抗白念珠菌芽管单抗MAb03.2C1-C2特异性及临床初步应用研究

目的分析抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体MAb03.2C1-C2的特异性及其应用于实验室检测的可行性。方法用临床分离白念珠菌、致病非白念的念珠菌的孢子、菌丝及常见的酵母菌、细菌做抗原包被,用间接免疫荧光(IIF)方法,对单抗特异性进行分析。取临床口腔念珠菌病患者的真菌涂片菌丝阳性的标本,用IIF方法检测。结果MAb03.2C1-C2仅与白念珠菌芽管或菌丝特异性地结合,与白念珠菌的孢子不发生结合。13种非白念的念珠菌孢子和菌丝、新型隐球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌均不能与该单抗相结合。59例口腔念珠菌病真菌涂片IIF试验阳性的标本最终鉴定为白念珠菌(100%)。结论MAb03.2C1-C2对白念珠菌芽管有高度的特异性,并可用于口腔念珠菌病真菌涂片中白念珠菌的早期诊断。     

白念珠菌芽管特异性抗原的研究

运用ⅡＦ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫印迹技术，证实８株临床分离的白念珠菌芽管表面存在芽管特异性抗原。白念珠菌菌丝相胞壁提取物中含有比孢子相更多的、不同的蛋白成份；发现白念珠菌菌丝相胞壁提取物中有一分子量大约为３９ ０００蛋白抗原成份很可能是白念珠菌芽管特异性抗原；认为白念珠菌孢子相和其它念珠菌孢子相胞壁中有以隐蔽状态存在的芽管抗原成份。     

抗白念珠菌芽管单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其对血清芽管诱导率的影响

目的制备并鉴定抗白念珠菌芽管单克隆抗体杂交瘤细胞株,观察该单抗对白念珠菌菌相转换的影响。方法白念珠菌ATCC-90028标准株带芽管孢子做抗原,运用细胞融合技术,制备抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株,并鉴定。将该单抗参与白念珠菌芽管血清诱导,对比其芽管诱导率与血清芽管诱导率。结果建立1株持续分泌抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株M cAb03.2C1-C2。其小鼠腹水单克隆抗体效价达1∶25 600;抗体重链属IgG1亚类,轻链属λ型;证实M cAb03.2C1-C2的靶位是位于白念珠菌芽管胞壁外膜上分子量为156kD的抗原成分。间接免疫荧光(IIF)可见单抗能与白念珠菌芽管特异性地结合,与白念珠菌的孢子相不发生反应。单抗能明显降低芽管诱导诱导率。结论本研究建立的M cAb03.2C1-C2对白念珠菌致病相-芽管有高度的特异性,为早期、快速地诊断系统性白念珠菌感染提供了新的前景。M cAb03.2C1-C2对菌相转换有明显的抑制作用,可能在抗白念珠菌系统性感染中起保护性作用。     

ABC—ELISA检测白色念珠菌芽管特异性抗原的临床研究

本文制备了白色念珠菌芽管特异性抗体,采用ABC-ELISA法对系统性念珠菌病临床患者血清中的相应抗原进行检测,结果表明:该检测方法的敏感性为92.9％,检测的最低敏感浓度约为15—15.6ng/ml,在对照组患者和正常人血清中均未测出芽管特异性抗原。作者认为此检测方法对该病的诊断有重要价值。     

抗白念珠菌感染特异性免疫实验研究

目的　了解细胞免疫和体液免疫在机体抗白念珠菌感染中的作用。方法　分别观察过继免疫T淋巴细胞、抗体和吞噬细胞的免疫功能低下小鼠抵抗腹腔白念珠菌感染情况。结果　过继上述 3种免疫成分的小鼠的腹腔、脾脏和肾脏的白念珠菌菌落数均少于没有过继免疫的小鼠 (P <0 .0 5 ) ;过继免疫T淋巴细胞组的小鼠腹腔菌落数少于免疫抗体小鼠 (P <0 .0 5 ) ;过继免疫抗体 +吞噬细胞组的小鼠肾脏白念珠菌菌落数明显少于单纯过继免疫吞噬细胞组的小鼠 ,差异有显著性 (P =0 .0 3 7)。结论　细胞免疫、体液免疫都参与机体抗白念珠菌免疫反应 ;在抗白念珠菌局部感染中细胞免疫占主导地位 ;体液免疫参与阻止白念珠菌血液播散。     

