目的 构建S100A4稳定高表达的鼻咽癌细胞株,研究S100A4与鼻咽癌侵袭转移关系。方法 PCR方法扩增S100A4片段,将产物插入pCMV载体,将重组质粒及其空白质粒分别转染到鼻咽癌细胞CNE2;MTT法绘制细胞生长曲线,Western blot检测S100A4、E-cadherin、Fibronectin、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达;Transwell实验检测细胞侵袭转移能力变化。结果 成功构建了S100A4稳定高表达的重组细胞株;细胞生长曲线表明S100A4稳定高表达的重组细胞株生长较快;S100A4稳定高表达的重组细胞株中E-cadherin、Fibronectin低表达而MMP2、MMP9高表达;Transwell实验发现S100A4稳定高表达的重组细胞株的侵袭细胞计数明显高于空白载体转染组和未转染组(P >0.01)。结论 S100A4能调控鼻咽癌上皮-间质转化(EMT)过程,并上调MMP2、MMP9表达而促进鼻咽癌细胞侵袭和转移。
相似文献目的 研究MicroRNA-219-5p(miR-219-5p)靶向E-钙黏蛋白(E-Cadherin)调控上皮间质转化(EMT)抑制肝癌细胞侵袭转移的分子机制。方法 首先通过生物信息学方法,寻找与E-Cadherin结合特异性最好、稳定性强的miRNAs。在30例肝癌组织和20例癌旁肝组织中,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测E-Cadherin的表达水平;实时荧光定量PCR检测(qRT-PCR)miR-219-5p表达,分析两者之间的相关性。在高转移和低转移的肝癌细胞株中,qRT-PCR检测miR-219-5p表达,Western blot检测E-Cadherin、N-cadherin表达。采用Lipofectamine 2000将miR-219-5p 模拟子(mimic)、抑制子(inhibitor)、阴性对照组(negative contral)转染到肝癌HepG2细胞系,qRT-PCR检测miR-219-5p表达,Western blot检测E-Cadherin、N-cadherin的表达;Transwell方法检测miR-219-5p表达改变对肝癌细胞侵袭转移能力的影响。结果 生物信息学发现miR-219-5p与E-Cadherin结合最稳定,且特异性最好。肝癌组织中miR-219-5p低表达、E-Cadherin高表达,而癌旁组织中miR-219-5p高表达、E-Cadherin低表达。高转移细胞株中miR-219-5p高表达、E-Cadherin低表达而N-cadherin高表达,在低转移细胞株中miR-219-5p低表达、E-Cadherin高表达而N-cadherin低表达(P <0.05)。miR-219-5p水平表达增高,引起E-Cadherin表达下调,N-cadherin高表达;miR-219-5p表达下调,可引起E-Cadherin表达上调,N-cadherin低表达(P <0.05);HepG2-miR-219-5p 模拟子细胞株中侵袭细胞计数为(24±3)个/高倍镜视野,明显低于对照组细胞株(P <0.05)。结论 miRNA-219-5p可通过靶向结合E-Cadherin,调控EMT信号通路,抑制肝癌细胞的侵袭转移。
相似文献目的 研究上皮-间质转化(EMT)相关的微小RNA(microRNA,以下简称miRNA)-221在结直肠癌患者中的表达水平,并探索其对结直肠癌细胞迁移水平的影响。方法 选取该院40例结直肠癌患者为研究组,选取同期体检的40例健康人群为对照组。采用实时定量RT-PCR法检测结直肠癌患者癌组织以及癌旁组织中miRNA-221表达水平,同时对比结直肠癌患者及正常人血浆中miRNA-221表达水平。对结直肠细胞采用miRNA-221的mimic及inhibitor分别高、低表达miRNA-221后,采用transwell法分别检测细胞的侵袭水平以及EMT相关蛋白表达。结果 miRNA-221在直肠癌组织的表达水平显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(P <0.05);miRNA-221在直肠癌患者血浆中的表达水平显著高于健康对照人群,差异有统计学意义(P <0.05)。干扰结直肠癌HT-29细胞株中miRNA-221后,结直肠癌细胞迁移能力显著降低(均P <0.05),且细胞中EMT相关的上皮钙黏蛋白(E-cad)的表达水平降低;而过表达HT-29细胞株中miRNA-221,结直肠癌细胞迁移能力显著增加,且细胞中EMT相关的上皮钙黏蛋白(E-cad)的表达水平增加。结论 结直肠癌患者高表达的miRNA-221通过促进结直肠癌细胞的迁移水平来参与结直肠癌发生发展的进程。
相似文献目的 探讨乙型肝炎病毒蛋白诱导白细胞介素32(IL-32)的表达以及临床意义。方法 用Lipofectamine 2000 TM介导转染HepG2细胞。转染48 h后,采用聚合酶链反应(RT-PCR),蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测HepG2细胞中IL-32的mRNA及蛋白的表达量。结果 RT-PCR结果显示转染HBV的HepG2细胞中IL-32 mRNA的表达量比转染空载体(未转染)的细胞中IL-32 mRNA高2.3倍;Western blot结果显示与空载体转染的HepG2细胞比较,转染pIRES2-HBV-EGFP的HepG2细胞中IL-32蛋白质表达增高,且差异有统计学意义(P <0.05)。结论 HBV促进IL-32蛋白的表达,从而证实乙型肝炎的严重程度与IL-32的表达有关。
