兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养.用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞,改良MTT法测定其生长曲线,NBT/BCIP染色法、P-对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力.结果 成骨诱导1～5 d,培养的细胞增殖旺盛,3～5 d即可融合成单层,随着诱导时间的延长,细胞增殖速度减慢,出现细胞聚集的现象,培养细胞逐渐汇合呈铺路石状,细胞形态变为胞体较小的立方形,继续诱导,可出现多角形成骨样细胞,胞外基质分泌逐渐增多,胶原堆积、钙盐沉积,10～12 d形成不透光矿化结节,ALP活性增高,茜素红染色阳性,表示BMSCs向成骨细胞分化.结论 兔BMSCs经体外分离、诱导培养,可以定向分化为成骨细胞.     

骨髓间充质干细胞诱导分化成骨细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞（MSCs）是干细胞领域的研究热点之一,体外培养为贴壁生长,表达多种表面标记物,可向骨、软骨、脂肪、成肌、神经等多种细胞定向分化,具有广阔的应用前景。近几年来,有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展,但仍有很多问题有待进一步解决。现就骨髓MSCs诱导分化成骨细胞的研究进展作简要综述。     

PDGF-BB诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 探讨血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的最佳干预时间及浓度,并鉴定其向成骨细胞分化的能力.方法 体外分离培养新西兰大白兔BMSCs原代细胞,选用3代细胞用于PDGF-BB干预实验.将筛选好的细胞接种于96孔培养板中,分为空白组:加DMEM完全培养基;对照组:BMSCs+...     

骨髓间充质干细胞建立的成骨细胞培养模型的研究

目的：为骨折骨缺损治疗的基础实验研究建立理想的细胞模型,观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外培养状态下的生长情况,对其向成骨细胞分化及分化能力进行研究.方法：采用全骨髓密度梯度离心法联合差速贴壁法从兔股骨骨髓中提取、分离、纯化BMSCs,取第3代BMSCs细胞分为两组进行培养,A组：为用含有诱导剂的低糖DMEM培养基的诱导培养组;B组：为常规培养组.倒置显微镜及HE染色观察记录各代次细胞形态等特征;CD44,CD90检测细胞表形,通过碱性磷酸酶（ALP）染色及标准化钙结节计数,鉴定细胞成骨活性.结果：兔骨髓间充质干细胞生长状态良好,培养7 d后各组细胞形态趋于一致,多呈长梭形,培养2 wk后对两组细胞进行ALP染色,可见A组细胞质内ALP染色阳性反应明显,B组染色显色弱.21 d时A组细胞茜素红染色后钙化结节数量多且较大,B组有少量钙结节形成,但较小.A组标准化钙结节计数显著高于B组差异具有显著统计学意义（P〈0.05）.结论：通过密度梯度离心法联合差速贴壁法所获得的BMSCs在常规培养或诱导培养时均可表现出成骨潜能,但诱导培养组的BMSCs的ALP活性更强,成骨能力更确切,可为骨组织工程远期实验研究提供理想的细胞模型.     

小寡核苷酸对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的：筛选具有促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化作用的小寡核苷酸（ODN）,探讨ODN对BMSCs向成骨细胞分化的影响。方法：取第3代BMSCs孵育24 h后进行成骨诱导,双盲法加入12条不同的ODN,PBS作为溶媒对照组,应用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ODN于不同工作浓度（4.0、 2.0、 1.0和 0.5 mg/L）、不同时间点（24、72和120 h）刺激经成骨诱导后的BMSCs内ALP的表达水平,筛选出具有促成骨分化作用的ODN。结果：与PBS溶媒对照组比较,ODN工作浓度为4.0和0.5 mg/L时,实验组与对照组ALP表达水平差异无显著性(P>0.05),ODN工作浓度为2.0和1.0 mg/L时,有2条ODN在不同时间点（24、72和120 h）均可促进BMSCs内ALP的表达（P<0.01）。结论：在12条不同的ODN中共筛选出2条具有促进BMSCs成骨分化作用的ODN,表明特定序列的ODN能够影响大鼠BMSCs向成骨细胞的分化。     

张应力对骨髓间充质干细胞骨向分化来源成骨细胞ICAM-1基因表达的影响

目的探讨正畸牙移动骨改建过程中成骨细胞调控破骨细胞分化成熟的机制．方法分离培养大鼠股骨骨髓问充质干细胞来源的成骨细胞,采用膜式动态张应力加载体系进行体外细胞加力,RT—PCR技术检测不同强度、不同性质、不同作用时间张应力对成骨细胞ICAM-1mRNA表达的影响．结果张应力刺激对成骨细胞ICAM-1mRNA的表达有明显抑制作用,强度越大抑制作用越强,（依次为静、动态5kPa组,静、动态3kPa组,静态1kPa组,对照组）;静态张应力抑制效应明显弱于动态张应力（静态3kPa、5kPa组分别弱于动态3kPa、5kPa组）ICAM-1 mRNA的表达在动态张应力作用后3h即显著降低,12h最低（降至未加力时的23％）,后有所回升但仍维持在-较低水平,具有时效性。结论机械张应力刺激通过抑制成骨细胞ICAM-1 mRNA的表达限制破骨细胞的分化成熟。     

诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞和内皮细胞分化

目的 探索体外诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向成骨细胞和内皮细胞分化形成成骨细胞及内皮细胞共存体系的潜能和条件.方法 采用密度梯度离心法分离培养hMSCs,采用含30 mg/L内皮细胞生长添加剂的内皮细胞诱导液诱导1周,然后更换为含1×10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、30 μg/mL维生素C的成骨细胞诱导液继续诱导7～14 d.诱导前以只加10% FBS的HDMEM培养基作为对照.采用流式细胞术检测细胞表面分子,通过倒置显微镜观察细胞形态学变化.向成骨细胞诱导14 d后,采用茜素红染色观察钙结节形成.结果 经流式细胞术检测,诱导前分离培养的hMSCs表达CD90、CD105和CD44,不表达内皮细胞表面标志CD34和CD133,也不表达HLA-DR.诱导14 d后,hMSCs表面标志CD90和CD105的表达下降(P＜0.05),成骨细胞表面标志CD44和HLA-DR及内皮细胞表面标志CD34和CD133增加(P＜0.05).诱导过程中原先长梭形的细胞缩短,细胞出现分层.hMSCs向成骨细胞诱导14 d后,茜素红染色显示有钙结节形成.结论 hMSCs先后经内皮细胞诱导液和成骨细胞诱导液诱导,可在体外向内皮细胞和成骨细胞定向分化,形成内皮细胞和成骨细胞共存体系.     

诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞和内皮细胞分化

目的 探索体外诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向成骨细胞和内皮细胞分化形成成骨细胞及内皮细胞共存体系的潜能和条件.方法 采用密度梯度离心法分离培养hMSCs,采用含30 mg/L内皮细胞生长添加剂的内皮细胞诱导液诱导1周,然后更换为含1×10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、30 μg/mL维生素C的成骨细胞诱导液继续诱导7～14 d.诱导前以只加10% FBS的HDMEM培养基作为对照.采用流式细胞术检测细胞表面分子,通过倒置显微镜观察细胞形态学变化.向成骨细胞诱导14 d后,采用茜素红染色观察钙结节形成.结果 经流式细胞术检测,诱导前分离培养的hMSCs表达CD90、CD105和CD44,不表达内皮细胞表面标志CD34和CD133,也不表达HLA-DR.诱导14 d后,hMSCs表面标志CD90和CD105的表达下降(P＜0.05),成骨细胞表面标志CD44和HLA-DR及内皮细胞表面标志CD34和CD133增加(P＜0.05).诱导过程中原先长梭形的细胞缩短,细胞出现分层.hMSCs向成骨细胞诱导14 d后,茜素红染色显示有钙结节形成.结论 hMSCs先后经内皮细胞诱导液和成骨细胞诱导液诱导,可在体外向内皮细胞和成骨细胞定向分化,形成内皮细胞和成骨细胞共存体系.     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学活性观察

目的建立兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养、扩增的方法，并进行生物学活性观察。方法穿刺抽取新西兰大耳白兔骨髓5ml，通过密度梯度离心法获取MSCs，体外贴壁培养、扩增、传代，倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况，描绘生长曲线。第2代细胞用矿化液连续培养后，进行ALP及矿化结节染色。结果体外成功建立兔骨髓间充质干细胞分离扩增传代的方法，能够连续传至8～9代；矿化液培养的细胞ALP及矿化结节染色阳性。结论兔骨髓间充质干细胞能在体外成功培养，具有向成骨细胞诱导分化的特性，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

