HIF-1对乏氧人肺腺癌 A549细胞侵袭、迁徙能力的影响及其机制

目的：探索低氧诱导因子-1(HIF-1)对乏氧人肺腺癌 A549细胞侵袭及迁徙能力的影响及可能机制。方法采用氯化钴建立人肺腺癌 A549细胞体外化学乏氧模型。给予 HIF-1α特异性抑制剂YC-1抑制 A549细胞 HIF-1α的表达;通过 Western blot、免疫细胞化学、real time-PCR 检测 HIF-1α、S100A4蛋白及 mRNA 的表达;Transwell 小室模型检测 A549细胞 侵 袭 及 迁 徙 能 力。结果乏氧组A549细胞 HIF-1α、S100A4表达较常氧组增加,侵袭及迁徙能力较常氧组增强。YC-1干扰 HIF-1α表达后,YC-1组 A549细胞侵袭及迁徙能力减弱,S100A4蛋白及 mRNA 表达均降低。结论 HIF-1可能通过上调 S100A4的表达促进乏氧人肺腺癌 A549细胞侵袭及迁徙的能力。     

乏氧诱导因子-1α、环氧化酶-2、HER-2在非小细胞肺癌中的表达

应用免疫组织化学技术检测47例非小细胞肺癌(NSCLC)中乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)、环氧化酶-2(COX-2)、HER-2的表达。结果HIF-1α、COX-2和HER-2在NSCLC中的表达分别为57.45%、57.45%和46.81%;HIF-1α阳性表达与HIF-1α阴性表达的NSCLC标本中COX-2的阳性表达率有统计学意义,而HER-2的阳性表达率则无统计学意义。NSCLC中HIF-1α蛋白的表达与COX-2表达存在相关性。     

长期缺氧对肺腺癌SPCA1细胞谷胱甘肽转移酶表达及耐药性的影响

目的 探讨长期缺氧对SPCA1细胞谷胱甘肽转移酶（GST-π）表达的影响及耐药性的改变。方法 SPCA1细胞常氧（20％O2）和缺氧（0．5％O2）条件下作用16h后，提取RNA和蛋白，用定量RT-PCR的方法检测缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和GST-π mRNA的表达情况，用Western blotting法检测HIF-1α蛋白；制备细胞悬液，用流式细胞仪测定GST-π表达；通过克隆形成实验分析SPCA1细胞对阿霉素和丝裂霉素的药物敏感性。通过 RNA干扰技术下调HIF-1α表达后，分为对照组和干扰组，观察GST-π的表达。结果 设常氧组GST-π mRNA表达率为1，缺氧组为12．2。常氧组GST-π蛋白阳性表达率为（35．78±1．25）％，缺氧组为（72．13±2．11）％。与常氧组比较缺氧组HIF-1α表达明显增加。计算1％克隆存活的药物浓度，阿霉素处理细胞，常氧组浓度为（0．29±0．05）μg／ml；缺氧组浓度为（0．48±0．07）μg／ml；丝裂霉素处理细胞，常氧组浓度为（0．71±0．10）μg／ml；缺氧组浓度为（0．79±0．12）μg／ml。干扰HIF-1α后，HIF-π mRNA与对照组比较下降了70％，而GST-π mRNA稍有下降。GST-π蛋白表达常氧条件下对照组为（32．14±1．23）％，干扰组为（30．88±1．65）％；缺氧条件下对照组为（64．78±2．45）％，干扰组为（67．42±2．21）％。结论 长期缺氧可诱导SPCA1细胞HIF-1α和GST-π表达增加，对阿霉素耐药性增加，对丝裂霉素没有影响，HIF-1α和GST-π并没有直接的相关性。     

