目的 探讨乙型肝炎病毒蛋白诱导白细胞介素32（IL-32）的表达以及临床意义。方法 用Lipofectamine 2000 TM介导转染HepG2细胞。转染48 h后,采用聚合酶链反应（RT-PCR）,蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测HepG2细胞中IL-32的mRNA及蛋白的表达量。结果 RT-PCR结果显示转染HBV的HepG2细胞中IL-32 mRNA的表达量比转染空载体（未转染）的细胞中IL-32 mRNA高2.3倍;Western blot结果显示与空载体转染的HepG2细胞比较,转染pIRES2-HBV-EGFP的HepG2细胞中IL-32蛋白质表达增高,且差异有统计学意义（P <0.05）。结论 HBV促进IL-32蛋白的表达,从而证实乙型肝炎的严重程度与IL-32的表达有关。
相似文献目的 利用慢病毒介导构建磷酸二酯酶7A（PDE7A）基因沉默人单核巨噬细胞（THP-1）株,并分析沉默细胞株的三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）的表达变化。方法 以PDE7A基因为靶点,设计合成3段shRNA片段,与慢病毒载体PmiRzip连接,构建重组质粒。测序鉴定后进行病毒包装,感染THP-1细胞,实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）进行分析,确定最佳干扰片段。嘌呤霉素筛选得到PDE7A基因沉默稳转细胞株。qPCR和Western blot检测鉴定所构建的细胞株,将其诱导成为泡沫细胞后鉴定ABCA1基因的表达。结果 转染shRNA1、shRNA2、shRNA3细胞的PDE7A相对表达量分别为（0.480±0.028）、（0.561±0.016）和（0.377±0.013）,故选择shRNA3作为干扰PDE7A基因的最佳片段。采用1.4 g/L嘌呤霉素成功筛选出PDE7A沉默细胞株,qPCR和Western blot检测PDE7A基因的干扰效率,其抑制效率>70%。将其诱导成巨噬泡沫细胞后,Western blot检测显示,ABCA1的表达量增加40%。结论 成功构建PDE7A shRNA慢病毒干扰载体,并筛选出PDE7A基因沉默的THP-1细胞株,且ABCA1的表达量增加。
相似文献目的 探讨EBERs对鼻咽癌转移的作用及其机制。方法 在鼻咽癌细胞中转染EBERs,荧光定量PCR（RT-PCR）检测细胞中转移相关指标（如MMP）的相对表达量,同时 Transwell检测EBERs对鼻咽癌细胞迁移能力的影响。构建敲除EBERs的BAC-EBV（p2089）质粒,转染鼻咽癌细胞,检测细胞的转移能力。转染EBERs后Western blot检测上皮间质转化（EMT）相关指标,免疫荧光检测ZO-1的表达。结果 鼻咽癌细胞转染EBERs质粒或p2089质粒后,RT-PCR检测发现转移相关指标表达升高,Transwell检测结果显示细胞迁移能力增强,而在干扰EBERs或转染敲除EBERs的p2089质粒后,转移能力减弱。转染EBERs后E-cadherin表达降低,Vimentin升高,同时免疫荧光检测发现ZO-1表达降低。结论 EBERs可能通过促进EMT高表达而促进鼻咽癌的转移。
相似文献摘要：目的 比较慢病毒与电转染两种技术转染小鼠原代神经干细胞的优劣，获得神经干细胞高效转染的方法。方法 从C57BL/6小鼠脑组织中提取神经干细胞，进行原代培养；分别进行慢病毒转染和电转染，通过观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达，比较两种转染方法的转染效果，并用噻唑蓝（MTT）法计算相对存活率，比较两种方法转染后对细胞的影响。结果 慢病毒与电转染两种转染技术转染神经干细胞48 h后，慢病毒的转染率为（77.6±6.6）%，高于电转染法转染率[（29.2±4.8）%]，两者比较，差异有统计学意义（P <0.05）；转染72 h后，慢病毒转染的细胞荧光表达量为（60.0±3.6）%，电转染细胞的荧光表达量仅剩（12.8±2.4）%；MTT法结果显示，电转染组细胞相对存活率为（75.8±2.3）%，慢病毒转染组细胞相对存活率为（70.1±1.4）%，两者比较，差异无统计学意义（P >0.05）。结论 对于原代神经干细胞转染，慢病毒转染法比电转染法具有更高的转染效率及长久稳定性，转染后细胞存活率与电转染法接近，因此慢病毒转染法更能满足研究者的需求。
