Effects of anti-HPV16 E6-ribozyme on the proliferation and apoptosis of human cervical cancer cell line CaSKi.

OBJECTIVE: To study the characterization of anti-HPV16E6-ribozyme transfected into cultured human cervical cancer cell line, and to investigate the effect of ribozyme on the proliferation and apoptosis of the cells. METHODS: By way of lipofectin transfection, anti-HPV16E6-ribozyme, a ribozyme designed to specifically cleave the HPV16E6 gene, and empty vector expression plasmids were respectively transfected into CaSKi cells which were subsequently designated as CaSKi-R and CaSKi-P accordingly. The expression of ribozyme in the transfected cells was observed by RNA dot blot analysis, and E6 mRNA expression was detected by Northern blotting in the 3 kinds of cells whose growth curves and clone-forming ability on soft agar were studied, with their tumorgenicity observed by percutaneous inoculation of the cells in nude mice. Flow cytometry was employed to assess the apoptosis rates and the expression of the genes including c-myc, bcl-2, p53, and fas etc. RESULTS: Stable expression of anti-HPV16E6-ribozyme was observed in CaSKi-R cells that had less E6 mRNA expression than CaSKi had as shown by Northern blotting. When compared with those of CaSKi cells, the growth rate and clone-forming ability on soft agar of CaSKi-R were reduced, while those of CaSKi-P evinced no significant changes. The tumorgenicity of CaSKi-R in nude mice was also comparatively decreased, with markedly elevated apoptosis rate. Anti-HPV16E6-ribozyme reduced the expressions of E6, c-myc, bcl-2, PCNA and C-erbB2 genes but increased p53 expression in CaSKi-R cells, which, however, did not happen in CaSKi-P cells. The expression of Fas underwent no significant changes in response to the transfection. CONCLUSION: Anti-HPVE6-ribozyme inhibits proliferation and induces apoptosis in CaSKi cells, possibly due to the decrease of E6 gene expression that triggers a series of changes in the gene expressions of the cells.     

特异性核酶对宫颈癌细胞系CaSKi增殖与凋亡的影响

目的研究特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响。方法设计特异性切割HPV16E6基因的核酶,构建抗HPV16E6核酶的真核表达质粒。以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R、CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达,Northern blotting检测CaSKi、CaSKi-R、CaSKi-P 3种细胞中E6基因的表达。测定3种细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成率,并以皮下接种法检测细胞在裸鼠体内的成瘤能力。流式细胞仪检测3种细胞的凋亡率,并测定c-myc、bcl-2、p53、fas、PCNA、C-erbB-2等基因的表达。结果点杂交证实该核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达,Northern blotting证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P、CaSKi明显降低。与CaSKi细胞相比,CaSKi-R细胞生长速度、软琼脂克隆形成率明显降低,在裸鼠体内的致癌能力下降,凋亡率明显增高,出现凋亡峰,S期、G2M期细胞百分率下降;而CaSKi-P细胞无此改变。CaSKi-R细胞表达HPV16E6、C-myc、Bcl-2、PCNAC-erbB-2蛋白明显减少,而p53表达明显增高;CaSKi和CaSKi-R细胞中Fas 蛋白的表达相近。CaSKi-P细胞中各基因的表达与CaSKi细胞无显著差异。结论抗HPV16E6核酶的导入能阻碍宫颈癌细胞增殖,诱导其凋亡,其原因可能在于病毒癌基因E6表达的降低,以及由此而引起     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞侵袭表型和VEGF表达的影响

目的 探讨特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞侵袭表型和VEGF表达的影响。方法 以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,分别为CaSKi-R和CaSKi-P。测定CaSKi,CaSKi-R和CaSKi-P 3种细胞的生长曲线、软琼脂克隆形成率和裸鼠体内成瘤性,RT-PCR检测3种细胞中VEGF的表达。结果 CaSKi、CaSKi-P细胞生长速率和软琼脂克隆形成率相近,CaSKi-R细胞的生长速度和软琼脂克隆形成率明显降低。CaSKi 、CaSKi-P致瘤性无显著差异,而CaSKi-R致瘤性显著低于CaSKi(P<0.05)。RT-PCR检测CaSKi-R细胞的VEGF mRNA的表达水平明显低于CaSKi、CaSKi-P细胞的表达,而后者的VEGF mRNA的表达水平相近。结论 特异性抗HPV16E6核酶的导入降低了宫颈癌CaSKi细胞的增殖和侵袭表型,可能与宫颈癌CaSKi细胞内VEGF的表达下降有关。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞放疗影响的研究