检测白念珠菌芽管形成的新方法

白念珠菌(简称白念)为临床上最常见的条件致病真菌,约占临床分离酵母的80%～90%.快速、正确地鉴定白念显得尤为重要.常规的方法是米粉吐温琼脂观察其厚壁孢子形成及血清芽管试验.现介绍一种液体培养基能快速检测白念的芽管形成,并与传统常规方法作了比较,显示此法具有简单、快速、重复性好的优点.     

单克隆天然抗体384抑制白念珠菌芽管形成的机制初探

目的观察单克隆天然抗体384对白念珠菌芽管形成的影响，并进一步分析其结合于白念珠菌的部位及成分。探讨其发挥作用的机理。方法将纯化的单克隆抗体3B4与白念珠菌共孵育，计数形成芽管的数量。采用间接免疫荧光方法和流式细胞仪分析抗体384与白念珠菌结合的部位；将白念珠菌用蛋白酶K、氢氧化钠等分别处理后，观察3134对其的结合情况，初步确定其结合成分。结果相对于同型对照，抗体3134作用组白念珠菌芽管生成率显著下降并有统计学差异。流式细胞仪和间接免疫荧光检测均发现3134可以与白念珠菌的芽管相结合，而与酵母相的结合很弱；蛋白酶K、氢氧化钠等处理后，3134对芽管相和酵母相白念珠菌均不发生结合，提示抗体3134结合的成分是主要表达于菌丝相的一种糖蛋白。结论单克隆天然抗体3134可能通过与主要表达在芽管上的一种糖蛋白结合而抑制其芽管形成。     

白念珠菌与粘膜上皮细胞粘附的研究

我们在体外研究了白念珠菌与粘膜上皮细胞之间的粘附，把人颊粘膜上皮细胞与白念珠菌孢子共同振荡孵育2小时，显微镜下测定上皮细胞表面粘附的白念珠菌的数目，粘附20个以上的上皮细胞记为＋，共检测100个，计算粘附百分率，结果37℃的附粘率明显高于28℃，在199细胞培养液中粘附率显著高于在0．01M，PH7．4的磷酸冲液（PBS）中，提示白念珠菌粘附性的增加可能与牙管的形成有关。     

五种化合物对白念珠菌芽管厚壁孢子及核酸代谢的影响

观察了５种化合物对白含珠菌芽管，厚壁孢子及核酸代谢的影响。结果ＭｇＣｌ２和ＣｓＣＬ２对芽管形成有促进作用，而Ｎａ２ＳｅＯ３、ＣｄＩ２和 ＣｕＣｌ２则为抑制作用，与酮康唑相似。ＭｇＣｌ２促进厚壁孢子形成，但ＣｓＣＬ２，ＣｕＣｌ２，Ｎａ２ＳｅＯ３和ＣｄＩ２为抑制作用，应用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法，观察到ＭｇＣｌ２和ＣＳｃｌ２促进核酸代谢而ＣｕＣｌ２，Ｎａ２ＳＡｅＯ３和ＣｄＩ２则表面抑制作用，且随浓度增高，     

葡萄糖对白念珠菌芽管产生的影响

为观察体外葡萄糖含量对白念珠菌芽管形成的影响，制定合适的浓度。对经１８ｈ碳、氮饥饿试验的白念珠菌在含不同浓度的葡萄糖培养基中的芽管形成百分率、糖及氧的代谢状况、ｐＨ变化作了详细观察。结果显示最适宜白念珠菌产生芽管的葡萄糖浓度为１ｇ／Ｌ，此时氧及糖的消耗代谢率最大，同时反映白念珠菌的芽管产生严格依赖于葡萄糖含量     

