胃癌相关基因在癌前病变中的表达

目前认为癌的形成过程是多阶段、多过程的,包括多个连续的独立的事件,是多个遗传物质即基因积累改变的结果．与胃癌发生、发展有关的基因有3种：癌基因、抑癌基因、程序死亡基因．原癌基因的激活和抑癌基因的失活可使细胞增生,程序死亡基因的失活可能使细胞永生化,在胃癌的发生、发展的各个阶段,至少有两种以上的基因突变,他们各自发挥不同作用．研究胃癌相关基因在癌前病变中的表达,总结基因改变在癌变过程中的作用和地位．可以从分子水平揭开胃黏膜癌变的本质,进而明确胃癌发生、发展的分子机制．     

胃癌相关基因GCRG213正反义真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．方法:从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,两端分别引入限制性内切酶KpnI,BamHI和EcoRI, BamHI识别位点．按正向、反向克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )．测序正确的重组子pcDNA3．1-a(含GCRG213正向克隆), pcDNA3．1-b(含GCRG213反向克隆)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞, G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用半定量RT-PCR及Wlestern blot比较转染不同质粒的 MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异．结果:经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体 pcDNA3．1( ),组成重组子pcDNA3．1-a(含正向克隆),pcDNA3．1-b(含反向克隆)．重组子 pcDNA3．1-a,pcDNA3．1-b和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株．与对应的空载体比较,RT-PCR结果显示转染pcDNA3．1-a的 MKN45细胞中其mRNA的表达上调35．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其mRNA 的表达下调32．1％;Western blot结果显示转染 pcDNA3．1-a的MKN45细胞中其蛋白的表达上调49．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其蛋白的表达下调50．3％．结论:成功构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞MKN45的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45的影响.方法 采用分子克隆及基因转染技术将GCRG213基因转入哺乳动物细胞,并结合反义转染技术研究GCRG213基因对胃癌细胞恶性生物学行为的影响.结果结果 GCRG213正向和反向克隆正确插人真核表达载体pcDNA3.1(+);重组子pcDNA3.1-a、pcDNA3.1-b和空载体转染人胃癌细胞系MKN45细胞;正义转染其mRNA的表达上调,而反义转染下调;正义转染加快MKN45细胞生长增殖速度、降低细胞凋亡率,反义转染减慢MKN45细胞生长增殖速度,增加细胞凋亡率.结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞生长、分裂和转移,抑制肿瘤细胞的凋亡,可能是一个新发现的恶性肿瘤癌变的促进因素.     

幽门螺杆菌GGT基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆幽门螺杆菌( H pylori)γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)基因,实现GGT基因在大肠杆菌中的表达.方法: 从胃癌患者胃黏膜组织中分离培养获得H pylori,提取其基因组DNA,对GGT基因进行PCR扩增,克隆进pMD18-T载体,酶切和测序验证,构建原核表达载体pET-28a(+)-GGT,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析检测表达产物.结果: 成功克隆了GGT基因,经酶切和测序验证正确,成功构建了pET-28a(+)-GGT质粒,高效表达出了68 kDa的融合蛋白.结论: 在大肠杆菌中成功表达了GGT重组融合蛋白,为进一步研究GGT与线粒体介导的细胞凋亡之间的关系奠定了基础.     

细胞连接蛋白基因在胃癌中的表达、诱导及突变研究

目的 研究人胃癌基因组中Ｃｘ基因的表达、探讨诱导剂作用后Ｃｘ基因的表达变化及Ｃｘ４３编码序列有无突变。方法 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ－单链构象多肽分析。结果 １．发现了在人正常胃黏膜上皮、癌旁组织及胃癌中Ｃｘ基因的表达规律,明确了Ｃｘ基因在人胃癌基因组中的表达谱。２．维甲酸（ＲＡ）、二甲基亚砚（ＤＭＳＯ）对胃癌细胞基因组中Ｃｘ４３基因有诱导表达作用,而其本身表达的Ｃｘ４６在ＲＡ及     

柯萨奇B1病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达柯萨奇B1（CVB1）病毒VP1蛋白。方法：用限制性酶切方法将CVB1 VP1基因从pMD18-T-VP1上切下，连续至pQE30构建原核表达系统pQE30-VP1，经酶切和PCR验证后转化至大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导目的基因表达，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blot检测VP1蛋白的表达，结果：酶切，PCR证明构建的原核表达系统携带方向正确的CVB1 VP1基因。SDS－PAGE和Westernblot;实验均可于33．0kDa处见到目的条带。结论：CVB1 VP1基因在大肠杆菌的成功表达开发新的血清学检测试剂提供了基础。     

