基因重组神经营养蛋白-3的生物学活性

目的：测定ＮＴ－３ｃＤＮＡ／ＣＨＯ细胞表达的基因重组ＮＴ－３的生物学活性。方法：体外培养８日龄鸡胚背根神经节（ＤＲＧ）,加入条件培养基,测量背根节神经突起生长的长度。结果：ＮＴ－３ｃＤＮＡ／ＣＨＯ细胞培养４８ｈ后的无血清条件培养基１：２４稀释后即能促进ＤＲＧ神经突破的生长;随着其中ＮＴ－３浓度增加,神经突破长度也逐渐延长,有明显的量效关系;ＤＲＧ培养４８ｈ长出的神经突破与２４ｈ相比,明显长而致密;     

重组人骨形态发生蛋白-7体内外生物学活性研究

采用体外、体内两种方法同时测定原核表达重组人BMP 7(rhBMP 7)的生物学活性 ,建立rhBMP 7活性测定的标准并为推广其临床应用提供依据。在体外 ,PNPP底物比色法和MTT比色法结果表明 ,10倍、10 0倍稀释上清组与细胞共同培养 72h后碱性磷酸酶 (ALP)水平和活细胞增殖数明显高于阴性对照组 (P <0 .0 5 ) ,而与标准品无显著性差异 (P >0 .0 5 )。在体内 ,将rhBMP 7植入小鼠肌间隙后 3周 ,见软骨岛和编织骨生成 ;而将rhBMP 7与胶原载体复合后植入 ,可见大量骨小梁、骨髓腔和板层骨 ,血管和骨髓丰富 ;成骨率均为8/ 8。ALP水平和钙含量 ,rhBMP 7组与标准品组相比 ,无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;复合组则明显高于单独植入rhBMP 7和胶原两组 (P <0 .0 5 )。     

重组人骨唾液酸蛋白的纯化及生物学活性研究

目的对毕赤酵母表达的重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)进行纯化和活性研究,为进一步研究BSP功能活性,揭示相关病理机制奠定基础。方法毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPICZαA-hbsp工程菌能高效分泌表达rhB-SP,采用Ni-NTA介质以亲和色谱法纯化rhBSP。通过羟基磷灰石(HA)晶体生长抑制实验、细胞黏附实验和鸡胚尿囊绒膜实验分析rhBSP的生物学活性。结果纯化的rhBSP达到电泳纯,并能抑制HA晶体生长,可介导乳腺癌细胞黏附和促进血管生成。结论纯化的rhBSP具有良好的生物学活性,可用于进一步研究BSP相关的病理、生理机制。     

重组脂联素融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 表达重组脂联素融合蛋白(adiponectin-Trx),并测定其生物学活性.方法 从小鼠脂肪组织提取总RNA,应用序列特异性引物经RT-PCR方法扩增获得全长脂联素基因序列,克隆至pGEM-T载体,序列经DNA测序证实.将目的 序列(18-247氨基酸)亚克隆至pET-32(a)表达载体,重组质粒adiponectin/pET32(a)的序列经测序证实.将adiponectin/pET32(a)转化表达宿主菌OrigamiTM(DE3),在27℃以1mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达目的 蛋白,SDS-PAGE和氨基酸测序检测目的蛋白的表达,目的 蛋白经组氨酸镍螫和树脂亲和纯化.以不同浓度的融合蛋白adiponectin-Trx和Trx蛋白处理体外培养的人脐静脉内皮细胞,细胞增殖法测定其生物学活性.结果 小鼠脂肪组织脂联素基因的编码序列,337位点上的碱基A被C置换,导致在113位的蛋氨酸被缬氨酸取代.序列测定表明,构建的重组表达载体adiponectin/pET32a序列完全正确,诱导工程菌主要表达可溶性的融合蛋白adiponectin-Trx,部分以包含体形式表达.表达产物的相对分子量(Mr)同预期分子量相同,adiponectin-Trx Mr为43 000,Trx Mr为19 000.在低浓度时融合蛋白刺激人脐静脉内皮细胞增殖.结论 小鼠脂肪组织脂联素基因编码序列与来自3T3-L1脂肪细胞的编码序列不同.成功地在E.coli中表达了重组脂联素融合蛋白并具有生物学活性.     

重组人白介素-1α生物学活性测定方法的建立

目的 建立并优化采用D10.G4.1细胞测定重组人白介素-1α(rhIL-1α)生物学活性的方法,并用于rhIL-1α样品的检测.方法 MTT法测定rhIL-1α促进D10.G4.1细胞增殖能力,从而反映rhIL-1α的生物学活性.结果 建立了D10.G4.1细胞增殖法测定rhIL-1d生物学活性的方法.优化后实验条件如下,样品稀释培养基:RPMI1640+10％ FBS+0.5％T-STIM with ConA +0.05mM2-巯基乙醇;样品上板浓度:10ng ·mL-1;细胞密度:4×105个/mL;培养时间:72h;样品梯度稀释倍数4倍.利用优化后的实验条件对rhIL-1α样品活性进行3次测定,评价方法的可重复性.结果 3次实验的变异系数为5.7％,符合方法的要求,表明方法重复性好.结论 建立了D10.G4.1细胞测定rhIL-1α生物学活性的方法,该方法操作简便,重复性好,可应用于rhIL-1α的生物学活性检测.     

