SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的 建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,研究BMSCs的生物学特性,为后续细胞移植和基因治疗提供理想的种子细胞.方法 全骨髓贴壁培养法分离大鼠BMSCs,体外培养和连续传代,在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化,利用MTT法测定其生长曲线,流式细胞仪鉴定其表面抗原,成...     

成体大鼠的骨髓间充质干细胞分离和体外培养的初步研究

目的：探讨成体大鼠的骨髓间充质干细胞（MSCs)的分离，体外培养，为其应用提供实验依据，方法：无菌条件下抽取大鼠股骨骨髓，Percoll梯度分离液离心分离，在含12％生牛血清的DMEM中，37％，5％，CO2饱和湿度下常规培养，对分离的细胞行碱性磷酸酶（AKP）的检测，结果：取较高纯度的成体大鼠骨髓MSCs，并保持细胞的活性，成体大鼠骨髓MSCs在体外培养中，为贴壁生长的单个核球形细胞，培养3－4d后开始大量增殖，并形成形态均一的细胞增殖集落。对分离后所获细胞进行AKP染色为强阳性。结论：采用Percoll梯度分离液进行分离心分离，可获得较高的MSCs，是实用，便捷的可行的方法，而且在体外培养的条件下能大量增殖，形成态均一的细胞集落，可以成为进一步进行细胞扩增或其它实际应用的基础。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探索体外分离培养人骨髓间充质干细胞的方法并观察基本生长特性，为今后研究其分化提供实验依据。方法：采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离人骨髓间充质干细胞，体外培养扩增，在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，细胞计数法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期。结果：密度梯度离心法可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞，细胞形态呈圆形、三角形或棒杆状，48h后细胞开始贴壁，4-5d可见有集落形成，2w左右可达到基本融合。生长曲线示骨髓间充质干细胞增殖活跃，流式细胞仪检测显示约有86％的细胞处于G0、G1期。结论：人骨髓间充质干细胞在体外培养条件下生长性状稳定，增殖能力较强，可作为肝组织工程中理想的种子细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的改进

目的：对人骨髓间充质干细胞(Mesenchvmal stem cells，MSCs)的体外分离纯化、培养扩增方法的改进，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础方法：抽取人骨髓细胞，采用密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化，并传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，流式细胞仪检测其表面抗原表达。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，MSCs在含胎牛血清的L—DMEM培养液中生长性状相对稳定，细胞基本呈成纤维细胞样生长，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，贴壁存活率高，表达CD29、CD44、CD105、CD166。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，在含胎牛血清的L-DMFM培养液中，细胞稳定扩增。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

目的 观察体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性。方法 通过贴壁法培养、鉴定大鼠骨髓MSCs，观察其生长规律及光镜结构特点。结果 大鼠MSCs 7代以前增殖速度较快，细胞接种后1～2d为滞留期，3d后达对数生长期，第6天进入平台期。免疫组织化学染色显示MSCs表达CI）44，不表达CD45；光镜下可见MSCs呈梭形、纺锤形和多角形，核居中，有1～2个核仁。结论 培养的细胞为骨髓MSCs；在体外培养条件下细胞生长性状稳定，可作为组织工程的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及表型和功能特点

目的 建立体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的方法，探讨其表型和功能特点。方法 用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，传代扩增，测定生长曲线，通过形态学观察，细胞化学及免疫细胞化学法分析大鼠骨髓MSCs的表型和功能特点。结果 MSCs属骨髓中单个核细胞，密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，在含10％小牛血清的L-DMEM中，1、3、5代细胞生长曲线基本相同，增殖快，每传代一次细胞约增加2．2倍。细胞呈均一的成纤维细胞样，表达CD44、CD54、纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)。加入地塞米松(Dex 10^-8mol／L)、β-甘油磷酸钠(β-GP 10mmol／L)、抗坏血酸(AA50μg／ml)可诱导MSCs分化为成骨细胞，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性增高，形成矿化结节。结论 所分离、培养的细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点，建立了体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离培养的适宜条件。方法取1、2、4个月大鼠各6只,分离MSCs,以0.5×105/m l、1×105/m l、2×105/m l密度接种,通过倒置显微镜观察MSCs增殖情况,绘制生长曲线。流式细胞仪观察细胞周期并绘制细胞周期图。结果利用贴壁法成功培养出MSCs并能使之分裂增殖,但随着传代次数的增加,增殖能力有所下降。在培养过程中大鼠年龄要控制在2月以内,接种密度以1×105/m l适宜。结论贴壁培养法是一种简便易行的培养MSCs方法,操作简单,成功率高,可以作为培养SD大鼠MSCs常规方法。     