Wortmannin阻断PI3K/AKT途径对食管癌缺氧诱导因子-1α及糖酵解的影响

目的 探讨人食管癌细胞TE1、TE13中应用wortmannin阻断PI3K/AKT通路对缺氧诱导因子(HIF)-1α的抑制效果及对糖酵解相关基因表达的影响,分析PI3K/AKT-HIF-1α途径对食管癌细胞糖酵解通路之间的关系.方法 wortmannin(2μmol/L)预处理食管癌细胞TE1、TE13后常氧和缺氧培养,分为①常氧组(N);②缺氧组(H);③常氧处理组(N+W);④缺氧处理组(H+W).采用Western印迹检测细胞中HIF-1α蛋白及己糖激酶(HK)-Ⅱ、葡萄糖载体蛋白(GLUT)-1、乳酸脱氢酶(LDH )-A等糖酵解相关基因蛋白的表达;实时定量PCR检测HIF-1α及HK-Ⅱ、GLUT-1、LDH-A等糖酵解相关基因mRNA的表达;分光光度法测定胞液中LDH、HK-Ⅱ活性和培养上清液中乳酸浓度.结果 常氧状态下,在TE1细胞中存在HIF-1α蛋白的表达,wortmannin(2 μmol/L)能抑制HIF-1α蛋白表达,12 h后抑制效应最明显,故选取12 h为后续实验的缺氧时间.TE1、TE13细胞经wortmannin预处理后HIF-1α、HK-Ⅱ、GLUT-1、LDHA蛋白表达较未加药细胞明显减弱(P＜0.05);HIF-1α、HK-ⅡmRNA表达较未加药细胞明显减弱(P＜0.05).常氧和缺氧条件下加用wortmannin的TE1,TE13组食管癌细胞胞液LDH、HK-Ⅱ活性均较未加药细胞组明显减弱(P＜0.05),未加药细胞缺氧后酶活性增强(P＜0.05).常氧和缺氧条件下加用wortmannin组较未加药组细胞上清液乳酸浓度明显减低(P＜0.05),加wortmannin组细胞缺氧后表达增强(P＜0.05).结论 常氧及缺氧条件下,wortmannin能通过抑制食管癌细胞HIF-1α和糖酵解相关基因的表达导致乳酸水平降低,表明PI3K/AKT- HIF-1α途径与食管癌细胞糖酵解通路密切相关.     

BAG-1基因沉默对非小细胞肺癌放射敏感性的影响及机制

目的探讨BAG-1基因与非小细胞肺癌放射敏感性的关系,为非小细胞肺癌个体化治疗提供理论依据。方法对A549肺腺癌细胞、H460大细胞癌及NCL-H520鳞癌细胞三株非小细胞肺癌细胞株及人胚肾细胞株HEK293行细胞放射敏感性试验,采用Western blot法检测各细胞株中BAG-1蛋白表达情况。选择其中对放射线相对较抗拒、BAG-1蛋白表达最高的A549细胞株,构建干扰载体pGCsi-BAG-1并筛选BAG-1基因沉默细胞株,用shRNA-2转染,酶标仪检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率,放射敏感性试验观察细胞对放射线的敏感性。结果 shRNA-2转染的细胞株生长受到抑制,且随时间延长抑制作用明显,而阴性对照质粒转染的A549细胞株生长无明显变化;6 Gy射线照射后24 h,shRNA-2转染细胞凋亡率为(49.6±4.23)%,未转染的A549细胞为(15.3±2.11)%,阴性对照质粒转染细胞为(14.8±3.55)%,shRNA-2转染细胞凋亡率较未转染细胞增加了3.2倍(P<0.01),而阴性对照转染细胞与未转染细胞间相比差异无统计学意义;亲本A549细胞和阴性对照转染细胞之间的放射敏感性无差异(P>0.05)。而shRNA-2转染细胞的放射敏感性明显增加,与前二者比较差异有显著性(P<0.05)。结论 BAG-1基因沉默可增强非小细胞肺癌放射敏感性,可能机制为BAG-1基因沉默后抑制细胞生长,抗凋亡作用减弱,细胞内BAG-1分布发生改变,细胞对射线更敏感。     

