶质瘤细胞增殖的影响

目的 初步探讨Bmi-1基因对胶质瘤细胞增殖状况的影响.方法 采用RNA干扰技术沉默U251胶质瘤细胞中Bmi-1基因,RT-PCR检测干扰效果,CCK8观察U251细胞的增殖状况.结果 RNA干扰Bmi-1后,Bmi-1基因表达降低,U251细胞增殖减慢.结论 Bmi-1基因可以促进胶质瘤细胞的增殖,有可能促进了...     

RNA干扰及其在神经变性性疾病研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱发序列特异的转录后基因沉默(PTGS)的现象，它可以通过抑制蛋白表达模拟基因敲除技术。RNAi主要通过dsRNA被核酸酶Dicer切割成21～25nt的小干扰RNA(siRNA)，由siRNA介导识别并靶向切割同源mRNA分子而实现。随着研究的不断深入，RNAi的作用机制将逐步被阐明，其技术也将日趋完善和成熟，并将得到广泛的应用。本文就RNAi技术的研究进展及其在阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性性疾病研究中的应用作一综述。     

小干扰RNA沉默RHBDF1基因抑制胶质瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的初步研究

目的 检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞内的表达,以及小干扰RNA沉默C6胶质瘤细胞内RHBDF1基因后是否诱导C6细胞凋亡和抑制细胞生长,为基因治疗胶质瘤寻找新的靶基因. 方法采用Western blot检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞(包括C6、U251和MGR2)的表达情况:用脂质体转染法分别将RHBDF1 siRNA或对照siRNA转染入C6细胞内,RT-PCR和Western blot方法检测siRNA转染后对C6细胞内RHBDF1基因和蛋白的影响;Tune1法检测RHBDF1基因沉默后对细胞凋亡的诱导情况,Ki-67免疫荧光染色观察RHBDF1基因沉默后对细胞生长抑制的影响.结果 与正常胶质细胞比较,胶质瘤细胞内RHBDF1基因存在着过度表达.siRNA转染入C6细胞后.对照siRNA组凋亡率为2.96%±1.25%,而RHBDF1siRNA1组和RHBDF1 siRNA2的凋亡率分别为36.35%±4.85%和33.58%±4.08%:对照siRNA组细胞增殖率为95.96%±3.25%,而RHBDF1 siRNA1组和RHBDF1 siRNA2组的细胞增殖率分别为24.57%±5.53%和25.68%±4.08%;组间细胞凋亡率和增殖率比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 RHBDF1基因在胶质瘤细胞内存在过度表达,沉默该基因后可以诱导细胞凋亡和抑制细胞生长,RHBDF1基因可能成为基因治疗胶质瘤的一个新的靶基因.     

特异性小干扰RNA沉默Polo样激酶1基因表达对恶性胶质瘤细胞增殖的影响

目的 探讨Polo样激酶1(PLK1)基因对胶质瘤细胞增殖的影响和可能机制. 方法 根据PLK1基因特点,设计并用化学方法合成了5个小干扰核糖核酸分子(siRNA)(P1、P2、P3、P4和P5).以这5个siRNA转染人胶质瘤TJ905细胞后.分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot检测PLK1 mRNA和蛋白表达水平.分别采用MTT法和Western blot方法检测癌细胞增殖和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白水平,用TRA-.ELISA方法检测胶质瘤细胞端粒酶活性. 结果 所设计的5个siRNA均能明显抑制胶质瘤TJ905细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好.以P4转染处理胶质瘤细胞后与脂质体对照组比较,PLK1基因mRNA水平和蛋白水平明显下调,差异有统计学意义(P均=0.000).MTT结果显示.与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组癌细胞生长明显受到抑制,且呈浓度依赖性(r=0.868,P=0.000).Western blot结果显示,与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组PCNA蛋白水平明显下降,差异有统计学意义(F=181.36,P=0.000).TRAP-ELISA结果显示,与脂质体对照组比较P4 siRNA转染组胶质瘤细胞端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性(P=0.000). 结论 PLK1基因对胶质瘤细胞增殖具有重要的调控作用;以PLK1 siRNA转染处理胶质瘤细胞,可明显抑制胶质瘤细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关.     