相似文献摘要：目的 构建含人干细胞白血病（SCL）基因的重组慢病毒载体,并转染体外培养的Cajal样间质细胞（ICC）,为进一步利用慢病毒表达载体行体内实验奠定基础。方法 通过聚合酶链反应（PCR）将人SCL基质粒内的遗传物质扩增,与慢病毒载体质粒GV287-EGFP结合,构建重组质粒GV287-EGFP/SCL,通过Western blot检测及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。体外分离、培养及鉴定ICC,重组慢病毒载体以感染复数（MOI）值为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0时,分别转染ICC,通过激光共聚焦显微镜观察,计算不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。重组慢病毒载体以最佳MOI值感染ICC作为实验组,以空载体转染的ICC（空载体组）及未转染的ICC（空白组）作为对照,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测SCL基因在ICC中的表达。结果 经Western blot检测及基因测序鉴定SCL重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染ICC,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光。MOI为10时转染效果最佳,转染效率>85%;RT-PCR结果表明,实验组SCL基因的表达量高于空载体组和空白组。结论 成功制备人SCL基因重组慢病毒载体,并能高效转染ICC,介导SCL基因在ICC中表达。
相似文献目的 探讨microRNA-10b（miR-10b）及其靶基因同源异性盒基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及转染miR-10b对肝癌细胞侵袭性能力的影响。方法 分析HOXD10基因在3种肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721中的基础表达量,筛选出HOXD10基础表达量高的HepG2作为后续研究对象。设计合成外源性miR-10b序列,用脂质体瞬时转染肝癌细胞株,设置miR-10b转染组、无关序列转染组（阴性对照组）和未处理组（对照组）。用RT-PCR及Western blot检测肝癌细胞转染miR-10b后HOXD10基因及蛋白表达量的变化,细胞侵袭实验研究转染miR-10b对肝癌细胞侵袭能力。结果 在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表达量2-ΔΔCT分别是（1.24±0.23）、（1.00±0.02）,P >0.05差异无统计学意义。在蛋白分析HepG2细胞灰度计算值是值分别是653.492和1 968.742,蛋白水平表达降低。HOXD10基因在肝癌细胞株HepG2的表达量显著高于Huh7和SMMC-7721;miR-10b成功转染HepG2后,HOXD10基因表达水平与对照组比较无明显变化,但HOXD10蛋白表达量与对照组比较下降及侵袭性也增强。结论 miR-10b可能通过抑制靶基因HOXD10表达发挥作用,促进肝癌细胞的侵袭。
相似文献目的 探讨过氧化物酶1（Prx 1）在肝癌形成和恶性进展中的作用。方法 蛋白质印迹法（Western blot）检测远癌肝组织和近癌肝组织中Prx 1、pAkt及Akt表达差异。肝细胞饥饿培养24 h后,10 ng/ml表皮生长因子（EGF）处理10 min,提取总蛋白,Western blot检测Prx 1、pAkt、不同位点磷酸化表皮生长因子受体（EGFR）和总EGFR。Western blot检测检测未处理组、转染无义shRNA组及转染Prx 1 shRNA组HepG2细胞中Prx 1蛋白的表达。DCFH-DA法检测3种HepG2细胞中活性氧簇总量。转染无义shRNA组及转染Prx 1 shRNA组HepG2细胞皮下注射至SCID小鼠,注射后每周测量1次皮下肿瘤体积。Western blot检测两组小鼠皮下肿瘤组织中Prx 1和pAkt的表达情况。结果 与正常肝细胞比较,Prx 1在肝转化细胞中表达升高。Prx 1增强了EGF介导的EGFR和Akt激活。Prx 1表达沉默抑制了HepG2体内成瘤能力。减少HepG2皮下移植瘤的肝转移。Prx 1表达沉默还抑制了Akt体内激活。结论 Prx 1具有调控人肝细胞中EGFR介导信号通路的潜在作用。Prx 1能够通过EGFR-Akt信号通路介导细胞正常至异常转化、肿瘤形成及转移