14-3-3蛋白生物学特征及相关药物发现

14-3-3蛋白是一种真核生物保守性调节蛋白,参与神经元发育、细胞周期和信号转导等多种生理过程调控,作为潜在的药物靶点受到高度关注。针对14-3-3蛋白及蛋白质-蛋白质相互作用的调节,发现了一些小分子14-3-3蛋白-靶蛋白相互作用稳定剂和抑制剂,将来可用于神经退行性疾病及肿瘤等疾病的药物干预。本文对14-3-3蛋白生物学特征及潜在药物靶点研究进行综述,为基于14-3-3蛋白的药物研发提供策略。     

注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白生物学活性检测方法学研究

目的通过对注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测方法进行研究,建立该药物的生物学活性检测方法。方法参考重组人干扰素生物学活性测定法,以人羊膜细胞(WISH)病变抑制法开展注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测方法研究。结果该方法的专属性好,精密度试验中生物学活性相对标准偏差(RSD)为10.6%,准确性试验平均回收率98.2%,RSD为9.0%,符合生物制品质量检验方法要求。结论本研究制定的实验方法准确、可靠,适用于注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测。     

神经营养因子Neurturin在Vero细胞中的表达及其生物学活性研究

目的探讨Neurturin(NTN)基因转染Vero细胞后的表达情况,为恒河猴帕金森病(PD)基因治疗打下基础。方法将表达载体pcDNA3-hNTN转染Vero细胞,挑选稳定表达克隆,用RT-PCR及免疫荧光分析鉴定,并对表达的人NTN蛋白进行了体外生物学活性测定。结果pcDNA3-hNTN质粒转染Vero细胞后获得了稳定表达克隆且有目的蛋白hNTN表达,表达的hNTN在体外能够促进培养的鸡胚背根神经节长出神经突起,并能促进体外培养的胚胎中脑多巴胺能神经元的存活。结论获得了能稳定表达NTN蛋白的Vero细胞株,其表达的hNTN对体外培养的中脑多巴胺能神经元具有保护作用,为移植并进行PD猴基因治疗动物实验打下了基础。     

感觉神经33.1kDa特异蛋白二级结构及其神经营养活性探讨

目的纯化大鼠脊神经感觉纤维33．1kDa特异蛋白(SSP-33．1)，并分析其二级结构及其神经营养活性。方法采用双向电泳技术比较了大鼠脊髓背根神经纤维和腹根神经纤维中蛋白质表达差异，用DEAE-Sephacel阴离子交换层析和高效液相凝胶过滤的方法纯化了其中一种蛋白质，并通过圆二色谱初步分析了该蛋白质的二级结构；又通过经典的神经营养活性的模型-鸡胚背根节(DRG)体外培养模型，测定该蛋白的生物学活性。结果纯化的蛋白质分子量为33．1，等电点为5．52，其二级结构中α螺旋占20．8％，β片层占54．8％，转角占7．3％，无规卷曲占17．1％。体外实验表明该蛋白质能促进鸡胚背根神经节突起的生长。结论纯化了大鼠感觉神经33．1kDa特异蛋白，该蛋白质二级结构以β片层为主，体外实验表明该蛋白质对体外培养的鸡胚背根神经节有神经营养活性。     

具神经营养活性的小分子化合物

神经退行性疾病是危害老年人健康的疾病之一，天然非肽类小分子有望成为新的神经营养药物。从来源、结构特点、生物活性等方面，对近年来发现的具有神经营养活性的非肽类小分子化合物的研究状况做简要综述。     

重组人α-2b型干扰素生物学活性测定方法的改进

干扰素生物学活性测定是采用细胞病变抑制法进行。此方法在显微镜下观察细胞病变百分比,用累积法计算结果。由于用肉眼观察结果,所以人为因素较大。当采用结晶紫进行细胞染色后,被干扰保护的细胞将染成紫色,而在病变的细胞外形成空斑。脱后用梅仪测ＯＤ值做标准曲线计算结果。染色法可提高结果的准确性。现状改进的方法报如下。     

