NGF与CNTF促周围神经再生作用的差异性及协同性研究进展

神经生长因子 (NerveGrowthFactor ,NGF)和睫状神经营养因子 (CiliaryNeurotrophicFactor ,CNTF)是两种研究最为广泛和深入的神经营养因子 ,NGF和CNTF促进周围神经再生的作用机制和作用特点不仅具有差异性 ,而且存在有协同作用。本文就近年来该方面的文献报道综述如下。1　周围     

CNTF和NGF在损伤后变性神经组织中的表达与分布

目的：揭示睫状节神经营养因子（ＣＮＴＦ），神经生长因子（ＮＧＦ）在损伤后变性神经组织中的表达与分布。方法：以５例成人正中神经切割伤后２～３个月的神经为材料，取损伤处的近、远侧端，冰冻切片，用特异性抗ＣＮＴＦ、抗ＮＧＦ抗体免疫化学反应，ＡＢＣ系统显色。计算机图象处理技术定量测量阳性免疫反应强度与面积，对照组采用正常正中神经。结果：在神经损伤后的近、远侧端中的ＣＮＴＦ含量明显高于正常组，ＣＮＴＦ位于增生活跃的雪旺细胞内。ＮＧＦ在近、远侧端中的含量均高于正常组，ＮＧＦ主要分布在部分神经纤维的轴索中。结论：ＣＮＴＦ与ＮＧＦ在切割伤后的神经远侧端发生退行性变化的神经组织中仍可表达，呈向上调节趋势。通过神经趋化因子的表达，为神经再生与功能修复提供合适的微环境     

神经生长因子和脑源性神经营养因子基因转入雪旺细胞的实验研究

目的 神经生长因子 (nerve growth factor, NGF)和脑源性神经营养因子（ brain－ derived neurotrophic factor, BDNF）是具有感觉和运动神经元营养活性的因子。为提高雪旺细胞 (Schwann cell, SC)分泌 NGF和 BDNF的能力,将 NGF和 BDNF基因转入 SC进行探讨。方法 用消化后的组织块法和差速离心法分离、纯化雪旺细胞。用脂质体转染法将 NGF和 BDNF基因导入雪旺细胞, ELISA双抗体夹心法检测 NGF和 BDNF的表达。结果 经免疫组化 S－ 100法鉴定 SC纯度达 95％以上。 ELISA双抗体夹心法测定转染后不同时期的 NGF和 BDNF的浓度, 2周后表达增加, 4周后明显增加,差异有非常显著性意义 (P     

脑源性神经营养因子在激活态雪旺细胞中表达的初步实验研究

目的 分析激活态雪旺细胞的脑源性神经营养因子(brain—derived neurotrophic factor，BDNF)表达及其对神经再生的作用。方法 选用20只SD大鼠，将大鼠右侧正中神经及尺神经在腋部切断进行激活(实验组)，左侧的正常神经为(对照组)。采用双酶消化法获取雪旺细胞并进行激活后提取-mRNA，应用RT-PCR的方法比较BDNFmRNA的变化。结果 激活态雪旺细胞BDNFmRNA表达比对照组明显增多。结论 激活态雪旺细胞分泌神经营养因子BDNF增多，具有促进神经再生的作用。     

原代培养雪旺细胞对PC12细胞促分化作用的研究

目的探讨原代培养雪旺细胞对PC12细胞的促分化作用。方法原代培养的雪旺细胞选择性培养液（SCM）刺激PC12细胞观察其分化情况，并以神经生长因子（nervegrowth factor，NGF）、脑源性神经营养因子（brain derived nerve factor，BDNF）为对照组，用免疫组化染色加以验证。结果SCM刺激PC12细胞后促进其分化与NGF刺激后的结果类似，而BDNF刺激PC12细胞后细胞分化不明显。结论雪旺细胞的分泌液可促进PC12细胞分化。     