结缔组织病患者咽部定植的白念珠菌毒力测定

目的了解结缔组织病患者咽部定植的白念珠菌芽管生成长度和分泌型天冬氨酸蛋白酶活性。方法采用病例对照方法对病例组30株和健康组4株白念珠菌芽管生成长度和分泌型天冬氨酸蛋白酶活性进行测定。结果病例组菌株芽管长度为(8.425±1.513)μm,显著高于健康组的(6.495±0.375)μm(P<0.05);病例组分泌型酸性蛋白酶活性Pa值为0.490±0.053,低于健康组的0.610±0.056(P<0.01)。白念珠菌生成的芽管长度与其分泌的酸性蛋白酶活性Pa值呈负性相关(r=-0.874,P<0.01)。结论与健康人相比,结缔组织病患者咽部定植的白念珠菌毒力较强,有更强的潜在致病力。     

抗白念珠菌人鼠嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的构建抗白念珠菌人鼠嵌合抗体的真核表达载体,并实现真核表达。方法从含有单克隆天然抗白念珠菌抗体3B4可变区基因的载体pMDT-V2H和pUC-VL中PCR克隆单抗3B4的可变区VH和VL基因,依次插入含有人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因和γ1重链恒定区基因的真核表达载体pMH-CA。经DNA序列测定正确后,电穿孔转染J558L细胞进行嵌合抗体表达,RT-PCR,ELISA方法对抗体表达进行鉴定。结果成功构建了抗白念珠菌人鼠嵌合抗体,转染真核细胞后RT-PCR显示人鼠嵌合抗体重链和轻链mRNA的转录,ELISA证实了抗白念珠菌人鼠嵌合抗体的表达以及对白念珠菌的识别。结论成功构建抗白念珠菌人鼠嵌合抗体的真核表达载体,并表达出具有结合活性的基因工程抗体。     

单核细胞趋化蛋白-1及其受体在阴道念珠菌病小鼠模型中的表达

目的 探讨单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及其受体CC趋化因子受体2(CC chemokine receptor 2.CCR2)在小鼠阴道念珠菌病发病中的作用.方法 建立阴道念珠菌病小鼠模型.以RT-PCR及ELISA方法检测小鼠阴道及腰淋巴结中MCP-1及CCR2的表达.结果 与正常小鼠相比,雌激素对MCP-1及CCR2的表达无明显影响.所有感染组小鼠阴道组织MCP-1的mRNA和蛋白水平均明显升高,其CCR2 mRNA水平亦相应升高;与之相反,所有感染组小鼠的引流腰淋巴结MCP-1的浓度与基础水平相比无明显改变,而雌激素处理感染组小鼠CCR2在接种后7～21d明显升高.结论 MCP-1及其受体CCR2可能在局部刚道黏膜白念珠菌感染中起一定的作用.     

阴道念珠菌病小鼠模型中单核细胞趋化蛋白-1的表达及其意义

目的检测阴道念珠菌病小鼠模型中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达,并对其在阴道念珠菌病发病中的作用进行探讨。方法建立阴道念珠菌病小鼠模型,以免疫组化染色SABC法检测小鼠阴道黏膜中MCP-1蛋白的表达,并应用HMIAS-2000型全自动医学彩色图像分析系统对小鼠阴道黏膜MCP-1的表达进行半定量分析。结果与对照组及正常小鼠相比,感染组小鼠阴道黏膜MCP-1表达水平明显升高,且随时间延长逐渐升高,14天达到高峰,第21天略有下降。结论MCP-1可能在局部阴道黏膜内对白念珠菌的感染起一定的防御作用。     