小干扰RNA在哺乳动物脑组织中的递送

背景：作为一种能够下调基因表达的新的基因治疗方法，RNA干扰在神经科学疾病的治疗中有很大的潜能。通过引入与内源靶基因具有相同序列的小干扰RNA，可以人为地诱导序列特异性的mRNA降解，达到阻止该基因表达的目的。 目的：针对RNA干扰在神经科学疾病治疗方面的应用，探讨小干扰RNA在哺乳动物脑组织中的递送情况。 方法：以“siRNA，delivery，brain”和“siRNA, delivery，vivo”为检索词，计算机检索PubMed home，按纳入和排除标准对文献进行筛选和质量评价，共纳入27篇文章。从小干扰RNA合成、脑组织中的递送及其抑制效率和不良反应3方面进行总结。 结果与结论：近来RNA干扰研究中，高精度预测小干扰RNA的方法能合成出高特异性的小干扰RNA；小干扰RNA在脑组织中的递送主要采用局部注射的方式，并且在递送载体的帮助下，抑制效率在不断地提高；随着RNA干扰技术研究的深入，其不良反应也逐渐受到人们重视。总之，作为一种新的治疗策略，RNA干扰在神经科学疾病的治疗中有着很大的潜能，并可能给药物研发带来新的变革。     

RNA干扰敲低Dicer对胶质瘤细胞恶性表型的影响

目的 观察应用RNA干扰(RNAi)技术敲低Dicer酶后,在体外对U251人胶质瘤细胞生物学特征的影响.方法 构建针对Dicer基因的小分子干扰RNA重组腺病毒表达载体(rAd-Dicer)转染至U251细胞.应用RT-PCR检测Dicer mRNA水平的变化,应用免疫荧光和Western blot方法检测Dicer基因在蛋白水平的变化,并对肿瘤细胞中相关功能蛋白的表达进行分析比较.应用MTT法、流式细胞术和Transwell方法评价肿瘤细胞转染前后生物学行为的变化.结果 rAd-Dicer可显著抑制U251细胞Dicer基因的表达;与正常对照组(control)和阴性对照组(rAd-HK)比较,Western blot分析结果显示p-AKT,MMP2/9,PCNA,Cyclin a,VEGF,CD34功能蛋白在rAd-Dicer转染组细胞中表达明显上调;细胞周期结果表明rAd-Dicer转染组进入S期的细胞数增加了 14.1%～15.3%,MTT和Transwell实验结果显示rAd-Dicer转染组细胞增殖速率和体外侵袭能力显著增强.结论 敲低Dicer酶表达后,U251细胞表型具有更为恶性转化的倾向,由此初步推测全面抑制细胞microRNAs表达有可能促进肿瘤生成.

Abstract：

Objective To investigate the effect of knocking down Dicer by RNAi on the biological characteristics of human glioma cells U251 in vitro.Methods The recombinant adenovirus expression vector which contained short hairpin RNA targeting Dicer (rAd-Dicer) was transfected into U251 cells.The silencing effect of RNAi on Dicer expression was identified by RT- PCR,immumofluorecence staining and Western blot.Western blot was also undertaken to analyze the expression of some functional proteins.The biological behavior changes of U251 cells trasfected by rAd- Dicer were evaluated by MTT,FCM and transwell assay.Methods rAd-Dicer dramatically down- regulated the expression of Dier in U251 cells.As compared with parental and rAd- HK transfected cells,the protein expression of p- AKT,MMP2/9,PCNA,Cyclin a,VEGF,CD34 were up- regulated in rAd-Dicer treated cells.Decreased dicer expression in rAd-Dicer transfected cells was accompanied by 14.1% to 15.3% increase in U251 cells in S phase.Meanwhile,the proliferation and invasive activity were significantly enhanced in rAd-Dicer transfected cells by the MTT and transwell assay.Conclusion Knockdown of dicer renders the U251 cells more malignant transformation.This preliminary finding suggests that global lowering expression of microRNAs may have an oncogenic role.     