神经营养因子-3基因转入雪旺细胞的实验研究

目的观察阳离子脂质体转染神经营养因子-3（NT-3）基因在培养雪旺细胞（Schwann cell，SC）的表达和提高雪旺细胞分泌NT-3的能力。方法用消化后的组织块法和差速离心法分离、纯化雪旺细胞。用脂质体转染法将NT-3基因导入雪旺细胞，ELISA双抗体夹心法检测NT-3的表达；免疫组化S-100法鉴定SC的纯度。结果经免疫组化S-100法鉴定SC的纯度达95％以上。ELISA双抗体夹心法测定转染后不同时期的NT-3的浓度，2周后表达增加，4周后明显增加，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论NT-3基因可转入培养的SC并有高效表达。SC作为受体细胞，易于获取并能在体外大量培养繁殖；能较长时间表达所携带基因而不衰减，并能稳定地大量表达。     

神经生长因子与睫状神经营养因子影响周围神经再生的比较研究

目的　比较神经生长因子 (nervegrowthfactor ,NEF)和睫状神经营养因子 (ciliaryneurotrophicfactor ,CNTF)促进大鼠坐骨神经再生作用的差异性。方法　用梭形双通道乳胶管桥接 3 2只SD大鼠坐骨神经缺损 (长 10mm)。按注入桥接管内物质的不同 ,将大鼠随机分为 2组。A组 :医用几丁糖凝胶组 (双侧 ) ,B组 :医用几丁糖凝胶 NGF(左侧 )和医用几丁糖凝胶 CNTF(右侧 )组。术后 12、16周对再生神经作肌电检测和形态学观察。结果　术后 16周 ,A组双支管内再生神经的形态无显著差异 (P >0 .0 5 )。B组NGF侧再生纤维排列欠整齐 ,以有髓纤维为主 ,且髓鞘厚 ,轴突直径大 ;CNTF侧再生神经纤维排列整齐 ,分布均匀 ,有髓纤维与无髓纤维均增加。NGF侧再生神经的运动传导速度慢于CNTF侧 ,但复合运动动作电位 (compoundmotoractionpotential,CMAP)和皮层体感诱发电位 (cortexsomatosesensoryevokedpotential,CSEP)的潜伏期较CNTF侧长 ,波幅较低 (P <0 .0 5 )。结论　NGF促进有髓纤维再生和髓鞘形成的作用较强 ,CNTF可同时促进有髓纤维和无髓纤维再生 ,且其促进神经功能恢复的作用优于NGF。     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的雪旺细胞对大鼠坐骨神经缺损的修复作用

目的　研究胶质细胞源性神经营养因子 (glialcellline derivesneurotrophicfactor ,GDNF)基因对周围神经断伤后促进轴突再生及神经元的保护作用。方法　应用体外获取的GDNF修饰的雪旺细胞结合细胞外基质凝胶及生物可降解聚乳酸 聚羟基乙酸共聚物管 (polyCDL lactide co glycolide ,PLGA)构建的神经移植复合体 ,修复大鼠坐骨神经的缺损。 2 0只成年Wistar大鼠按桥接物的不同随机分为 4组 ,每组 5只。A组 :细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;B组 :雪旺细胞 细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;C组 :GDNF基因修饰的雪旺细胞 细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;D组 :自体神经桥接组。术后 12周检测运动神经传导速度 ,并进行再生神经的组织形态学观察以及计量学分析。结果　术后 12周 ,坐骨神经的运动神经传导速度 ,轴突数、髓鞘的厚度、神经纤维的直径、神经组织面积的百分比和脊髓前角运动神经元存活率等 ,C组均优于A、B组 (P <0 .0 1) ,而与D组相比无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论　雪旺细胞的转基因处理可能弥补单纯细胞移植神经营养因子含量的不足 ,而达到与自体神经移植相似的效果。     

神经生长因子和雪旺氏细胞分泌的神经营养活性物质促进周围神经再生的实验研究

在桥接大鼠坐骨神经２０ｍｍ缺损的肌移植体中，于术中、术后１０天、２０天分３次分别注Ａ２．５Ｓ神经生长因子（ＮＧＦ）纯品和雪旺氏细胞分泌的神经营养活性物质（５Ｃ－Ｄ－ＮＴＳ）。术后５个月经组织形态学、神经电生理和肌肉收缩功能测定等，发现两者均能促进周围神经再生，其中注入ＳＣ－Ｄ－ＮＴＳ组能增加再生有髓神经纤维的数目、直径和髓鞘厚度，提高腓肠肌Ｍ波幅值，增强比目鱼肌收缩力；而注入ＮＧＦ组仅增加再生有髓神经纤维数口。     

