结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增出MPT64基因,产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化,酶切鉴定,克隆到pET21a原核表达载体,测序鉴定插入序列完全正确者转化大肠杆菌BL21,诱导表达MPT64融合蛋白,利用亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE电泳进行鉴定。结果成功构建MPT64表达载体,SDS-PAGE电泳鉴定成功表达MPT64蛋白。并以此蛋白进行结核抗体的检测,其特异性和敏感性分别为96%和43%。结论成功表达结核分枝杆菌MPT64蛋白,并进行特异性和敏感性的检测,证明重组的MPT64蛋白有希望成为结核病血清学诊断的组合抗原的候选者之一。     

结核分枝杆菌Mtb8.4-Hspx和Hspx-Mtb8.4重组基因克隆及表达

目的构建结核分枝杆菌去标签重组蛋白Mtb8.4-Hspx(MH)和Hspx-Mtb8.4(HM)原核表达载体,并在大肠埃希菌株BL21(DE3)中表达。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增Mtb8.4、Hspx基因,产物经纯化后与载体PET30a连接、转化及测序鉴定,构建原核重组表达质粒PET30a-Mtb8.4和PET30a-Hspx。抽提重组质粒,产物经纯化后与目的基因Hspx、Mtb8.4连接,转化及测序鉴定,构建重组目的基因质粒PET30a-Mtb8.4-Hspx(PET30a-MH)和PET30a-Hspx-Mtb8.4(PET30a-HM)载体,转化大肠埃希菌BL21,以IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测表达产物。结果 SDS-PAGE蛋白电泳验证去标签MH和HM融合蛋白分子质量单位为28 ku,与预期值相符。结论本研究成功表达去标签结核杆菌重组蛋白MH和HM,为结核亚单位疫苗免疫原性和临床前研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药相关蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段;通过pET28a构建表达载体pET28a-pncA,序列测定证实正确后转化大肠埃希菌DH10b,经IPTG诱导表达His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白。结果扩增出结核分枝杆菌pncA基因并构建了具有正确基因序列的质粒载体pET28a-pncA,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了分子质量单位约20ku的表达产物,并得到纯化的带His标签的目的蛋白。结论构建了结核分枝杆菌pncA基因原核表达质粒,并诱导表达了His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。     

结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体并进行表达、纯化.方法 用PCR扩增结核分枝杆菌mpt51基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后.再亚克隆人pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):mpt51重组体.结果 以pET30a(+):mpt51转化BL21(DE3)后.经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,重组菌表达出相对分子质量为38 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导4小时重组蛋白的表达量最高.表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中.表达量占全菌蛋白质的30%.经Ni-NTA树脂纯化,获得纯度为90%的重组蛋白.结论 成功地构建原核表达载体pET30a(+):mpt51,并获得MPT51重组蛋白.为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp16.3的表达、纯化及鉴定

目的构建结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3原核表达载体,获得Hsp16.3蛋白,并进行纯化及鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增Hsp16.3基因,以pET28a为载体,构建重组质粒pET28a-Hsp16.3,测序正确后,转入宿主菌BL21(DE3)进行诱导表达。融合蛋白经SDS-PAGE,Western blot分析鉴定,并通过镍柱进行亲和层析纯化,表达蛋白分子质量约17ku,能被结核杆菌16ku单抗和小鼠抗His Tag单抗识别。结果成功构建了Hsp16.3原核表达载体pET28a-Hsp16.3,并在宿主菌BL21(DE3)中表达,表达蛋白分子质量单位约17ku,能被结核杆菌16ku单抗和小鼠抗His Tag单抗识别。结论 Hsp16.3基因克隆入宿主菌中并成功表达,纯化Hsp16.3蛋白具有生物学活性,为Hsp16.3的进一步研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定

目的构建结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）RpfA的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出编码RpfA蛋白的Rv0867c基因,通过克隆载体pMD18-T构建质粒载体pMD18-T-Rv0867c。经酶切和DNA序列测定证实正确后,将Rv0867c基因克隆到pET32a（＋）载体并在大肠杆菌BL21中诱导表,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致。Western-blot结果显示,在相对分子量约102 kDa处有分别与Anti-His单抗、Rpf结构域单抗和TB病人血清特异性结合带。结论成功表达、鉴定和纯化了RpfA蛋白。     