乙型肝炎病毒x蛋白与缺氧诱导因子-1α在肝癌中的表达及可能的调节机制

目的检测乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)与缺氧诱导因子-1(HIF-1)α在肝癌中的表达,探讨正常氧和缺氧状态下,HBx对HIF-1α可能的调节机制。方法采用免疫组织化学染色方法检测78份原发性HCC组织标本中HBx和HIF-1α的表达,用SPSS10.0进行相关性分析;免疫荧光和Western blot检测常氧和缺氧条件下,HepG2及稳定转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2- X)中HIF-1α的表达;流式细胞术检测常氧和缺氧状态下HepG2及HepG2-X细胞活性氧(ROS)的含量。结果78份肝癌组织标本中,HBx和HIF-1α免疫组织化学染色阳性率分别为74.36%(58/78)和69.23%(54/78),两者表达呈正相关(r=0.636,P<0.05)。免疫荧光检测表明:常氧状态下, HepG2细胞中HIF-1α的表达阴性而HepG2-X中表达阳性,主要位于细胞浆,部分位于细胞核,而缺氧状态下,HepG2和HepG2-X细胞的细胞质和细胞核均有表达。Western blot检测显示:常氧状态下,HepG2细胞中HIF-α几乎无表达,而HepG2-X明显表达。两者在缺氧1 h开始均表达,8 h达到高峰,16 h后逐渐下降,测量两者缺氧8 h时的表达,发现HepG2-X中HIF-α的表达增高。流式细胞术检测细胞ROS含量显示:在常氧状态下,HepG2-X细胞中ROS含量明显高于HepG2细胞。在缺氧状态下,二者ROS含量无显著差异,但均明显高于常氧状态下HepG2细胞的ROS含量。结论HBx及HIF-1α在人肝细胞肝癌组织中广泛表达,并显著正相关;常氧或缺氧状态下,HBx均可上调HIF-1α在HepG2细胞中表达,并且HBx对HIF-1α的这种调节作用可能通过ROS通路实现。     

缺氧诱导因子-1α对SD大鼠心室肌细胞缺血再灌注损伤的短暂保护作用

目的探讨缺氧诱导因子(HIF)-1α在SD大鼠心室肌细胞在缺血再灌注损伤(IRI)过程中的作用。方法原代培养心室肌细胞,继而用脂质体转染pc DNA3.1-full length HIF-1α和空载至心室肌细胞;建立体外心肌细胞IRI模型;分成处理后培养6 h和5 d两个检测体系;MTT法检测细胞活性,Western印迹和免疫细胞化学法检测相关蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果心室肌细胞缺血再灌注(IR)后细胞活性下降,凋亡率上调。在转染pc DNA3.1-full length HIF-1α质粒后,细胞活性明显增加,bcl-2和血管内皮生长因子(VEGF)表达上调,凋亡受到抑制;转染pc DNA3.1-full length HIF-1α组培养5 d后虽然HIF-1α仍高表达,但VEGF和bcl-2表达量下降,细胞活性下降,凋亡率升高。结论大鼠心室肌细胞IR后活性下降,凋亡增加;短时间内HIF-1α可在一定程度上保护细胞,增强细胞活性,抑制凋亡;但长期作用后,HIF-1α对IRI的心肌细胞并未起到保护作用。     

缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子与非小细胞肺癌中临床病理特征和预后关系的研究

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)在非小细胞肺癌(NSCLC)术后双重表达的临床和预后意义,并研究HIF-1α抑制剂LW6和贝伐单抗(Avastin)对非小细胞肺癌细胞HIF-1α和VEGF表达的影响,初步探索HIF-1α与VEGF潜在的调控机制。方法采用免疫组化方法测定非小细胞肺癌组织中HIF-1α和VEGF的表达情况。用HIF-1α的抑制剂LW6和VEGF的抑制剂Avastin分别处理培养的非小细胞肺癌细胞系,采用western blotting检测HIF-1α和VEGF的表达。结合HIF-1α和VEGF的免疫组化结果和患者的临床病理资料进行统计分析。结果HIF-1α和VEGF双阳性表达与pT(P<0.05)、pN(P<0.01)和pTNM分期(P<0.01)及5年生存率(P<0.01)显著相关。在非小细胞肺癌细胞系中,用LW6处理缺氧细胞可以显著抑制HIF-1α的表达(P<0.01);用Avastin处理缺氧细胞对HIF-1α的表达无显著影响(P>0.05)。在缺氧细胞中,采用LW6或Avastin处理细胞均可抑制VEGF的表达。结论HIF-1α和VEGF双重表达能使我们更准确地预测非小细胞肺癌患者的预后,进一步验证在非小细胞肺癌中,HIF-1α是VEGF重要的上游调控者,参与VEGF表达调控。     