相似文献摘要:目的 研究瑞舒伐他汀是否可以抑制大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化及其机制。方法 SD大鼠主动脉VSMCs原代细胞培养鉴定,取4~7代细胞用于实验。用不同浓度的瑞舒伐他汀干预VSMCs,Western blot检测各组标本中骨骼肌肌动蛋白(SM-actin)、平滑肌22α(SM-22α)、滑肌肌球蛋白重链(SM- MHC)、骨桥蛋白(OPN)的表达,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,划痕试验观察细胞迁移情况。通过免疫组织化学法(ICC)检测SM-actin的表达从而观察VSMC的形态。转染过表达KLF-4或空白对照质粒至离体培养的VSMCs中,用瑞舒伐他汀干预,并采用上述实验方法检测VSMCs表型转化情况。结果 MTT结果显示,与对照组比较,瑞舒伐他汀组VSMCs增殖能力降低,差异有统计学意义(P <0.05)。划痕试验结果显示,与对照组比较,他汀组VSMCs迁移减少,差异有统计学意义(P <0.05)。Western blot检测显示,与对照组比较,他汀组VSMCs中SM-22α、SM-MHC、OPN表达增多,差异有统计学意义(P <0.05)。ICC结果显示,与对照组VSMCs的细胞形态比较,他汀组VSMCs形态变细、变长。转染KLF-4过表达质粒后,与对照组比较,转染KLF-4过表达质粒可以增加VSMCs的增殖和迁移,差异有统计学意义(P <0.05),逆转他汀对VSMCs表型转化有抑制作用。结论 瑞舒伐他汀通过下调KLF-4,抑制大鼠主动脉VSMCs表型转化。
相似文献目的 探讨microRNA-93(miR-93)在宫颈癌组织中的表达及其对宫颈癌细胞生物学行为的影响。方法 收集2014年1月-2014年7月中南大学湘雅医院有完整病历资料的41例宫颈癌患者组织标本及对应癌旁组织,实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测宫颈癌组织中miR-93表达水平;采用脂质体转染法将miR-93模拟片段(mimic)转染入宫颈癌Hela细胞,恢复细胞内miR-93表达;活细胞计数试剂盒(CCK-8)和流式细胞术检测miR-93对宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响;Transwell小室法检测其对Hela细胞迁移及侵袭能力的影响;Western blot检测Hela细胞中上皮生长因子受体(EGFR)及其下游蛋白的表达量变化。结果 41例宫颈癌患者肿瘤组织中miR-93表达量(0.048±0.013)低于癌旁组织(0.113±0.025),差异有统计学意义(P =0.026);转染miR-93模拟片段后,宫颈癌Hela细胞中miR-93表达恢复;与对照组和空白组比较,实验组宫颈癌细胞增殖能力下降(P =0.004),早期凋亡比例增加(P =0.032),侵袭(P =0.003)和迁移能力下降(P =0.003);过表达miR-93的Hela细胞EGFR及下游的p-AKT表达下降(P =0.005),而总AKT蛋白无明显变化(P =0.372)。结论 miR-93在宫颈癌组织中的表达量下降,恢复其在宫颈癌细胞中的表达能够明显抑制其细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,其机制部分与miR-93抑制宫颈癌细胞EGFR/AKT信号通路活性有关。
相似文献目的 构建一种可以实现丁型肝炎病毒(HDV)复制包装的HDV转座子载体。方法 采用分子克隆方法构建含HDV复制子和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)表达框的转座子(PB)载体PB126I3,将构建好的载体转染HuH-7细胞,转染48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,转染48 h后收集细胞上清用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HBsAg的表达,质粒转染细胞8.5 d后提取病毒用逆转录荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测HDV核糖核酸(RNA)的含量;同时细胞上清病毒浓缩后感染HBV受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(Na+/NTCP)稳定转染的HepG2.N9细胞系并于感染后第7天用免疫荧光检测细胞内HDVδ抗原的表达。结果 HDV复制包装载体PB126I3瞬时转染HuH-7后细胞上清可检测到HBsAg的表达和较高滴度的HDV颗粒,并且该病毒颗粒感染HepG2.N9细胞7 d后细胞内可检测到HDVδ抗原。结论 HDV复制包装转座子载体构建成功,为未来HDV的大规模复制包装以及尝试建立HDV稳定转染细胞系提供前期基础。