结核分枝杆菌PE35在大肠杆菌中的可溶性表达及产物纯化

目的利用大肠杆菌表达系统大量获得重组的结核分枝杆菌PE35蛋白,并初步评估其在结核病血清学诊断方面的价值。方法用聚合酶链反应（PCR）方法从结核分枝杆菌H37Rv全基因组中获得PE35基因克隆到pET24b中,转化BL21（DE3）构建大肠杆菌表达株;聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定重组蛋白及其表达方式;使用Ni-sepharose纯化蛋白;Western-blot检测结核病人血清的抗结核抗体。结果酶切鉴定和DNA序列分析显示构建了正确的pET-PE35原核表达载体,并能在大肠杆菌BL21（DE3）中可溶性地表达分子量大小相符的重组蛋白。纯化后的蛋白纯度达到90%以上,能与结核病人血清抗体结合。结论成功地构建了pET-PE35原核表达载体,并获得较纯的重组PE35蛋白,此蛋白能检测结核病人血清抗体。为探讨PE35蛋白在结核病的基础研究与诊断运用奠定了基础。     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(CFP21)的基因克隆、表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白21 (Culture filtrate protein 21, CFP21)原核表达载体,获得CFP21蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,PCR 扩增cfp21基因,质粒PET28a ( + )为表达载体,构建PET28a（+）/cfp21质粒,转化入大肠埃希菌DH5α中,抽提质粒,PCR扩增,测序,转化到大肠埃希菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS PAGE分析,并用His Bind 蛋白纯化试剂盒纯化CFP21。结果构建、表达和纯化了CFP21,分子量约为24kD,主要以包涵体形式存在。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,纯化得到CFP21蛋白,为CFP21的进一步研究奠定基础。     

结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白原核载体的构建及在E．coli中的高效表达

目的获得高效表达的结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白（ESAT-6）。方法利用PCR方法扩增出ESAT-6基因片段,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-21b（＋）,酶切分析和序列测定鉴定出ESAT-6基因的阳性重组子,将其转化入EcoliBL21（DE3）,阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;重组蛋白经Ni-NTAHis·Bind Resins纯化。结果成功扩增出ESAT-6基因片段,构建了重组表达质粒pET-ESAT-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别。结论利用pET原核表达系统成功的对结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白进行高效表达和纯化,重组蛋白具有良好的免疫活性。     

结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性和克隆表达

目的鉴定结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性,克隆表达该基因并获得其重组蛋白。方法设计Rv1512基因的特异性引物,并鉴定其特异性。构建pET30a（＋）：Rv1512重组质粒,阳性克隆转化入大肠杆菌BL21。经Ni＋-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定该蛋白及其纯度。结果结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性被证实;经测序分析证实Rv1512原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE结果显示在40 kD处呈现单一蛋白条带。结论结核分枝杆菌Rv1512基因具有较好的特异性;成功构建表达载体pET30a（＋）：Rv1512并获得重组蛋白,为辅助诊断结核分枝杆菌的感染奠定基础。     

结核分枝杆菌mpt64基因重组穿梭表达载体的构建与鉴定

目的在分枝杆菌系统中表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64。方法用PCR法扩增mpt64基因,构建表达载体穿梭质粒pDE22-mpt64。在母牛分枝杆菌中表达MPT64蛋白,间接免疫荧光和Western-blot鉴定、离子亲和层析法纯化目的蛋白。结果大肠—分枝杆菌穿梭质粒pDE22-mpt64可以在母牛分枝杆菌中复制并表达26kDa蛋白。蛋白印迹实验证实可与抗His单克隆抗体特异结合。结论成功构建了结核分枝杆菌mpt64基因重组穿梭表达质粒,为进一步研究该蛋白奠定了的基础。     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M．tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增MTBrv3873基因,并克隆入pGEM～TEasy质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5a和BL21（DE3）菌后,经0．4mmol／L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,pET30a（＋）：rv3873表达出相对分子质量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50％,Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873,并获得重组Rv3873蛋白,为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定

目的　对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT - 6 4基因进行克隆 ,鉴定与表达 ,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法　以结核杆菌H3 7Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对基因MPT - 6 4进行扩增 ,产物与载体质粒pGEX - 4T - 1构建表达MPT - 6 4的重组质粒 ,将此重组质粒先转化到E coliDH5α内抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主E coliBL2 1(DE3)PLysS菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS -PAGE ,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫染色 ,一抗为结核分枝杆菌菌株H37Rv羊抗阳性血清。结果　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,所表达的蛋白质相对分子质量为 5 0 0 0 0 ,抗体检测有特异带大小为 5 0kDa。结论　目的基因克隆到菌株内 ,重组结核杆菌分泌蛋白MPT - 6 4的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT51在原核表达载体中的克隆、表达、纯化与鉴定