慢病毒介导过表达果糖-1,6-二磷酸酶1基因降低胃癌细胞糖酵解水平的机制研究

目的探讨慢病毒介导过表达果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)基因对胃癌SGC7901细胞糖酵解的影响及其机制。方法 RT-PCR和Western blotting检测人正常胃黏膜上皮GES-1细胞和胃癌SGC7901细胞中FBP1 mRNA和蛋白表达。以慢病毒介导的p Lenti6.3/FBP1质粒转染SGC7901细胞,采用RT-PCR和Western blotting检测转染效果,CCK-8和Transwell实验检测各组细胞的增殖和迁移能力,Western blotting检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)蛋白的表达,生物化学法检测胞外乳酸含量,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胞内磷酸果糖(PFK)含量。结果与GES-1细胞相比,SGC7901细胞中FBP1mRNA和蛋白表达明显升高(P0.05)。p Lenti6.3/FBP1质粒转染使SGC7901细胞中FBP1 mRNA和蛋白表达显著升高(P0.05),显著抑制SGC7901细胞的增殖和迁移能力(P0.05);同时,降低了HIF-1α和GLUT-1蛋白的表达以及胞内PFK和胞外乳酸含量(P0.05)。结论 FBP1过表达能够通过降低细胞的糖酵解水平抑制胃癌SGC7901细胞的增殖和迁移,其作用机制可能与抑制GLUT-1和HIF-1α表达有关。     

作者单位：030001山西省太原市 山西医科大学基础医学院生理学系,细胞生理学山西省重点实验室通讯作者：贺忠梅,E-mail：hezmei@126.com

目的 探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)稳定表达对大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的影响及可能机制。方法 采用结扎冠脉左前降支45min,再灌注3h的方法,构建大鼠心肌缺血再灌注损伤模型;实验分为假手术组(Sham)、心肌缺血/再灌注组(MI/R)、HIF-1α活化剂DMOG 心肌缺血/再灌注组(D MI/R)、HIF-1α抑制剂YC-1 心肌缺血/再灌注组(YC-1 MI/R);采用全自动生化分析仪测定血清心肌酶(CK-MB,LDH)活性;Western blot检测心脏组织HIF-1α蛋白表达;Evens blue/TTC染色测定心肌梗死面积;TUNEL染色及Caspase-3,8,9活性测定心肌细胞凋亡。结果 (1)与MI/R 组相比,D MI/R 组的HIF-1α蛋白表达量明显增加,心肌酶CK-MB、LDH的活性降低,心肌梗死面积明显减小,并且心肌组织的病理损伤减轻;(2)稳定HIF-1α表达可明显降低心肌细胞凋亡率,且部分逆转了缺血再灌注后心肌组织Caspase-9与Caspase-3的活性升高。结论 HIF-1α稳定表达可抑制线粒体途径介导的心肌细胞凋亡,从而发挥对缺血再灌注损伤的心脏保护效应。     

丹参酮IIA通过调控自噬抑制乏氧诱导的肝内胆管细胞癌侵袭能力的研究

目的:探讨在乏氧状态下,丹参酮ⅡA对肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)自噬的调控,以及对侵袭能力的影响及其机制。方法:通过1%O_2培养建立肝内胆管细胞癌ICC-9810细胞乏氧状态,应用丹参酮ⅡA干预细胞后,通过划痕试验检测ICC-9810细胞迁移能力,趋化试验及侵袭试验检测细胞的趋化与侵袭能力;转染p GFP-LC3质粒后,应用荧光显微镜观察LC3融合蛋白及自噬小体在ICC-9810细胞中的表达情况,蛋白质印迹法检测ICC-9810细胞中的HIF-1α、自噬相关蛋白LC3Ⅱ/I和Beclin1表达差异。结果:在乏氧环境下,ICC-9810细胞运动能力增强(1.75±0.3)倍,趋化能力增加79.6%,侵袭力增强1.36倍,细胞自噬水平明显升高,丹参酮ⅡA干预后ICC-9810细胞自噬水平下调,HIF-1α、LC3Ⅱ/I和Beclin1蛋白表达水平分别降低3.9倍,2.4倍和1.1倍,侵袭能力下降4.7倍。结论:丹参酮ⅡA可以通过下调自噬,抑制肝内胆管癌细胞在乏氧条件下异常增高的侵袭力。     