骨髓间充质干细胞的分离与培养

目的　摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件 ,并观察其部分生物学活性。方法　采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法 ,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响 ,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果　以选用 4～ 2 4h贴壁的有核细胞 ,加入 5 %～ 1 0 %胎牛血清、种植密度(4～ 8)× 1 0 4个 /ml的培养条件为最适宜细胞生长 ;在此条件下 ,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性 ;其形态呈梭状 ,具有快速增殖的能力 ;培养细胞在 3～ 4d进入对数生长期 ,随后进入平台期 ,分裂相细胞明显减少 ;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状 ,2～1 0代的细胞呈均质状 ;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论　建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件 ,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性 ,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础     

大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究

目的研究在体外培养和纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。方法采用改良全骨髓贴壁方法,分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs,镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD45和CD29的表达情况。结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24 h后大部分细胞均贴壁。8～10 d可达80%～90%融合,纯化后传代周期为6～8 d。流式细胞术鉴定表明CD45阴性,CD29阳性。结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法。     

不同分离液和培养基对骨髓间充质干细胞原代培养的影响研究

目的：试图分剐用不同抽取骨髓方法、不同分离液和培养基，来筛选提高收集骨髓MSCs数量的因素。方法：取大鼠左、右肢长骨近端红骨髓为实验材料，分两组。用穿抽骨髓同时破坏部分红骨髓、Ficoll-paque分离液和IMDM培养基为实验组：穿抽骨髓不再破坏红骨髓，Percoll分离液和DMEM培养基为对照组。分别计数不同抽取骨髓方法的单个核细胞数量。计算不同分离液细胞密度，以及不同培养基的细胞贴壁率、铺展面积的平均值。结果：实验组的各项检测指标明显优于时照组。结论：穿抽破坏骨髓结构的内容物，Ficoll-paque分离液以及IMDM培养基的原代培养，都能分剐提高收集单个核细胞数量。     

胎儿骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的从胎儿骨髓中分离培养纯化骨髓间充质干细胞(MSC),并进行细胞表面标志的检测,探讨MSC的培养方法。方法采用全骨髓培养、贴壁筛选法分离培养MSC,采用差速贴壁培养方法纯化细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面标志,并观察不同方法处理的培养界面对细胞贴壁和生长的影响。结果通过分离纯化培养,光镜下细胞形态以长梭形、不规则多角形为主;IV型胶原包被和Co60照射(照射量6GY)处理的培养瓶更利于MSC的贴壁、生长;流式细胞仪检测结果显示CD44( )、Stro-1( )、CD14(-)、CD34(-)、CD45(-)、CD11b(-)。结论采用贴壁筛选法和差速贴壁法结合可获得较高纯度的MSC,并且细胞生长良好,在体外具有较强的扩增能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离和培养扩增的方法。研究MSCs的生物学特性，为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。方法通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs，测定其接种贴壁率；在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用MTT法测定MSCs生长曲线；并应用流式细胞术测定细胞周期和表面标记物。结果MSCs体外培养生长状况良好，具有活跃的增殖能力，接种10h后贴壁率为96％以上；细胞周期显示有91．4％处于G0／Gl期；培养的MSCs阳性表达CD29、CD44，阴性表达CD34、CD45。结论在实验条件下，体外培养8代以前的MSCs生长稳定，增殖较快，细胞周期表现出较早期细胞特点，可作为组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学性状

目的建立一种体外分离纯化和培养扩增人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,并探讨其生物学特性,为MSCs的进一步应用研究提供数据.方法抽取人骨髓后用Percoll分离液经密度梯度离心法分离得到单个核细胞,以105个细胞/cm2密度接种,培养液为含10%胎牛血清的L-DMEM.倒置相差显微镜及吉姆萨-瑞氏染色观察其形态,MTT法测其生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期及表面标记物.结果培养的MSCs 12h后换液,有部分细胞贴壁生长,4～5d可见有集落形成,14～20d左右可达到80%～90%融合,倒置相差显微镜及吉姆萨-瑞氏染色可见细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等,生长曲线图显示MSCs增殖活跃,流式细胞仪检测显示约有86%的细胞处于G0、G1期,表面标记物中CD14、CD34、VLA-1、CD45和HLA-DR阴性,而CD44、CD105和CD29阳性.结论成功地建立了一种分离培养人骨髓MSCs的方法,获得的细胞形态多样、增殖稳定.     