神经再生液中相对分子质量为6.16000～10.23000的蛋白粗制品、NGF和CNTF对背根神经节细胞生长的影响

目的研究神经再生条件液中相对分子质量为６．１６０００～１０．２３０００的蛋白粗制品（ｐｒｏ－ｔｅｉｎｉｎｎｅｒｖｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｆｌｕｉｄｓ,ＮＲＣＦｐ）、睫状神经营养因子（ｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＣＮＴＦ）和神经生长因子（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＮＧＦ）对背根神经节感觉神经元细胞有无促进其存活和生长的作用。方法采用背根神经节体外植块培养,分散培养及ＭＴＴ微量比色法,比较在培养器,培养板孔中加入神经再生条件中相对分子质量为６．１６０００～１０．２３０００的蛋白粗制品、ＣＮＴＦ及ＮＧＦ三个实验组,对体外培养的背根神经节神经元细胞生长的影响。结果三实验组中背根神经节神经元细胞的轴突生长均旺盛,它们的四唑盐终产物与对照组（加ＤＮＥＮ培养液）相比,其差异有显著性意义（Ｐ＜０．０１）,但各实验组之间无明显差异。结论神经再生条件液中相对分子质量为６．１６０００～１０．２３０００的蛋白粗制品、ＣＮＴＦ及ＮＧＦ对背根神经节神经元细胞体有促进其存活和生长的作用。     

感觉性和运动性神经来源许旺细胞神经生长因子的表达

目的;研究感觉性和运动性许旺细胞神经生长因子的表达是否有区别,进而探讨对神经特异性再生的影响。方法：体外培养高纯度的运动性许旺细胞,每种细胞分别在常规和添加白细胞介素－1培养基中培养,用双抗体夹心ELISA法测量不同时间培养培养基中神经生长因子表达量。结果：两种培养条件一,感觉性许旺细胞的神经生长均呈双峰状,第二峰较第一峰明显增高,运动性许旺细胞的表达在第6、7d达峰值,但总体水平较感觉性许旺细胞为低。结论：两种许旺细胞神经生长因子的表达量和特点具有差别,这种差别可以为解释神经特异性再生提供依据。     

转染NGF基因的Schwann细胞对慢性神经根嵌压伤后神经修复的作用

目的观察转染NGF基因的Schwann细胞（SCs）在慢性神经根嵌压伤后神经修复中的作用。方法建立大鼠腰神经根慢性嵌压伤的动物模型,体外培养、纯化SCs并转染NGF基因,检测基因表达后种植于神经根嵌压伤处,术后2周处死动物切取神经根组织,行western blot、组织形态学及免疫组织化学检测。结果转染NGF的SCs可以在体内长期存活并形成新的髓鞘,较生理盐水对照组及单纯SCs组显著促进慢性神经根嵌压伤后的神经修复。结论转染NGF基因的SCs在慢性神经根嵌压伤后的神经修复中具有显著的促进作用,为慢性神经损伤的基因治疗提供了新的方法。     

用Iodogen法标记许旺细胞源神经营养因子的实验研究

目的：用Iodogen法标记许旺细胞源神经营养因子（SDNF）,以便下一步进行了SDNF在组织的受体的研究。方法：先将Iodogen涂布于小瓶内,加入SDNF和Na^128I溶液,摇匀,在室温下反应6min,滴入Sephadex LH20柱,分步收集而成SDNF放射性碘标记物。结果：本法可获得的SDNF放射性碘标记物可达99．7％放化纯度,SDNF的神经营养活性和免疫活性没有下降,能在－80℃保存条件下较稳定,符合进行SDNF受体分析的要求。结论：用Iodogen法标记SDNF方法简单,6min内便完成,既省时又达到较高的标记率,比通常用氯胺T法容易控制,其反应交易好得多。     