HIF-1α在小鼠ACTH垂体腺瘤细胞AtT-20的抗凋亡作用

目的 观察缺氧诱导因子(HIF)-1α在小鼠垂体促肾上腺皮质激素腺瘤细胞AtT-20生长增殖中的作用,验证HIF-1α能否保护AtT-20细胞免于低氧诱导的细胞凋亡.方法 不同浓度的CoCl2诱导AtT-20细胞发生低氧,MTT方法观察CoCl2促进细胞生长增殖的作用,实时定量PCR和Western印迹检测常氧和低氧环境下HIF-1α mRNA和蛋白水平的改变;细胞转染HIF-1α-siRNA后,CoCl2低氧诱导,实时定量PCR和Western印迹验证siRNA下调HIF-1α的效率,凋亡检测系统Annexin V-FITC和TUNEL法检验细胞凋亡情况.结果 在一定浓度(≤100 μmoL/L)和时间(≤48 h)范围内,CoCl2可以促进AtT-20细胞的生长增殖,并呈浓度和时间正相关性;HIF-1α-siRNA转染后,CoCl2低氧诱导处理的细胞发生凋亡的比率大幅度上升(P＜0.05).结论 HIF-1α在AtT-20细胞生长增殖中发挥抗凋亡的作用.     

高糖环境对乏氧损伤大鼠海马神经元凋亡的影响及脑神康胶囊的干预作用

目的 研究高糖环境对体外培养的大鼠海马神经元乏氧损伤时凋亡的影响以及脑神康胶囊对损伤神经元的保护作用.方法 原代培养大鼠海马神经元,将细胞随机分成8组:对照组、高糖组、黄嘌呤(X)/黄嘌呤氧化酶(XO)组、川芎嗪组、生理盐水组、脑神康低、中、高剂量组.干预后测细胞存活率及凋亡率,采用Real-time PCR法检测各组海马神经元HIF-1α mRNA、Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表达及Bc-2/Bax比值.结果 与对照组相比,高糖组及X/XO组神经元存活率、Bcl-2 mRNA表达水平和Bcl-2/Bax的水平均显著下降,神经元凋亡率、HIF-1α mRNA和Bax mRNA表达水平均显著升高(均P<0.01);与X/XO组比较,川芎嗪组及脑神康各浓度组神经元存活率、Bcl-2 mRNA表达和Bcl-2/Bax的水平均明显上升,而神经元凋亡率、HIF-1α mRNA和Bax mRNA表达均明显下降.结论 脑神康胶囊能够明显抑制高糖环境下大鼠海马神经元的凋亡,对高糖环境下海马神经元的乏氧损伤有保护作用,其作用机制之一是下调HIF-1α mRNA表达、上调Bcl-2 mRNA表达、改善乏氧环境及抗细胞凋亡.     

缺氧诱导因子-1α和己糖激酶-Ⅱ在食管鳞状细胞癌中的表达及对糖酵解的影响

目的 探讨人食管鳞状细胞癌中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和己糖激酶-Ⅱ(HK-Ⅱ)的表达变化及对糖酵解的影响.方法 缺氧条件(1％氧浓度)下培养TE13及Eca109细胞,设置不同缺氧时间(分别为6、12、24、48 h),并以常氧培养(20％氧浓度)为对照.Western印迹检测HIF-1α及HK-Ⅱ的蛋白表达变化;经RNA干扰技术特异性静默HIF-1α,利用实时定量PCR及Western印迹检测HIF-1α和HK-Ⅱ的表达变化;分光光度法检测常氧和缺氧条件下细胞培养液中细胞的乳酸浓度变化.结果 ①缺氧条件下,TE13及Eca109细胞中HIF-1α表达均随缺氧时间延长而逐渐升高(P＜0.05),在缺氧12 h表达达到高峰,后表达又随时间延长而下降.TE13及Eca109细胞缺氧12 h后HK-Ⅱ表达均较常氧培养明显增强(P＜0.05).②实时定量PCR法检测显示,常氧条件下被干扰的TE13/shRNA和Eca109/shRNA细胞中HIF-1α RNA表达量较未干扰的TE13、Eca109细胞明显减弱(P＜0.05).HK-ⅡRNA表达结果与HIF-1 RNA一致.③常氧及缺氧培养时,HK-Ⅱ蛋白在TE13/shRNA和Eca109/shRNA细胞的表达均较未干扰的TE13、Eca109细胞明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.05).④缺氧时TE13和Eca109细胞乳酸分泌量为14.707±3.594和15.062±3.901,较常氧时增多(6.070±1.839和6.891±1.592,P＜0.05).TE13/shRNA、Eca109/shRNA乳酸分泌量较未静默TE13、Eca109细胞显著减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 食管鳞癌中HIF-1α及HK-Ⅱ在缺氧条件下表达明显增强,HK-Ⅱ表达及乳酸浓度与HIF-1α表达密切相关,HIF-1α可能通过HK-Ⅱ影响细胞的糖酵解水平.     