目的人乳头瘤病毒（HPV）是官颈癌最主要的致病因素，E6是主要的致癌基因之一，高危HPV基因型，如HPV16的E6蛋白表达水平是维持宫颈癌恶性表型的必要条件；放射治疗是目前宫颈癌治疗的标准和有效的方法；该研究旨在探讨抗HPV16E6核酶（ribozyme）对宫颈癌CaSKi细胞放疗敏感性的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6-ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞，命名为CaSKi—R、CaSKi—P细胞。点杂交交检测核酶在细胞中的表达，Northem杂交检测3种细胞中E6基因的表达。用克隆形成试验检测3种细胞对放疗的敏感性，Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率，流式细胞术检测bcl-2、p53、bax蛋白表达。结果点杂交证实核酶能在CaSKi—R细胞中稳定表达，Northern杂交证实CaSKi-R中E6表达较CaSKi—P、CaSKi中明显降低。CaSKi—R细胞生长速度较CaSKi-P、CaSKi明显减慢（P〈0.01）；CaSKi-R细胞对X射线的敏感性较CaSKi—P、CaSKi明显增加，克隆形成率明显下降（P〈0．05），CaSKi-R细胞照射前后的凋亡率较x射线照射后CaSKi—P、CaSKi明显增加（P〈0．（31）；CaSKi—R细胞p53、bax蛋白表达较CaSKi—P、CaSKi明显升高山bcl-2明显减少（P〈0．01）。结论转染抗HPV16E6-Ribozyme的CaSKi—R细胞出现一定程度的生长抑制，且时放射治疗的敏感性增加。     

Effects of anti- HPV16E6- ribozyme on phenotype and gene expression of a cervical cancer cell line

Objective To investigate the effects of anti- HPV16E6- ribozyme (HRz) on phenotype and gene expression of a cervical cancer cell line. Methods HRz was designed by computer programs.HRz’s activity was identified by cleavage experiments in vitro.HRz and empty eukaryotic plasmids were transfected into CaSKi cells with lipofectin, then renamed CaSKi- R and CaSKi- P, respectively. The expression of ribozyme in transfected cells was observed by RNA dot blot.The amounts of E6 mRNA in three kinds of cells lines were detected by Northern blot.Cell growth curves and soft agar forming ability were studied.The ability of each cell line to form tumors was assessed in nude mice.Apoptosis rates and expression of c- myc, bcl- 2, p53 and Fas were detected by flow cytometry (FCM).Antigens of tumor cells, HLA- 1, HLA- 2, B7- 1 and B7- 2 were also detected.NK, LAK, and CD3AK cells were induced.Their cytotoxicities were detected in CaSKi- R, CaSKi- P, and CaSKi cells. Results In vitro cleavage reaction demonstrated that HRz could cleave HPV16E6 mRNA in a site- specific manner.HRz could be expressed stably in transfected CaSKi cells.Northern blot analysis showed that E6 mRNA levels were lower in CaSKi- R than in CaSKi.The growth rate of CaSKi- R was slower than those of CaSKi and CaSKi- P.The soft agar- forming rate of CaSKi- R was lower compared with those of CaSKi and CaSKi- P cells.The ability of CaSKi- R to form tumors in nude mice was also poor.The apoptosis rate of CaSKi- R cells was much higher than those of CaSKi and CaSKi- P.HRz could reduce the expression of E6, c- myc and bcl- 2 proteins, and increase the expression of p53 as well.HRz could increase the expression of HLA- 2, B7- 1 and B7- 2 antigens.The cytotoxicity of NK, LAK and CD3AK cells was much higher in CaSKi- R than in CaSKi- P and CaSKi cells.Conclusion HRz not only reverses the malignant phenotype of CaSKi cells partially, but also induces apoptosis in the cells, and increases sensitivity of CaSKi cells to immune cells.     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响

目的 研究特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,分别为CaSKi-R和CaSKi-P。观察细胞的生长状态,测定CaSKi,CaSKi-R和CaSKi-P3种细胞的生长曲线、软琼脂克隆形成率、细胞侵袭力实验、裸鼠体内致瘤性,以及RT-PCR检测细胞中COX-2、血管内皮生长因子(VEGF)的表达,同时,免疫组化检测3种细胞COX-2、VEGF抗原表达,分析特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响。结果 CaSKi、CaSKi-P细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力相近,而CaSKi-R细胞的细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力与以上两种细胞相比却明显降低。RT-PCR检测CaSKi-R细胞的COX-2、VEGF表达水平也低于CaSKi、CaSKi-P细胞的表达。细胞免疫组化测定CaSKi、CaSKi-P和CaSKi-R细胞都有COX-2、VEGF抗原表达,而CaSKi-R细胞的抗原染色程度较弱。结论 特异性抗HPV16E6核酶的导入降低了宫颈癌CaSKi细胞的增殖和侵袭表型,可能与宫颈癌CaSKi细胞内COX-2、VEGF的表达水平降低有关。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响