许旺细胞源神经营养因子对发育期运动神经元效应的实验研究

目的 研究许旺细胞源神经营养因子对发育期运动神经元的效应。方法 14只新生SD大鼠切断一侧面神经后随机分为实验组和对照组，实验组，局部用许旺细胞源神经营养因子(10μg/d)1周，对照组予等量PRS。观察面神经核中运动神经元数量、形态。结果实验组运动神经元数量、形态均优于对照组。结论 发育期面神经切断后，应用许旺细胞源神经营养因子可维持运动神经元存活。     

Comparison of acellular nerve allograft modification with Schwann cells or VEGF

Background

Individual contributions of exogenous Schwann cells (SCs) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were evaluated in acellular nerve allografts (ANAs). ANA processing removes SCs and vasculature, likely contributing to reduced regeneration compared to autografts. Exogenous SCs may improve the regenerative microenvironment, and VEGF has been shown to stimulate angiogenesis. Replacing these components in ANAs may improve regeneration.

Methods

A rat sciatic nerve transection model was used to study 20-mm grafts. Four graft types were studied: (1) isograft, (2) ANA, (3) ANA-SCs, and (4) ANA-VEGF. After 10 weeks in vivo, the midgraft and distal nerve to the grafts were analyzed for axonal regeneration using histomorphometry to assess total myelinated axon counts, density, width, and percent neural tissue.

Results

The most axons in the distal nerve were regenerated in the isograft followed by the ANA- SC group, with 9171 ± 1822 and 7103 ± 1576 regenerated axons respectively. Both the ANA and ANA-VEGF groups had significantly fewer regenerated axons compared to the isograft (p < 0.05) with 5225 ± 2994 and 5709 ± 2657 regenerated axons, respectively. The ANA and ANA-VEGF groups also had significantly reduced fiber density and percent nerve compared to the isograft; the isograft and ANA-SC groups were not significantly different (p < 0.05).

Conclusions

These results show that SCs improve axonal regeneration in a 20 mm ANA to a greater extent than VEGF. VEGF treatment showed a trend toward increased axonal regeneration but was not significantly different compared to the untreated ANA. The role of VEGF may be clearer in longer grafts where ischemia is a greater factor.     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的雪旺氏细胞修复大鼠周围神经缺损的实验研究

目的　从转基因角度探讨治疗周围神经损伤的有效方法。方法　成年Wister大鼠 4 8只 ,平均分为 3组。切断大鼠坐骨神经并形成 10mm长缺损 ,用硅胶管桥接两侧断端 ,管腔内植入胶质细胞源性神经营养因子 (glialcell linederivedneurotrophicfactor,GDNF)修饰的雪旺氏细胞 (schwanncells,SCs) ,正常SCs修复组和单纯硅胶管修复组作为对照 ,分别于术后 4、8、12和 16周对各组动物进行大体观察 ,肌电图测量 ,组织学切片观察 ,再生神经的神经电生理检测 ,GDNF免疫组化检测 ,组织学切片 ,观察和图像分析。结果　GDNF SCs组动物的神经传导速度、有髓神经纤维密度、神经组织面积、髓鞘厚度均显著优于SCs组和硅胶管组。结论　将GDNF基因修饰的雪旺氏细胞移植修复周围神经缺损 ,使局部释放的GDNF维持神经元存活 ,加快轴突再生速度以促进周围神经再生 ,此方法为将来治疗周围神经损伤提供了线索。     

联合使用ATP和NGF对周围神经再生作用的实验研究

目的 研究三磷酸腺苷(adenosine tri-phosphate，ATP)和神经生长因子(nerve growth factor，NGF)联合使用时对受损周围神经再生的作用并比较两者作用的强弱。方法 将64只SD大鼠左侧坐骨神经切断后直接作端端缝合，缝合段置于硅胶管室内。根据室内注入药物的不同，分为生理盐水(NS)、ATP、NGF、和ATP加NGF4组，每组16只大鼠。术后4周和8周(每组均为8只)取标本，作形态学，肌湿重，运动神经传导速度(MNCV)、复合运动动作电位(CMAP)波幅，及组织学的检测。结果 ATP加NGF组的神经纤维数目、大小、髓鞘厚度和MNCV、CMAP及肌湿重均优于其它3个组。NGF组的各项指标比ATP组好。结论联合使用ATP和NGF时受损周围神经的再生作用明显增强。NGF的作用强于ATP。     