RNA干扰技术及其应用

RNA干扰可抑制双链RNA同源基因的表达。目前RNA干扰已变成了一种强有力的新兴基因工具并具有广阔的应用前景。本文概述了RNA干扰的机制和生物化学方面的表现及其用途。     

环状RNA在胶质瘤中的研究进展

环状RNA(circRNA)是一种新型的环状功能性非编码RNA,在真核生物中广泛分布,与传统线性RNA分子相比,没有多聚腺苷酸尾结构,且具有更强的稳定性.circRNA在胶质瘤等多种肿瘤的发生发展进程中发挥重要调节作用,且已用作潜在的生物标志物和肿瘤相关治疗靶点.本文就circRNA的生物学特点、功能以及与神经胶质瘤相...     

RNA干扰介导的胶质瘤细胞IGF-1R基因下调诱导肿瘤细胞凋亡

目的应用RNA干扰(RNAi)技术介导胶质瘤C6细胞株胰岛素生长因子1受体(IGF1R)基因下调诱导C6细胞凋亡的研究。方法体外化学合成靶向IGF1R基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法将siRNA以不同浓度梯度转染C6细胞,设非特异的siRNA阳性对照组和未转染siRNA的阴性对照组:同时使用绿色荧光素标记的小干扰RNA(FITCsiRNA)转染细胞,荧光显微镜下观察siRNA转染效率;RT-PCR法半定量检测siRNA对IGF1R基因表达的抑制作用;流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见细胞质内清晰的绿色荧光,脂质体OligofectamineTM2000的转染效率接近100%;化学合成的siRNA明显抑制IGF1RmRNA的表达,各特异性siRNA不同浓度转染组IGF1RmRNA表达水平可下调约10%～80%,流式细胞术检测细胞凋亡率转染组为22.47%±3.15%,与阳性对照组2.3%±0.9%和阴性对照组1.14%±0.79%比较有明显提高,而阳性、阴性对照组相比无明显差异。结论化学合成的靶向IGF1R的siRNA可以明显下调IGF1R基因的表达,胶质瘤细胞凋亡率明显上升,为进一步进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。     

EphB4为靶的siRNA抑制脑胶质瘤细胞的体外实验研究

目的探讨EphB4在脑胶质瘤细胞中的生物学作用。方法采用免疫组化的方法检测EphB4在脑胶质瘤细胞中的表达。合成EphB4siRNA,应用脂质体转染U251细胞,RT-PCR、Western-blot检测对EphB4的转录及表达的抑制效果,MTT法检测其对细胞增殖的影响,Transwell试验检测细胞侵袭能力,TUNEL法检测细胞凋亡。结果应用siRNA方法明显降低了EphB4的转录(P0.01)及表达(P0.05),明显减慢了细胞的增殖速度(P0.05),加大siRNA浓度后,肿瘤细胞生长抑制进一步增强。S1组(25nmol/L)、S2组(50nmol/L)、S3组(100nmol/L)与U251组、siRNASCR组相比,侵袭能力明显降低(P0.05),凋亡细胞数量有明显增加(P0.05)。结论EphB4在脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡过程中发挥着重要的生物学调节作用。     

RNA干扰技术及其应用

RNA干扰可抑制双链 RNA同源基因的表达。目前 RNA干扰已变成了一种强有力的新兴基因工具并具有广阔的应用前景。本文概述了 RNA干扰的机制和生物化学方面的表现及其用途     