报告基因法测定重组人白细胞介素-2产品生物学活性的研究

目的:建立测定重组人白介素-2(recombinant human interleukin-2, rhIL-2)制品生物学活性的报告基因法(reporter gene assay, RGA)。方法:根据ICH Q2和《中华人民共和国药典》 2020年版指导原则,构建慢病毒转染表达荧光素酶(luciferase, Luc)的C8166细胞,进行rhIL-2生物学活性测定方法学优化与验证,优化内容包括孵育时间、细胞数量、待测样品的初始浓度和稀释比例;验证内容包括特异性、线性和准确性、精密度和耐用性。结果:优化后的检测条件为：孵育时间为24 h;细胞接种密度为1×10⁵细胞·孔^-1;待测样品以10 000 IU·mL^-1为起始浓度1∶3稀释10个梯度。荧光信号值强度与待测样品浓度拟合四参数曲线,计算相对效价。选用不同作用类型的细胞因子进行特异性验证均符合应用要求。采用50%,75%,100%,125%和150%的5个浓度点验证线性和部分准确性,实测与理论效价线性回归分析相关系数R²=0.993 1,各浓度...     

神经干细胞联合神经营养因子-3移植治疗脑出血的实验研究

脑出血（ICH）作为神经系统的常见病及多发病,是严重危害人类健康、致死致残率较高的疾病,发病率每年60～80／10万,多数幸存者残留不同程度的神经功能丧失,至今有关脑出血的治疗仍未取得突破性的进展。神经干细胞（neural stem cells NSCs）的诞生为脑出血治疗实验性研究开辟了一条新的途径,由于NSCs进行活体移植后,较长时间的存活,     

基于报告基因的重组人促卵泡激素Fc融合蛋白生物学活性测定方法研究

目的:利用转基因细胞法建立重组人促卵泡激素Fc融合蛋白(rhFSH-Fc)生物学活性检测方法。方法:利用CHO-K1-FSHR-CRE-Luc转基因细胞,按一定细胞密度种板,培养16～20 h后吸弃培养基,将rhFSH-Fc倍比稀释加入细胞板,药物作用一段时间后加入荧光素酶检测试剂,通过荧光素酶检测系统对rhFSH-Fc进行生物性活性检测,并对各试验条件参数优化及进行方法学验证。结果:rhFSH-Fc在该方法中存在量效关系且符合四参数曲线方程,R~2大于0.99;方法优化后确定细胞种板密度为5×10~5个·mL^-1,rhFSH-Fc稀释起始浓度为750 ng·mL^-1,1∶5倍的稀释倍数,诱导时间为4 h,样品稀释液为DMEM/F12K+10%FBS。该方法具有良好的专属性,9次独立日间、日内精密度检测RSD均小于5%,5个不同稀释组回收率样本经6次测定,相对效价分别为(51±2.00)%、(78±2.05)%、(94±2.23)%、(124±3.46)%、(141±4.45)%;对应回收率平均值分别为(101±3.94)%、(104±3.0...     

重组入骨形成蛋白-2异位诱骨活性的实验研究

目的 运用小鼠股部肌袋模型，观察重组入骨形成蛋白-2(rhBMP-2)的异位诱骨活性。方法 将rhBMP-20．5mg、1．0mg、1．5mg及人血清白蛋白(HSA)1．5mg分别植入小鼠股部肌肉，观察组织学成骨及测定标本内钙含量。结果 植入rhBMP-21．0mg及1．5mg组成骨良好，组织钙含量高。其余组未见成骨。结论 rhBMP-2如同天然骨形成蛋白一样，能够在异位以软骨内化骨方式诱导成骨，且存在剂量依赖性与时间依赖性。     

重组人白细胞介素11生物学活性测定方法研究

目的建立重组人白细胞介素 11(rhIL 11)生物活性测定方法。方法运用单克隆方法筛选出rhIL 11敏感细胞株T 10 ,采用溴化四唑蓝比色法进行rhIL 11生物活性测定 ,采用四参数方程对测定结果进行计算。结果以世界卫生组织国际标准品作为参照品 ,与美国Genetics公司rhIL 11上市产品NeumegaTM进行测定比较 ,结果显示国内同类产品与其生物活性一致 ,RSD均小于 10 %。结论此方法可用于rhIL 11生物活性测定     

重组人粒细胞集落刺激因子生物学活性标准品的免疫学活性测定

目的测定重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)生物学活性标准品的免疫学活性。方法用深圳晶美公司及美国R&D公司的G CSFELISA试剂盒分别对WHOrhG CSF生物学活性国际标准品、惠尔血针剂 75 (GRAN 75 )及用WHOrhG CSF生物学活性国际标准品标定过生物学活性的工作标准品T1、T2、T3进行免疫学活性测定。结果不同公司的rhG CSFELISA试剂盒对所测定样品的测定结果不同 ,且用不同稀释液稀释样品测定结果亦不同。结论用免疫学方法定量测定rhG CSF的含量是有条件的 ,且免疫反应能识别聚体但不能识别蛋白分子的降解。