目的对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT51的基因进行克隆,表达,纯化与鉴定,为核酸疫苗的研制与应用打下基础。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR法对编码MPT51蛋白的抗原基因进行扩增,产物克隆到表达载体pET22b中,构建了含mpt51的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coliXLI-Blue内提取质粒,酶切及测序鉴定,再转化入E.coliBL21(DE3)PLysS菌株内,以IPTG进行诱导后,破菌,离心,包涵体经尿素变性溶解后用His·Bind亲和层析柱纯化,透析复性,纯化后蛋白进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行特异性免疫检测。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达,所表达的蛋白质相对分子质量为27800,抗体检测有特异条带,大小为27.8kDa。结论目的基因克隆到了表达载体内并证明表达,重组结核杆菌分泌蛋白MPT51的成功表达为核酸疫苗的研制与应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的　构建结核分枝杆菌早期分泌蛋白Ag85B和MPT6 4融合基因 (AM )及其原核表达质粒并进行表达。方法　采用 geneSOEing法将ag85b和mpt6 4用疏水甘氨酸接头 (Gly4Ser) 3 融合 ,经限制性内切酶切后克隆入原核表达载体pET32a中 ,进行酶切、PCR鉴定和DNA序列测定。将重组质粒转染Ecoli BL2 1,经过IPTG诱导后其表达产物进行SDS -PAGE和免疫印迹分析。结果　AM融合基因定向克隆入 pET32a中 ,双向测序验证碱基突变率为 0 11% (2 / 170 7) ,均为无意义突变。SDS -PAGE和免疫印迹分析结果均显示在约 73kDa的位置可见明显的蛋白条带。结论　成功地构建了ag85b -mpt6 4融合基因及其原核表达质粒 ,重组质粒能够在大肠杆菌在中表达。     

结核分枝杆菌PPE19的克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE19的GST融合蛋白表达载体,并鉴定其在大肠杆菌中的表达。方法以结核杆菌H37Rv基因组为模板,根据PPE19基因序列设计引物,运用PCR的方法获得PPE19基因,并将其克隆到pGEX-kg载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行质粒的酶切和序列分析;将构建正确的克隆进行诱导表达,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析;用western-blot鉴定融合蛋白的表达。结果正确构建了pGEX-PPE19原核表达载体,载体上基因序列正确;载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白;该蛋白能与GST抗体结合。结论成功构建了GST-PPE19融合蛋白的表达载体,为进一步进行PPE19蛋白的功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用

目的　获得重组MPT64蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白,通过Westernblotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pET15b MPT64测序表达除83位密码子由CCA突变为CCG外,其余密码子均与报道的相同,但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL21 (DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的20～30%,分子量约26kDa,Westernblotting分析它与抗结核分枝杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为80%左右,每100ml培养菌可获得10mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值 +2S为正常界限值,PDD的特异性和敏感性分别为94% (31/33)、63.7% (21/33)、66.7%;rMPT64纯化蛋白分别为94% (31/33)、30.3(10/33);一步法分别为88% (29/33)、66.7% (22/23)。结论 pET15b MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表达重组MPT64蛋白,该蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

分枝杆菌胞壁融合表达Ag85B-ESAT-6穿梭质粒的构建

目的　构建E coli BCG(BacilleCalmette Guerin)穿梭载体 ,在母牛分枝杆菌细胞壁融合表达结核分枝杆菌 (MTB)的分泌蛋白Ag85B ESAT 6。方法　用聚合酶链反应 (PCR)从MTB毒株H3 7Rv基因中扩增出结核分枝杆菌 190 0 0抗原 ( 19 ss)胞壁区及其上游调控元件基因 ,克隆入E coli BCG穿梭载体 pOLYG中 ,构建表达蛋白能嵌入细胞壁中的E coli BCG穿梭载体。用间接免疫荧光染色法观察该载体携带所构建的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B和ESAT 6基因在母牛分枝杆菌宿主中的融合表达。结果　经测序证实所克隆的 19 ss基因序列正确 ,所构建的E coli BCG穿梭载体 (pCW )能完成在大肠杆菌和母牛分枝杆菌细胞之间的穿梭 ,经免疫荧光检查外源基因Ag85B ESAT 6可融合表达于分枝杆菌宿主表面。 结论　本方法可成功构建能够在分枝杆菌胞壁融合表达MTB分泌蛋白Ag85B ESAT 6的E coli BCG穿梭质粒