Autotaxin基因在人胃癌中的表达及其意义

本研究采用半定量逆转录 聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)检测Ａｕｔｏｔａｘｉｎ(ＡＴＸ)ｍＲＮＡ在胃癌中的表达 ,分析其表达水平与胃癌临床病理特征的关系 ,探讨ＡＴＸ基因表达在判断胃癌浸润、转移及预后中的意义。材料和方法一、实验材料人胃癌标本取自 1999年 1～ 8月在南京医科大学南京第一医院外科手术切除 ,经病理组织学证实的胃癌患者 ,共36例。男 2 2例 ,女 14例 ;年龄为 30～ 79岁 ,<6 0岁 15例(平均 49.9岁 ) ,≥ 6 0岁 2 1例 (平均 6 7.9岁 ) ;肿瘤 <3ｃｍ 15例 (平均 2 .4ｃｍ) ;≥ 3ｃｍ 2 1例 (平均 4.3ｃｍ) ;分化程度 :高分…     

心肌特异表达基因p93的激酶及丝氨酸结构域在大肠杆菌中的高效表达

目的在大肠杆菌中高水平表达并分离纯化心脏特异表达基因p93的激酶与丝氨酸结构域片段.方法利用DNA重组技术,构建C末端带有6×His标签的p93激酶与丝氨酸结构域(p93-C)片段的原核表达载体pET28a-p93-C.对诱导表达条件和包涵体洗涤条件优化后,用Ni2 金属螯合吸附层析柱纯化.结果成功构建了pET28a-p93-C原核表达载体,诱导后摇床转速在350r/min下表达量最高,包涵体洗涤在超声条件下较好,分离纯化后从100ml菌液中可获得2.5mg蛋白.结论建立了高效稳定的p93-C原核表达体系以及较好的包涵体洗涤方法.     

LINE-1 family member GCRG123 gene is up-regulated in human gastric signet-ring cell carcinoma

AIM： To analyze the expression profiles of a human gastriccancer-related gene, GCRG123, in human gastric signetring cell carcinoma tissues, and to perform bioinformatics analysis on GCRG123.
METHODS： In situ hybridization was used to explore the GCRG123 expression pattern in paraffin-embedded gastric tissues, including 15 cases of signet-ring cell carcinoma, 15 of intestinal-type adenocarcinoma, and 15 of normal gastric mucosa. Northern blotting was used to analyze the differences in GCRG123 expression between stomach signet-ring cell carcinoma and intestinal-type adenocarcinoma tissues. Online software, including BLAST, Multalin and BLAT, were applied for bioinformatics analysis. National Center for Biotechnology Information （NCBI） and the University of California Santa Cruz （UCSC） databases were used for the analyses.
RESULTS： The in situ hybridization signal appeared as blue precipitates restricted to the cytoplasm. Ten out of 15 cases of gastric signet ring cell carcinoma, normal gastric mucosal epithelium and pyloric glands showed high GCRG123 expression. Low GCRG123 expression was observed in gastric intestinal-type adenocarcinoma and normal gastric glands. Northern blotting revealed that GCRG123 was up-regulated in signet-ring cell carcinoma tissue but down-regulated in intestinal-type adenocarcinoma tissue. BLAST and Multalin analyses revealed that the GCRG123 sequence had 92% similarity with the ORF2 sequence of human long interspersed nuclear element retrotransposons （LINE-1, L1）. BLAT analysis indicated that GCRG123 mapped to all chromosomes. GCRG123 was found to integrate in the intron-17 and -23 of Rb, 5＇ flanking region of IL-2 and clotting factor Ⅸ genes.
CONCLUSION： GCRG123, an active member of the Lt family, was up-regulated in human gastric signet-ring cell carcinoma.     

胃癌相关基因GCRG213正反向转染和RNA干扰对裸鼠胃癌种植瘤的影响

目的:观察胃癌相关基因GCRG213体内正、反向转染和RNA干扰对裸鼠胃癌种植瘤的影响.方法:将对数生长期的胃癌细胞株MKN45接种到裸鼠皮下,成瘤后用制备好的分别含GCRG213正、反义克隆和RNAi片段的腺相关病毒分别在肿瘤局部注射,以空病毒和生理盐水对照,继续喂养2 wk后处死,取肿瘤测量重量,并用半定量RT-PCR检测肿瘤组织GCRG213mRNA表达水平.结果:裸鼠接种MKN45细胞3 wk左右皮下形成肿瘤结节.肿瘤组织重量在正向转染组为5.12±1.02g、反向组1.22±0.46g、RNAi组0.81±0.37g、空病毒组3.13±0.69g、生理盐水组3.45±0.87g;各组GCRG213 mRNA表达水平依次分别为0.406±0.01 3,0.211±0.021,0.087±0.015,0.312±0.050,0.283±0.061.结论:三种腺相关病毒分别有效地介导了GCRG213正、反义克隆和RNAi片段的体内表达,提高或降低了GCRG213 mRNA的表达水平,促进或抑制了胃癌种植瘤的生长.     