慢病毒载体PLKO．1-shHIF-2α的构建及鉴定

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的干涉缺氧诱导因子（HIF）-2α表达的慢病毒载体,并对所得产物进行鉴定。方法体外合成的单链HIF-2α干涉片段经过退火后形成的双链片段和以质粒 PCDH为模板扩增出的EF1-EGFP 均与PLKO．1-puro连接,形成重组的慢病毒载体质粒PLKO．1-shHIF-2α,后者与pMD2G,pSAX2共转染293 FT细胞中进行包装,产生重组慢病毒颗粒。用其感染786-0细胞,检测细胞中GFP表达情况。结果成功扩增出干涉HIF-2α片段和EF1-EGFP片段,酶切鉴定及测序均证实PLKO．1-shHIF-2α质粒构建成功。转染293FT细胞产生的重组慢病毒颗粒感染786-0细胞后高表达绿色荧光。结论成功构建了高效的带GFP报告基因并稳定干涉HIF-2α表达的慢病毒载体。     

低氧对无糖逆境中星形胶质细胞增殖和凋亡的作用

目的探讨星形胶质细胞对低氧的耐受程度;葡萄糖对其凋亡和增殖的影响及无糖逆境中低氧微环境对胶质细胞的是否具有保护作用及可能分子机制。方法通过三气培养箱构建低氧微环境,将星形胶质细胞(HAC)设为常氧常糖组(21%O2-G+)和常氧无糖组(21%O2-G-),低氧常糖组(0.1%O2-G+)和低氧无糖组(0.1%O2-G-)。分别在不同培养条件下培养24、48、72 h后通过MTT法及Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡情况,利用Western印迹法检测各组低氧诱导因子(HIF)-1α表达情况。结果在低氧常糖组星形胶质细胞各时间段无明显凋亡(P0.05),但可缓慢增殖。常氧无糖组及低氧无糖组48 h细胞开始发生明显凋亡,增殖被显著抑制(P0.05),48 h低氧无糖组细胞凋亡明显低于常氧无糖组(P0.05),至72 h凋亡率高于常氧无糖组(P0.05)。低氧可诱导HIF-1α表达水平增高,其中低氧常糖组HIF-1α表达水平最高,其次为低氧无糖组,常氧常糖及常氧无糖组表达量均较低。结论星形胶质细胞可耐受极度低氧;葡萄糖缺乏可诱导细胞发生明显的凋亡并抑制其增殖;低氧可在一定时限内部分对抗葡萄糖缺乏所诱导细胞凋亡。低氧可诱导HIF-1α的高表达,并且可能与低氧抗无糖逆境作用有关。     

低氧诱导因子1α基因转染的人脂肪源性干细胞对肾小管上皮细胞损伤的影响

将低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因质粒高效感染人脂肪源性干细胞(hADSCs),并与顺铂诱导的入近端肾小管上皮细胞(HK-2)共孵育,观察hADSCs对HK-2细胞损伤的影响.方法:以慢病毒为载体,将HIF-1α转染hADSCs,与顺铂诱导的HK-2细胞共孵育.电镜观察HK-2细胞形态、结构的变化;原位末端标记(TUNEL)检测细胞凋亡指数;Western blot检测HK-2细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病2基因(Bcl-2)的变化及hADSCs细胞促红细胞生成素(EPO)、血红素氧化酶1(HO-1)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达,ELISA检测培养液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和肾损伤分子1(KIM-1)的浓度,EPO、HO-1、VEGF和HIF-1α的浓度变化.结果:(1)与顺铂诱导组相比,共孵育后的HK-2细胞结构损伤减轻、凋亡细胞减少,caspase-3的表达低于顺铂诱导组、Bcl-2的表达水平升高;其中HIF-1α转染的hADSCs与HK-2细胞共孵育后,HK-2细胞损伤明显减轻,凋亡蛋白的变化更为明显.(2)顺铂诱导组培养液中NGAL、KIM-1浓度升高,以KIM-1变化明显(P＜0.05);细胞共孵育后培养液中KIM-1浓度降低,转染组较明显.(3)转染后的hADSCs细胞内EPO、HO-1、VEGF的蛋白表达升高;培养液中HO-1、VEGF含量增高(P＜0.05),HIF-1α、EPO的含量变化不明显.结论:hADSCs与HK-2细胞共孵育后,可以减轻顺铂诱导的HK-2细胞结构损伤、抑制细胞凋亡,HIF-1 α转染hADSCs后其作用更为明显,可能与细胞保护因子的高表达有关.     