目的研究特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭能力的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞，分别为CaSKi-R和CaSKi—P。观察细胞的生长状态，测定CaSKi．CaSKi—R和CaSKi—P3种细胞的生长曲线、软琼脂克隆形成率、细胞侵袭力实验、裸鼠体内致瘤性，以及RT—PCR检测细胞中COX-2、血管内皮生长因子(VEGF)的表达，同时，免疫组化检测3种细胞COX-2、VEGF抗原表达．分析特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞增殖和侵袭力的影响：结果CaSKi、CaSKi—P细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力相近，而CaSKi-R细胞的细胞生长速率、软琼脂克隆形成率、致瘤性和侵袭力与以上两种细胞相比却明显降低。RT—PCR检测CaSKi—R细胞的COX-2、VEGF表达水平也低于CaSKi、CaSKi—P细胞的表达。细胞免疫组化测定CaSKi、CaSKi—P和CaSKi—R细胞都有COX-2、VEGF抗原表达，而CaSKi—R细胞的抗原染色程度较弱。结论特异性抗HPV16E6核酶的导入降低了宫颈癌CaSKi细胞的增殖和侵袭表型，可能与宫颈癌CaSKi细胞内COX-2、VEGF的表达水平降低有关。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗的影响

目的：研究抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗敏感性的影响。方法：以脂质体法将抗HPV16E6－Ribozyme，空载体质粒分别导入CaSKi细胞，命名为CaSKi-R,CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在我的表达，Northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达。用克隆形成试验控制3种细胞对化疗的敏感性，Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率。结果：点杂交证实核酶能在CaSKi－R细胞中稳定表达，Northern杂交证实CaSKi－R中表达E6较CaSKi－P，CaSKi明显降低。CaSKi－R细胞的生长速率较CaSKi－P，CaSKi明显减慢，泰索作用后相对克隆形成率和凋亡率在3种细胞间亦无差异（P＞0．05）；顺铂作用后CaSKi－R细胞的相对克隆形成率较CaSKi－P，CaSKi明显下降（P＜0．01），而凋亡率明显增加（P＜0．01）。结论：转染抗HPV16E6－ribozyme的CaSKi－R细胞出现一定程度的生长抑制，且对顺铂的敏感性增加，而对泰素的敏感性没有发生改变。     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA）,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入瘤体,观察肿瘤体积的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色,观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时有所恢复;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。     

沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 采用RNA干扰抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤中人乳头瘤病毒(human papillomavirus-16,HPV16)E6基因的表达,观察对裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 将HPV16 E6特异性的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)真核表达载体转染到人宫颈癌细胞株CaSki细胞中,经G418筛选,RT-PCR检测E6基因的表达;将细胞接种到BALB/c裸鼠背部皮下,同时将该质粒注射到人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的裸鼠中,观察肿瘤出现时间及体积变化;观察肿瘤组织的病理改变.结果 成功筛选到持续表达E6 siRNA的CaSki细胞,经RT-PCR检测该细胞中HPV16 E6基因表达降低;裸鼠成瘤实验结果显示,处理后的CaSki细胞成瘤能力明显降低,抑瘤率为71.4%;注射质粒进行基因治疗后,裸鼠肿瘤生长受到抑制,肿瘤的体积与质量明显低于CaSki细胞组,差异具有显著性(P＜0.05).病理检查结果显示,经pGensil-CH2处理的肿瘤生长不佳,细胞分裂像少见,组织内有较多坏死区域.结论 沉默CaSki细胞中HPV16 E6基因的表达能明显降低宫癌细胞的成瘤作用.     

人KIAA1173基因的克隆、转染及生物学特性的实验研究

目的 建立表达KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性。方法 从新鲜肌肉组织中提取总RNA,采取逆转录PCR得到人KIAA1173基因cDNA。获得的人KIAA1173基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3.1(+)-KIAA1173和空载体利用阳离子脂质体介导转入鼻咽癌6-10B细胞,经G418筛选阳性克隆。用RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学等方法检测KIAA1173基因在6-10B细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法、肿瘤细胞侵袭实验及裸鼠体内成瘤性实验方法,检测KIAA1173基因对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭及成瘤能力的影响。以空白质粒转染组作为对照。结果 在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有KIAA1173基因的高表达,表明细胞可表达人KIAA1173基因。6-10B在转染了pcDNA3.1(+)-KIAA1173后,较转染空载体pcDNA3.1(+),肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力及裸鼠体内成瘤能力明显降低(P<0.05)。结论 结果提示KIAA1173基因可能是一鼻咽癌肿瘤抑制基因。获得生物学活性稳定的KIAA1173基因高表达的鼻咽癌细胞模型,为进一步研究奠定了基础。     

不可逆性电穿孔介导HPV16 E6 shRNA干扰质粒对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