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。     

犬钩虫(Ancylostoma caninum)天冬氨酸蛋白酶基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的对犬钩虫(Ancylostomacaninum)天冬氨酸蛋白酶Asp基因进行了克隆,鉴定,并在原核系统中进行表达。方法以犬钩虫总RNA为模板,用RT-PCR法对犬钩虫天冬氨酸蛋白酶Asp基因进行扩增,获得的AspcDNA产物克隆进pMD-18T载体,用PCR筛选阳性克隆。碱裂解法进行质粒提取,单、双酶切进行鉴定并测序。将测序正确的阳性克隆进行双酶切,构建到表达载体pET-32a中,将此重组质粒先转化到E.coliDH5a内,提取质粒,酶切鉴定阳性,再转化入表达宿主E.coliBL21(DE3)菌株内,对转化菌株用IPTG进行诱导培养。收集培养液,破菌、离心,上清进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素膜上后进行免疫印迹分析。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白,所表达蛋白相对分子量为40kDa,抗体检测有特异条带大小为40kDa。结论成功进行了犬钩虫天冬氨酸蛋白酶Asp基因的克隆表达。     

编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒 ,初步观察P30基因在E coli表达。方法　将P30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -P30 ;采用亚克隆技术 ,将含P30和hsp70起动基因的复合片段 ,插入表达载体 pBK -CMV质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒 pBK -P30转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS -PAGE和Westernboltting分析。 结果　 1)阳性重组质粒 pBCG -P30、pBK -P30经酶切和PCR鉴定 ,与预期的结果相符合。 2 )序列测定证实克隆的基因为编码P30抗原的基因。 3)P30基因在大肠杆菌诱导表达后获得4 5kDa融合蛋白 ,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得表达 ,为弓形虫DNA疫苗的研制奠定基础     

人类凋亡相关新基因APG的克隆表达及其与肝癌关系

研究和克隆新的肝癌凋亡相关基因，探索肝癌发生机制。采用同源筛选、RT—PCR等克隆肝癌凋亡相关基因APG，分析其在肝癌及癌旁组织中表达，测序比对，研究其与肝癌之间相关性。克隆了一个肝癌凋亡相关基因，cDNA全长为563bp。其在肝癌及癌旁组织中序列存在一定差异。50例肝癌中，16％(8／50)为上调表达，84％(42/50)为下调表达(P＜0．01)。APG表达与性别、AFP大小无关(P＞0．05)，但与肿瘤大小(P＜0．05)、HBsAg(P＜0．01)、分化程度(P＜0．01)、包膜侵犯(P＜0．01)、临床分期(P＜0．01)、血管癌栓(P＜0．01)、癌旁卫星灶(P＜0．01)、包膜侵犯(P＜0．01)、临床分期(P＜0．01)、血管癌栓(P＜0．01)、癌旁卫星灶(P＜0．01)、Ki—67蛋白表达(P＜0．01)、细胞凋亡(P＜0．05)、P53蛋白表达(P＜0．01)密切相关。APG是肝癌凋亡相关的下调基因，其表达与肝癌的某些临床病理特征有关。     

HPV16地方分离株E6基因的克隆与原核表达研究

目的克隆人乳头瘤病毒（HPV16E6）基因并在大肠埃希菌中表达，对表达产物进行鉴定。方法用PCR方法从克隆质粒pUC19-HPV16E6E7中扩增HPV16E6基因，采用定向克隆构建pQE30-HPV16E6原核表达质粒．利用酶切和序列测定鉴定重组质粒。将pQE30-HPV16E6转化大肠埃希菌BL21（DE3），建立重组工程菌pQE30-HPV16E6／BL21（DE3）。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，SDS—PAGE分析蛋白表达情况，利用Western blot鉴定抗原特异性。结果PCR产物470bp，重组质粒经酶切和序列测定证实构建正确。SDS—PAGE分析在18×10^3处有蛋白条带出现，与预期一致。Western blot分析证实目的条带与HPV16E6抗体有特异性反应。结论成功构建了HPV16E6基因的基因工程菌株，能高效表达E6蛋白，表达蛋白具有良好的免疫反应性。