磁共振波谱分析在脑胶质瘤分级中的应用价值

目的分析氢质子磁共振波谱(~1H-MRS)分析在脑胶质瘤分级中的应用价值。方法回顾性分析我院2013-01—2016-06收治的经术后病理或活组织病理检查确诊的36例脑胶质瘤患者的临床资料,均行常规磁共振(MRI)及~1H-MRS检查,依据世界卫生组织(WHO)2007年分级方法分为低级别胶质瘤组(n=15)和高级别胶质瘤组(n=21),对比分析2组肿瘤占位核心实质区、瘤周区域及对侧镜像区胆碱复合物(Cho)、N-乙酰-L-天门冬氨酸复(NAA)、肌酐(Cr)脂质(Lip)、乳酸(Lac)。结果所有患者肿瘤占位核心实质的Cho/Cr比值均较对侧镜像区升高,NAA/Cr、NAA/Cho比值较对侧镜像区降低(P0.05)。高级别胶质瘤NAA/Cho比值低于低级别胶质瘤,而Cho/Cr高于低级别胶质瘤(P0.05)。高级别胶质瘤瘤周区域Cho/Cr比值较对侧镜像区升高,NAA/Cho比值较对侧镜像区降低(P0.05);低级别胶质瘤瘤周区域Cho/Cr比值较对侧镜像区升高,NAA/Cr、NAA/Cho比值较对侧镜像区降低(P0.05)。高级别胶质瘤组20例出现Lac峰,14例出现Lip;低级别胶质瘤组6例出现Lac峰,1例出现Lip峰。Cho/Cr比值与病理级别呈正相关(r=0.812,P0.05),而NAA/Cho比值与病理级别呈负相关(r=-0.634,P0.001),NAA/Cr与病理级别无明显相关性(r=-0.060,t=0.241)。结论氢质子磁共振波普能够有效显示脑胶质瘤患者肿瘤周围水肿区及肿瘤实质区的代谢变化情况,可为胶质瘤临床术前分级提供客观依据,提高诊断的准确性。     

垂体瘤转化基因RNA干扰对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响

目的 观察垂体瘤转化基因(PTTG)RNA干扰对胶质瘤细胞对化疗药物敏感性的影响.方法 实验分4组:对照组:对胶质瘤U251细胞不进行任何处理;替莫唑胺(TMZ)组:胶质瘤U251细胞培养基中加入TMZ;PTTG shRNA转染组:PTTG shRNA片段转染胶质瘤U251细胞;PTTG shRNA联合TMZ组:TMZ作用于转染PTTG shRNA片段的胶质瘤U251细胞.MTT法检测细胞生长状况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 MTT结果显示吸光度值在对照组、TMZ组、PTTG shRNA转染组、PTTG shRNA联合TMZ组分别为0.85±0.07、0.58±0.06、0.55±0.07、0.41±0.05,TMZ组、PTTG shRNA转染组、PTTG shRNA联合TMZ组细胞增殖抑制率分别为(31.56±5.51)%、(35.53±4.60)%、(51.49±6.74)%;PTTG shRNA组及TMZ组与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05),而PTTG shRNA联合TMZ组抑制细胞增殖更明显,与PTTG shRNA组及TMZ组比较差异有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,48 h时对照组凋亡率为(6.29±0.78)%,TMZ组为(33.61±4.88)%,PTTG shRNA组为(39.61±4.95)%,PTTG shRNA联合TMZ组为(66.23±7.60)%,PTTG shRNA组及TMZ组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而PTTG shRNA联合TMZ组的凋亡率较PTTG shRNA组及TMZ组明显增高,比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PTTGRNA干扰可以增强胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性,提高化疗效果.     

~(201)铊SPECT在脑胶质瘤监测中的应用

SPECT脑显像技术已经在临床上广泛应用,常规核素~(99m)Tc标记的化合物脑显像对胶质瘤的监测和疗效评价不够理想。近年来的研究表明,~(201) 铊(~(201)TL)是钾离子类似物,细胞对铊的摄取率与细胞膜上Na~+/K~+—ATP酶的活性有关。本文介绍铊的特性及其与脑恶性肿瘤的关系,综述了~(201)铊SPECT在胶质瘤的诊断、疗效评价、预后推测等方面的应用。