相似文献目的 探究过表达胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）对人乳腺癌细胞系-7（MCF-7）增殖的影响及其机制。方法 采用LipofectamineTM 2000将pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7质粒或pIRES2-ZsGreen1空白质粒转染进MCF-7乳腺癌细胞,并用荧光显微镜鉴定细胞转染;实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）对转染48 h后IGFBP7蛋白进行定量;细胞凋亡实验检测转染24、48和72 h后各组细胞增殖情况;Western bolt检测转染48 h后各组细胞（蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白）（AKT/mTOR）信号通路相关蛋白的表达。结果 Real-time PCR的检测结果提示经过IGFBP7转染的细胞IGFBP7 mRNA表达水平明显升高;细胞凋亡实验结果发现,与空白处理组和空白质粒转染组比较,IGFBP7过表达组细胞增殖能力明显降低;Western bolt检测结果发现,AKT蛋白的磷酸化水平明显下降,且其下游的mTOR表达明显下降（P <0.05）。结论 IGFBP7过表达对MCF-7乳腺癌细胞的增殖具有抑制效果,可能是通过对AKT/mTOR信号通路的抑制达到对MCF-7的抑制。
相似文献目的 探讨长链非编码GATS对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响。方法 构建的人LncRNA-GATS- shRNA1～4慢病毒载体转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后,qPCR筛选出干扰效率为50.0%和54.0%的sh1组和sh3组,MTT法和Transwell实验分别检测转染后细胞增殖和侵袭能力;流式细胞术检测转染sh1组慢病毒后细胞周期分布及凋亡变化。结果 测序证实,LncRNA-GATS的shRNA寡聚核苷酸序列已被克隆到pLV-GATS载体;转染MDA-MB-231细胞后,与阴性对照组比较,sh1组和sh3组的乳腺癌细胞增殖和侵袭能力均降低（P <0.01）,以sh1组更显著;sh1组细胞周期被阻滞于S期（P <0.01）;细胞凋亡率无明显变化（P > 0.05）。结论 LncRNA-GATS可能下调乳腺癌细胞侵袭力,并通过抑制细胞周期进展降低细胞增殖能力。
相似文献目的 探讨长链非编码核糖核酸（lncRNA）牛磺酸上调基因1（TUG1）在乳腺浸润性导管癌（IDC）中的表达及其对乳腺癌细胞增殖及凋亡功能的影响。方法 筛选2013年1月~12月该院乳腺病科行手术切除并经病理检查证实为IDC患者的乳腺癌及对应癌旁组织40例。运用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测lncRNA-TUG1在IDC患者肿瘤及癌旁组织中的表达水平,整理分析lncRNA-TUG1表达与患者临床病例资料间的相关性;采用lncRNA-TUG1特异性siRNA转染人乳腺癌MCF-7细胞,采用CCK-8试验检测转染siRNA后MCF-7细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测转染后MCF-7细胞凋亡变化。采用qRT-PCR、Western-blot检测转染后P27表达变化。结果 lncRNA-TUG1在IDC组织中表达水平显著高于对应癌旁组织（t =4.273,P <0.001）,IDC组织中lncRNA-TUG1高表达与肿瘤直径增大（P =0.033）及高TNM分期（P = 0.045）显著相关;lncRNA-TUG1特异性siRNA转染MCF-7细胞后可显著抑制细胞增殖（P =0.041）并上调凋亡细胞比例（t =3.206,P =0.007）;qRT-PCR及Western-blot结果证实,沉默lncRNA-TUG1后可显著促进P27 mRNA及蛋白表达水平（P <0.001）。结论 lncRNA-TUG1在IDC组织中表达上调并与肿瘤恶性临床病理特征有关,lncRNA-TUG1可能通过下调抑癌基因P27的表达来促进IDC生长。
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