葡萄糖、胰岛素对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的 观察不同浓度葡萄糖及胰岛素(INs)对骨髓间充质干细胞(BMSC)向成骨细胞(OB)分化能力的影响,探讨葡萄糖及INs对骨代谢的作用机制.方法 采用体外细胞培养技术自大鼠股骨和胫骨中分离BMSC进行纯化,培养,然后在成骨培养基中诱导BMSC分化为OB,并用不同浓度的葡萄糖(5.6、25、50 mmol/L)及加或不加INs(0.6 μg/ml)干预诱导过程,光镜下观察茜素红染色分化后的OB钙结节的细胞比例.Realtime PCR测定OB的标记物碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)及转录因子Runx2 mRNA表达.结果 随着糖浓度升高,茜素红染色红色钙结节数目明显减少,PCR结果显示ALP,BGP及Runx2 mRNA表达也明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).提示随着糖浓度增加成骨分化逐渐减少,在同等糖浓度下,加入INs干预组,茜素红染色阳性细胞计数明显增加,PCR结果ALP,BGP及Runx2 mRNA表达明显升高(P<0.01),提示INs可提高OB分化.结论 葡萄糖呈量效性地抑制BMSC向OB分化,这可能为糖尿病性骨质疏松形成的重要机制之一.INs可促进BMSC向OB分化,并可改善高糖对BMSC向OB分化的抑制作用.     

Ⅱ型胶原体外促进大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化

目的 探讨Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ)在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)向软骨细胞的定向分化作用.方法 体外培养BMSCs,分不同collagen Ⅱ接种浓度组(25、50、100、200 μg/mL)和空白对照组,分别作用于BMSCs 7、14、21 d,采用CCK-8法检测各不同浓度组对BMSCs活性的影响;qPCR法和免疫荧光法检测不同浓度组处理BMSCs后,各浓度组与空白对照组相比,collagen Ⅱ、SOX9及aggrecan mRNA及蛋白表达量的差异.结果 ①CCK-8检测结果显示各浓度组在7、14、21 d D(450)值差异无统计学意义(P＞0.05);②qPCR检测结果显示21 d后,不同浓度组与空白对照组比较,collagen Ⅱ、SOX9及aggrecan mRNA表达量均升高(P＜0.05),以100 μg/mL组最高(P＜0.01);14 d时,各浓度组collagen Ⅱ、SOX9及aggreean mRNA以100 μg/mL组上调最明显(P＜0.05),而在7d时,各组之间三者mRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05);③各浓度组21 d时免疫荧光结果显示:在100 μg/mL Ⅱ组collagen Ⅱ、SOX9及aggrecan mRNA蛋白的表达量较其他各组均明显上调(P＜0.05).结论 collagen Ⅱ可在体外促进大鼠BMSCs向软骨细胞分化,其中以100 μg/mL组促进作用最为明显.     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对兔源骨髓间充质于细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）定向分化为成骨细胞的作用及机制. 方法 离心法分离兔骨髓后,体外培养BMSCs,体积分数5％和10％的PRP与BMSCs共培养,观察BMSCs诱导分化过程中茜素红染色阳性率,应用酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaliphosphatase,ALP）活性,应用ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中骨钙素（osteocalcin,OCN）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的含量,应用real time-PCR检测成骨相关基因CTGF、ALP、成骨细胞核心结合因子α1（core-binding factor alpha 1,Cbf-α1）、兔Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和OCN的表达. 结果 BMSCs诱导分化后细胞茜素红染色阳性率、ALP活性、OCN及CTGF含量升高,CT-GF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN的mRNA表达增加. 结论 PRP可促进BMSCs向成骨细胞分化,可能与PRP促进BMSCs中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN表达有关.     

诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞和软骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离培养、增殖，以及向成骨细胞和软骨细胞定向诱导分化的条件，为骨、软骨缺损的修复和重建提供种子细胞。方法 抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，经密度梯度离心法及塑料板贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。对第2代MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况。并对第2代MSC进行软骨特定培养液诱导，对诱导细胞进行甲苯胺蓝染色，测定诱导后的软骨细胞表型。结果 MSC为梭型的成纤维细胞样贴壁生长，增殖能力强。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后ALP活性明显提高，并且出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论 在特定诱导条件下，兔骨髓MSC体外定向诱导分化为成骨细胞和软骨细胞，为骨和软骨组织工程的修复和重建提供实验依据。     

人骨髓间充质干细胞与成骨细胞共培养诱导破骨细胞方法的建立和鉴定

目的：建立人骨髓间充质干细胞（hMSCs）与人成骨细胞共培养体系,为人破骨细胞体外培养提供更完善的方法。方法：采用酶消化法分离流产胎儿头盖骨,获取人成骨细胞,对在体外培养的成骨细胞进行碱性磷酸酶染色（ALP染色）;利用Percoll 梯度分离法和贴壁筛选法培养hMSCs,应用流式细胞术检测hMSCs 免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的成骨细胞和hMSCs在体外共培养作为实验组,单独培养的成骨细胞作为对照组;对诱导后的细胞应用抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）进行鉴定。结果：体外分离、培养的hMSCs具有独特的细胞免疫学表型, 即CD73和CD105阳性, CD34和CD45 阴性。hMSCs与成骨细胞共同培养5 d后,即可见单个核细胞融合成多核细胞,TRAP 染色可见多数细胞胞浆呈酒红色,为诱导成功的破骨细胞。结论：hMSCs与人成骨细胞共同培养能诱导为具有典型的破骨细胞表型的多核细胞。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的相关研究