目的:探讨利用治疗剂量脉冲电场产生不可逆电穿孔(IRE)介导HPV16 E6 shRNA干扰质粒进入细胞的可行性,阐明二者共同作用对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响及其作用机制。方法:将HPV16 E6基因特异性干扰序列插入pGenesil-1质粒,构建HPV16 E6 shRNA真核表达载体,将10个电压为800 V、脉宽100 μs、频率1 Hz的IRE作用于SiHa细胞与HPV 16 E6 shRNA干扰质粒的混悬液,根据处理因素组合,分为空白对照组、IRE处理组、pGenesil-N组、pGenesil-N+IRE组、pGenesil-E6组和pGenesil-E6+IRE组。在荧光显微镜下观察SiHa细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达,计算GFP表达效率;RT-PCR法检测HPV 16 E6 mRNA表达水平,Western blotting法检测HPV16 E6蛋白、P53及PCNA蛋白表达水平,CCK-8法检测各组SiHa细胞增殖能力的变化。结果:成功构建HPV16 E6 shRNA真核表达载体,IRE处理后24 h细胞即可见到绿色荧光;与IRE组比较,pGenesil-E6+IRE组E6 mRNA表达水平下降(P<0.05),E6蛋白表达水平降低(P<0.05),P53蛋白表达水平增高(P<0.05),PCNA表达水平下降(P<0.05);CCK-8法检测,与pGenesil-E6组比较,pGenesil-E6+IRE组细胞增殖活性下降更明显(P<0.05)。结论:治疗剂量的IRE可介导外源基因进入细胞,二者联合作用能明显抑制宫颈癌SiHa细胞增殖。     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体,感染HPV16阳性宫颈癌细胞,筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体,脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,收集病毒上清,感染靶细胞SiHa,G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达,细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,病毒感染靶细胞SiHa后,筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆,RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达,HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。     

靶向人乳头瘤病毒16型-E6的siRNA对宫颈癌肿瘤生长的影响

目的 研究靶向HPV16-E6的小分子干扰RNA抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长.方法 建立裸鼠宫颈癌模型,HPV16-E6 siRNA瘤体内多点注射观察肿瘤的生长情况,使用HE染色方法观察肿瘤组织细胞在pSiRNA或pCON治疗后的病理学改变;免疫组化采用SP法.结果 靶向HPV16-E6的小分子干扰RNA能显著抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长.结论 利用宫颈癌裸鼠移植瘤模型,证明靶向HPV16-E6的siRNA能够显著抑制宫颈癌裸鼠移植瘤的生长.     

HPV16 E6对宫颈癌 E-cadherin 表达水平和基因甲基化的影响

目的：探讨 HPV16E6对宫颈癌组织和细胞中 E-cadherin 表达水平及基因甲基化状态的影响。方法：检测20例宫颈鳞癌组织及12例正常宫颈组织中 HPV16E6、E-cadherin 蛋白表达水平及 E-cadherin 甲基化率。采用 Siha 细胞构建 HPV16E6沉默细胞株,检测 siRNAE6对细胞 E-cadherinmRNA 和蛋白表达影响,以及E-cadherin 甲基化状态。结果：HPV16E6蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达高于正常宫颈组织,E-cadherin 蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达低于正常宫颈组织。正常宫颈组织均未扩增出 E-cadherin 基因甲基化条带;宫颈鳞癌组织中,E-cadherin 基因甲基化检出率为65.0%。筛选得到 HPV16E6稳定下调的 Siha 细胞系。E-cadherinmRNA 及蛋白表达在 siRNAE6组均显著高于空载体组和空白对照组。E-cadherin 基因甲基化扩增条带在 siRNAE6组呈弱阳性,而在空载体组及空白对照组呈强阳性。结论：HPV16E6可引起宫颈癌组织和细胞中 E-cadherin 基因甲基化,并可导致 E-cadherinmRNA 及蛋白的表达水平下调。     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。     

pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的构建及转染角朊细胞的瞬时表达

目的：构建ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体,观察其在角朊细胞中的瞬时。方法：基因重组技术,基因转染技术。结论 ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体便于观察,转染细胞中ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７－ＧＦＰ融合蛋白的表达民政部及蛋白定位,适用于对ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７分子生物学特性及致瘤机理的研究。     

RNA干涉（RNAi）抑制宫颈癌细胞SiHa中E7基因表达的实验研究

目的探讨HPV16 E7特异性小干涉RNA（siRNA）表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的抑制作用。方法构建HPV16 E7特异性表达载体,利用脂质粒转染SiHa细胞,用RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白的影响。结果两条siRNA均能有效抑制E7mRNA的转录表达,其中以pshRNA-HPV16 E71作用效果最明显,在转染后72h,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分剐为78．4％和57．6％。结论HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达有抑制作用。