大鼠骨髓间充质干细胞在淋巴细胞增殖中的免疫调节作用

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BM MSCs)在体外对淋巴细胞增殖的影响及其作用机制。方法:分离和鉴定大鼠MSCs,与淋巴细胞、BRL、刀豆蛋白(ConA)建立共培养体系,混合培养0h、24h和48h后,用ELISA方法检测上清中TNF-α、TGF-β和IL-10的分泌量,MTT方法检测淋巴细胞数目变化,流式细胞仪检测调节T细胞(Treg)的含量变化。结果:加入MSCs后TNF-α分泌量降低,TGF-β和IL-10分泌量升高,OD值明显低于未加MSCs组的对照组(P<0.05),Treg含量升高。结论:骨髓MSCs在单独存在以及与BRL同时存在时均对淋巴细胞的增殖具有抑制作用,并且作用程度随时间变化不明显,其中IL-10、TGF-β以及Treg参与了这种免疫抑制过程。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养与扩增实验研究

目的探讨脐血来源的人间充质干细胞（HMSCs）在体外分离培养与扩增的可行性。方法在无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经复合枸橼酸钠抗凝,用相对密度为1．077g／L的Ficoll淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以30％胎牛血清进行培养和扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。结果来源于人脐血的单个核细胞接种于特定培养基后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,经传几代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs。流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达GD14、CD19,强表达CD105、CD44。结论来源于人脐血的MSCs在体外可以分离培养、扩增,为MSCs的进一步研究奠定基础。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定和体外标记

目的：探讨分离、体外培养、鉴定及体外标记兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stemcells,MSCs）的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法：选择健康幼龄新西兰大耳白兔,于双侧髂后上嵴及胫骨上端内侧部行骨髓穿刺提取骨髓。采用全骨髓培养法（直接贴壁法）分离培养MSCs,对第2、3、4、5、6代MSCs应用MTT法测定生长曲线,分析MSCs的生长规律。对MSCs进行形态学观察,通过流式细胞术对CD34、CD44、CD45、CD105这4种MSCs表面抗原进行鉴定,证明所培养的细胞为MSCs。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU）体外标记兔MSCs,检测其标记阳性率。结果：全骨髓培养法培养的原代MSCs接种4天后可以被观察到,形态均匀成梭形,生长增殖迅速,符合MSCs生长的特性,7～8d MSCs融合接近80%,传代培养生长良好。MSCs生长曲线呈S型,由生长曲线分析可知,MSCs在培养第4～8d为高速生长期,MSCs在第3～5代生长最为旺盛。经流式细胞术鉴定,CD34（-）、CD45（-）、CD44（＋）、CD105（＋）,证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU体外标记兔MSCs的阳性率达到85%～90%。结论：应用本实验方法,可以分离、纯化培养兔骨髓间充质干细胞且操作简便,效率高,经济实用。所培养的MSCs体外生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、可连续传代,可用于MSCs功能及应用的进一步研究。应用BrdU体外标记兔MSCs是安全可靠的。     

体外分离和扩增兔骨髓间质干细胞及其生物学特性研究

目的　探讨体外培养兔骨髓间质干细胞 (MSC)生物学及培养方法 ,为组织工程研究奠定实验基础。方法　选用新西兰大白兔 ,于胫骨近端或股骨抽取骨髓 ,分离 ,扩增骨髓干细胞 ,原代培养后 ,将细胞按 1∶1比例传代培养 ,并用传 1～ 5代细胞按 1× 10 4种植于 96孔板内 ,绘制生长曲线 ,贴壁率 ,并加入不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) ,测其促进MSC的增殖情况。结果　原代骨髓基质细胞生长状态良好 ,传代至第 5代仍保持干细胞形态特点 ,且生长曲线基本相同 ,bFGF可明显促进MSC的增殖 ,呈量效关系。结论　应用本实验方法 ,可无创获取兔MSC ,体外稳定扩增 ,生长速度快 ,表明兔MSC可作为骨 /软骨组织工程的种子细胞。