相似文献目的 探讨RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响。方法 分别构建3种靶向c-Met基因的短发卡RNA(shRNA)序列,以脂质体转染的方式导入人脑胶质瘤U251细胞,并筛选出稳定表达的细胞株。采用PCR和Western blot检测c-Met-shRNA转染后U251细胞c-Met的表达情况,以筛选出可有效沉默c-Met基因的shRNA。c-Met基因沉默后,采用MTT法和流式细胞术检测U521细胞增殖情况,采用Transwell法和细胞划痕实验检测U251细胞侵袭和迁移情况,采用裸鼠荷瘤实验研究U251细胞体内成瘤性。结果 成功构建可有效沉默c-Met基因的c-Met-shRNA1。沉默c-Met后,c-Met mRNA以及蛋白的表达均显著下降,差异有统计学意义(P <0.05);而且可明显抑制U251细胞的增殖、侵袭、迁移以及体内成瘤能力,差异有统计学意义(P <0.05)。结论 RNAi沉默c-Met基因可有效抑制人脑胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭、迁移以及体内成瘤能力。
相似文献摘要:目的 探讨在体外诱导分化肺侧群细胞(SP)的特性。方法 取小鼠肺组织,流式细胞术分选小鼠白细胞分化抗原(CD)45-/CD31+肺SP;免疫荧光检测分选肺SP三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)的表达;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺SP中ABCG2、酪氨酸激酶2(Tie2)及血管性血友病因子(vWF)的表达。细胞体外分化诱导14 d后,免疫荧光检测细胞vWF的表达;RT-PCR检测分化诱导前后细胞中ABCG2和vWF的表达。结果 流式细胞术成功分选出CD45-/CD31+肺SP细胞,免疫荧光检测其表达ABCG2;RT-PCR检测SP表达ABCG2和Tie2,不表达vWF。主群细胞表达vWF;分化诱导前的肺SP表达ABCG2;分化诱导后的肺SP表达vWF。结论 CD45-/CD31+肺SP是血管内皮细胞的祖细胞,具有干细胞分化特性。在体外培养可分化为血管内皮细胞。
相似文献目的 探究过表达胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)对人乳腺癌细胞系-7(MCF-7)增殖的影响及其机制。方法 采用LipofectamineTM 2000将pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7质粒或pIRES2-ZsGreen1空白质粒转染进MCF-7乳腺癌细胞,并用荧光显微镜鉴定细胞转染;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)对转染48 h后IGFBP7蛋白进行定量;细胞凋亡实验检测转染24、48和72 h后各组细胞增殖情况;Western bolt检测转染48 h后各组细胞(蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白)(AKT/mTOR)信号通路相关蛋白的表达。结果 Real-time PCR的检测结果提示经过IGFBP7转染的细胞IGFBP7 mRNA表达水平明显升高;细胞凋亡实验结果发现,与空白处理组和空白质粒转染组比较,IGFBP7过表达组细胞增殖能力明显降低;Western bolt检测结果发现,AKT蛋白的磷酸化水平明显下降,且其下游的mTOR表达明显下降(P <0.05)。结论 IGFBP7过表达对MCF-7乳腺癌细胞的增殖具有抑制效果,可能是通过对AKT/mTOR信号通路的抑制达到对MCF-7的抑制。
相似文献目的 研究Twist蛋白在结直肠癌中的表达水平,其对结直肠癌细胞的增殖以及侵袭能力的影响,并探讨其促进癌症发展具体的机制。方法 经结肠镜活检取20例患者组织和20例正常人的标本,采用实时定量PCR的方法检测了Twist的mRNA表达水平。采用脂质转染法对结直肠癌细胞系CT-26细胞进行RNA干扰,采用CCK-8法及transwell法观察干扰Twist后对结直肠癌细胞的增殖以及侵袭能力的影响;采用RT-PCR以及Western blot检测了CT-26细胞中MMP-9的mRNA及蛋白水平。结果 Twist在结直肠癌组织中的mRNA水平显著高于对应癌旁组织以及对照组(P <0.05);在伴有淋巴结转移的癌组织中Twist mRNA的表达水平显著高于无淋巴结转移的组织(P <0.05);与转染对照组比较,Twist siRNA转染的CT-26细胞增殖水平及迁徙能力均显著降低(P <0.05);干扰Twist的CT-26细胞能够显著降低金属蛋白酶MMP-9 mRNA及蛋白的水平。结论 Twist蛋白能够增加结直肠癌癌细胞的增殖及迁徙能力,其影响机制可能与金属蛋白酶MMP-9有关。
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