白念珠菌临床株多药耐药蛋白基因表达与氟康唑耐药的关系

目的 探讨临床分离白念珠菌氟康唑耐药株/敏感株多药耐药蛋白基因CDR1、CDR2、MDR1的表达情况。方法 试剂盒法抽提白念珠菌氟康唑耐药株/敏感株的总RNA后，逆转录成cDNA，采用实时定量PCR技术观察白念珠菌多药耐药蛋白基因的表达。结果 白念珠菌耐药株组CDR2基因的△CT值为7.52 ± 2.53，敏感株组为9.28 ± 3.15，两组比较，t = 2.37，P ＜ 0.05，耐药株的表达量要高于敏感株。结论 白念珠菌CDR2基因的高表达与氟康唑耐药有关。     

树突细胞相关C型凝集素-1受体介导的抗白念珠菌免疫作用及机制

树突细胞相关c型凝集素-1是一种主要的C型凝集素样受体,存在于多种细胞和组织中.它能够特异性识别白念珠菌细胞壁主要成分β-葡聚糖,进而诱导机体产生固有免疫反应和适应性免疫反应.其可单独或与其他模式识别受体相互协同完成上述过程.白念珠菌β-葡聚糖的暴露、树突细胞相关C型凝集素-1表达水平等因素可影响机体免疫效应的强度,对其进行调控将为自念珠菌感染预防和治疗提供一个新的方向.

Abstract：

Dectin-1, a principal C-type lectin pattern-recognition receptor, exists in various types of cells and tissues. It can specifically recognize β-glucans, which are the major cell wall component of Candida albicans, and then trigger the innate and adaptive immune responses in hosts. Dectin-1 can independently, as well as collaboratively with other pattern recognition receptors, induce above mentioned processes. The intensity of immune responses in hosts is modulated by multiple factors such as the exposure of β-glucans on Candida albicans and the expression level of Dectin-1, and this modulation may provide a new direction for the prevention and therapy of Candida albicans infection.     

基质细胞衍生因子-1及受体CXCR4在阴道念珠菌病小鼠模型中的表达

目的 检测基质细胞衍生因子-1（SDF-1）及其受体CXCR4在阴道念珠菌病小鼠模型阴道组织及腰引流淋巴结中的表达情况。方法 采用雌激素化阴道念珠菌病小鼠模型，雌性昆明小鼠（80只）随机分四组，A组（雌激素处理感染组）、B组（雌激素处理未感染组）、C组（未用雌激素处理感染组）、正常对照组（5只）。前三组又再分为接种白念珠菌后第2、4、7、14和21天组（各5只）。接种后不同时间点随机取小鼠阴道组织及腰淋巴结，以RT-PCR及免疫组化SABC法检测SDF-1及CXCR4 mRNA及蛋白水平的表达。结果 （1）RT-PCR：与正常小鼠相比，雌激素（B组）对SDF-1及CXCR4 mRNA表达无影响。①小鼠阴道组织：与B组相比，A组小鼠接种后各时间点均见SDF-1 mRNA表达明显增加（F ＝ 114.87，P < 0.01），第14天CXCR4 mRNA明显增加（t = 15.61，P < 0.01）；与正常小鼠相比，C组小鼠接种后第2，4， 7天，SDF-1 mRNA明显增加；第4 ~ 21天CXCR4 mRNA均明显增加。②腰淋巴结：与B组相比，A组小鼠接种后第2天和7 ~ 21天SDF-1 mRNA明显增加（F ＝ 865.62，P < 0.01），CXCR4 mRNA于各时间点表达均增加（F ＝ 161.30，P < 0.01）；与正常小鼠相比，C组小鼠接种后SDF-1 mRNA表达无明显改变（P > 0.05）；CXCR4 mRNA于第7天和14天明显增加（P < 0.05）。（2）免疫组化：A组小鼠阴道黏膜中SDF-1及CXCR4表达在接种后第2天即开始增加，第7天时达高峰，第14天和21天开始下降，但均明显高于对照组（P < 0.05）。结论 感染组小鼠阴道黏膜及腰淋巴结中SDF-1及CXCR4的mRNA及蛋白水平均明显升高。