GDNF-transduced Schwann cell grafts enhance regeneration of erectile nerves

Background

Schwann cell–seeded guidance tubes have been shown to promote cavernous nerve regeneration, and the local delivery of neurotrophic factors may additionally enhance nerve regenerative capacity. The present study evaluates whether the transplantation of GDNF-overexpressing Schwann cells may enhance regeneration of bilaterally transected erectile nerves in rats.

Methods

Silicon tubes seeded with either GDNF-overexpressing or GFP-expressing Schwann cells were implanted into the gaps between transected cavernous nerve endings. Six (10 study nerves) or 12 wk (20 study nerves) postoperatively, erectile function was evaluated by relaparotomy, electrical nerve stimulation, and intracavernous pressure recording, followed by ultrastructural evaluation of reconstructed nerves employing bright-field and electron microscopy. Additional animals were either sham-operated (positive control; 20 study nerves) or received bilateral nerve transection without nerve reconstruction (negative control; 20 study nerves).

Results

The combination of GDNF delivery and Schwann cell application promoted an intact erectile response in 90% (9 of 10) of grafted nerves after 6 wk and in 95% (19 of 20) after 12 wk, versus 50% (5 of 10) and 80% (16 of 20) of GFP-expressing Schwann cell grafts (p = 0.02). The functional recovery was paralleled by enhanced axonal regeneration in GDNF-overexpressing Schwann cell grafts, as indicated by larger cross-sectional areas and a significantly higher percentage of neural tissue compared with GFP-transduced controls.

Conclusions

These findings demonstrate that the time required to elicit functional recovery of erectile nerves can be reduced by local delivery of GDNF. In terms of clinical application, this enhanced nerve repair might be critical for timely reinnervation of the corpus cavernosum as a prerequisite for functional recovery in men.     

激活态雪旺细胞源性神经营养因子对胚芽干细胞向神经细胞分化的影响

目的 探索小鼠胚芽干细胞(embryonic germ cells,EGCs)分离、培养的有效方法;观察激活态雪旺细胞(activated Schwann cells,ASCs)源性神经营养因子对小鼠EGCs向神经细胞分化的影响.方法 分离受精11d胚胎小鼠生殖腺嵴及同时取少量的腹壁组织共同消化培养,经胰蛋白酶消化制备成EGCs悬液,将细胞种植在饲养层细胞上.观察小鼠EGCs集落形成情况,并采用阶段特异性胚胎抗原-1染色、碱性磷酸酶染色、过碘酸-雪夫染色对其进行鉴定.采用双酶消化组织块法结合机械分离法分离培养ASCs.神经诱导实验采用基础培养基+小鼠EGCs(空白对照组)和ASCs培养基与小鼠EGCs共培养(实验组),培养3周后对神经诱导结果进行NeuN、MBP、GFAP免疫荧光染色鉴定,计算细胞染色阳性率,对实验结果进行统计学分析.结果 小鼠EGCs呈集落性生长,集落隆起、多数呈鸟巢状、与周围饲养层细胞存在明显界限;集落内的细胞密集,呈现一个或几个核仁、核质比高的圆形或卯圆形;阶段特异性胚胎抗原-1染色、碱性磷酸酶染色、过碘酸-雪夫染色均阳性.小鼠EGCs神经诱导1周后,倒置相差显微镜下可见EGCs克隆的边缘出现向外迁移的细胞,圆形或椭圆形,部分细胞有突起伸出.3周后,迁移的、有细长突起的细胞越来越多,NeuN、MBP、GFAP免疫荧光染色均阳性.细胞染色阳性率比较差异有统计学意义.结论 通过一种简单、经济的方法体外成功分离并获得小鼠EGCs;ASCs源性神经营养因子能够促进小鼠EGCs在体外向神经细胞分化.