骨髓由非贴壁的造血细胞和贴壁的基质细胞部分组成。这些贴壁的基质细胞部分包括多能间充质干细胞和分化的骨髓间充质基质细胞。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)系统依靠增殖来自我更新,但是能够保持其干细胞的表型而引起成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成纤维细胞的分化[1]。如何定向诱导其成骨分化可为研究骨组织工程、骨折修复和骨质疏松等难题提供理论基础,具有重要的意义。本综述讨论了骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的相关研究。     

利拉鲁肽对失重大鼠骨质疏松及骨髓间充质干细胞成骨细胞分化的影响

目的:探讨利拉鲁肽对失重大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响,为航天员飞行后骨量丢失的缓解提供实验依据.方法:取30只12周龄SD雄性大鼠,应用随机数字表法分为对照组、失重组、失重+利拉鲁肽组,每组10只.采用尾悬吊28 d的方法构建大鼠失重模型,失重+利拉鲁肽组悬吊2 d后开始给予利拉鲁肽200μg/(k...     

肝细胞生长因子修饰兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究重组腺病毒肝细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞的转染率及转染后细胞的分化特点。方法获取骨髓间充质干细胞并传代培养、鉴定,以MOI=150的重组腺病毒肝细胞生长因子（Ad—HGF）对其进行修饰,以Ad—GFP检测病毒72h转染率,观察转染后细胞的成骨及成脂分化特点。结果Ad—HGF对MSCs感染效率为99．78％,成骨及成脂诱导14d后可见典型分化。结论以Ad—HGF对MSCs进行感染效果良好,可成为缺血性骨坏死较为有效的治疗手段。     

鹿茸Ⅰ型胶原对骨髓间充质干细胞增殖的影响及其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系

目的：观察鹿茸Ⅰ型胶原（VACTⅠ）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及细胞周期的影响,探讨其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系。方法：选取健康雄性4周龄SD大鼠,差时贴壁法提取BMSCs并传代培养。实验分为空白对照组、转化生长因子β3（TGF-β3）（10μg·L^-1）组和不同浓度（1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 g ·L^-1）VACTⅠ组,CCK-8法检测各组BMSCs增殖率,ELISA法检测各组细胞上清液中骨形态生成蛋白4（BMP-4）和转录因子Sox9水平,流式细胞术检测各组不同细胞周期BMSCs百分率,RT-PCR法和Western blotting法分别检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA和蛋白表达水平。结果：与空白对照组比较,2.50~20.00 g·L^-1 VACTⅠ组大鼠BMSCs增殖率明显降低（P<0.05或P<0.01）;ELISA法,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞上清液中BMP-4和Sox9水平明显升高（P<0.05或P<0.01）;流式细胞术,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组不同细胞周期BMSCs百分率差异无统计学意义（P>0.05）;RT-PCR法,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达水平明显升高（P<0.05）;Western blotting法,与空白对照组比较,TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。结论：VACTⅠ可促进BMSCs释放BMP-4和Sox9,提高Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达水平,抑制BMSCs增殖,是一种潜在的成软骨分化诱导剂。     

细胞表面分子在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的表达

目的研究成人骨髓间充质干细胞(MSCs)在诱导条件下定向分化为成骨细胞过程中,细胞表面分子的表达及变化特征。方法从人骨髓中分离有核细胞,在含有15%胎牛血清、维生素C和β-甘油磷酸钠的α-MEM培养基中培养。在培养早期加入10-8mol/L地塞米松(实验组)或保持基础培养状态(对照组1),同时部分细胞仅培养于α-MEM培养基中(对照组2)。于培养第7、12、17天分别收集实验组和各对照组细胞,用流式细胞方法观察细胞表面分子CD45、CD34、CD117、CD90和人白细胞抗原-DR(HLA-DR)的表达,并定量对比分析。结果成人骨髓MSCs在体外诱导条件下分化为具有成骨细胞特征的成熟细胞。培养第7天实验组、对照组1和对照组2均少量表达CD45,第12、17天CD45表达转为阴性。各组各时间点CD34、CD117表达均为阴性。培养第12天,实验组和各对照组细胞CD90表达均较第7天升高,以对照组升高明显。实验组细胞HLA-DR表达随着成骨细胞分化成熟逐渐上升,而对照组细胞HLA-DR表达下降。结论MSCs在诱导条件下可以向成骨细胞分化。细胞表面分子的表达在细胞分化过程中呈特征性改变,是成骨细胞分化早期的一个重要标志。