缺氧对食管鳞状细胞癌中缺氧诱导因子-1α和己糖激酶-Ⅱ表达的影响

目的 观察缺氧对食管鳞状细胞癌中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和己糖激酶-Ⅱ(HK-Ⅱ)表达的影响及对糖酵解的作用.方法 培养人食管鳞状细胞癌TEl3、Ecal09细胞株,采取分组方式培养,观察组在1％氧浓度下培养,对照组在20％氧浓度下培养.利用实时定量PCR方法检测两组细胞中HIF-1 α和HK-ⅡRNA表达,同时利用分光光度法检测常氧和缺氧条件下细胞培养液中细胞的乳酸浓度变化.结果 实时定量PCR法检测显示,常氧条件下被干扰的TEl3/shRNA和Ecal09/shRNA细胞中HIF-1α RNA表达量较未干扰的TEl3、Ecal09细胞明显减弱(P＜0.01),HK-ⅡRNA表达结果与HIF-1α RNA一致.另外,TEl3和Ecal09细胞在缺氧条件下分泌乳酸明显较对照组增多.结论 食管鳞癌中HIF-1α及HK-Ⅱ在缺氧条件下表达明显增强,HK-Ⅱ表达及乳酸浓度与HIF-1α表达密切相关,HIF-1α可能通过HK-Ⅱ影响细胞的糖酵解水平.     

腺病毒介导HIF-1基因转染对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究腺病毒介导缺氧诱导因子-1α基因转染对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用。方法:采用纯化培养的新生大鼠心肌细胞建立缺血再灌注损伤模型,实验分6组:正常细胞培养组,缺氧复氧损伤模型组(I/R组),基因转染小、大剂量组(AdHIF-1α组,MOI50,100),转染腺病毒空载体组(AdBlank组),转染HIF-1α核酶基因组(AtHIF-1α组)。测定各组缺氧复氧后细胞损伤指标乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量及细胞活性情况。结果:AdHIF-1α组(MOI50,100)较I/R组、AdBlank组、AtHIF-1α组LDH、MDA明显降低,细胞活性高(P<0.05)。结论:腺病毒介导HIF-1α基因转染心肌细胞具有抗缺血再灌注损伤、保护心肌的作用。     

白藜芦醇抑制缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞凋亡的研究

目的探讨白藜芦醇对缺氧复氧诱导心肌微血管内皮细胞(CMEC)凋亡的抑制作用及其可能的分子机制。方法体外培养大鼠CMEC,建立缺氧复氧损伤模型,随机分为对照1组、缺氧复氧1组、缺氧复氧+白藜芦醇组(白藜芦醇1组),白藜芦醇分别选择5、10、20、30及40μmol/L浓度,MTT法检测CMEC增殖能力。20μmol/L白藜芦醇为最适浓度,使用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002,后续实验又分为对照2组、缺氧复氧2组、缺氧复氧+白藜芦醇2组(白藜芦醇2组)、缺氧复氧+白藜芦醇+LY294002组(LY294002组)。PI-AnnexinⅤ检测CMEC的凋亡;Western blot法检测细胞蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白表达或磷酸化水平。结果与缺氧复氧1组比较,不同浓度白藜芦醇1组均可增加CMEC增殖能力,呈剂量依赖性,以白藜芦醇1组20μmol/L保护作用最显著(P<0.05)。与白藜芦醇2组比较,LY294002组CMEC凋亡率明显升高,磷酸化Akt和Akt蛋白、HIF-1α蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论白藜芦醇可显著抑制缺氧复氧诱导的CMEC凋亡,其机制可能与PI3K/Akt介导的HIF-1α上调相关。