供体凋亡脾细胞输注诱导大鼠胰岛移植免疫耐受的研究

目的 探讨供体凋亡细胞输注诱导大鼠胰岛移植免疫耐受的可行性.方法 应用链脲佐菌素(STZ)制备SD大鼠糖尿病模型,以直线加速器照射诱导供体Wistar大鼠脾细胞凋亡.将糖尿病SD大鼠分为4组,分别经阴茎背静脉输注Hanks液、供体正常脾细胞、供体凋亡脾细胞、供体坏死脾细胞,7天后于肾包囊进行同种异体胰岛移植,测定血糖变化,观测胰岛移植物存活时间,并通过混合淋巴细胞反应(MLR)观察移植耐受的状态.结果 预输注供体凋亡脾细胞能显著延长同种异体胰岛移植物存活时间(中位存活时间达31天),并使受体鼠对供体鼠的MLR明显减弱.结论 供体凋亡细胞输注能够诱导同种异体大鼠胰岛移植免疫耐受.     

微囊化大鼠胰岛移植物的制备与异种移植

为降低胰岛移植中排斥反应，用海藻酸钠－聚赖氨酸生物膜制备微囊化大鼠胰岛，体外培养，胰岛素释放试验功能良好，胰岛素释放量与单纯胰岛差异无显著意义；异种移植可成功地纠正糖尿病小鼠的高血糖状态平均达４个月之久。表明：大鼠，胰岛微囊化可在不便用免疫抑制剂的情况下，有效地延长胰岛在糖尿病小鼠体内的生存期。     

CD4+T细胞抗体标记超顺磁性氧化铁MR成像诊断异种胰岛移植免疫排斥反应的实验研究

目的 探讨利用抗人分化抗原簇(CD)4+T细胞抗体标记的纳米免疫超顺磁性氧化铁(SPIO)作为MRI生物探针,诊断胰岛细胞移植后免疫排斥反应的可行性.方法 27只BALB/C裸鼠,每只左肾被膜下移植分离纯化后的猪胰岛细胞2000个,3周后MRI可观察到肾包膜下移植物大小,然后采用数字表法随机将实验动物分为实验组(21只)和对照组(6只).将人T淋巴细胞注入实验组鼠腹腔内重建人的T淋巴细胞免疫系统,其中20只重建成功.实验组动物免疫系统重建前及重建后3、7和14 d,经尾静脉注射纳米免疫SPIO,30 min后行MRI T2WI,观察移植物的MRI信号改变.MRI结束后立即安乐死方法牺牲动物,取下左肾行移植物病理组织检查;对照组动物胰岛细胞移植后,不进行免疫处理,与实验组动物相同时间点给予相同检查.并以病理检查为金标准,用临床诊断一致性检验计算MRI对异种胰岛细胞移植后免疫排斥反应诊断的灵敏度、特异性、Youden指数和符合率.结果 2组动物在移植胰岛细胞3周后MRI可显示移植物.实验组BALB/C裸鼠,重建免疫系统前及重建成功后3 d注入纳米免疫SPIO,MRI移植物局部未见异常信号;免疫系统重建成功后7 d,MRI显示移植物对应区域信号减低,苏木精.伊红及CD4+T免疫组织化学染色显示移植物局部大量淋巴细胞浸润,提示免疫排斥反应发生.对照组动物移植物所有MRI均未见异常;病理组织学检查移植物局部未见炎性细胞浸润.MRI对免疫反应检测的灵敏度、特异度、Youden指数和符合率分别为:(72.96±0.24)%、100%、0.73±0.24、(88.46±0.13)%(Kappa值为0.76).结论 通过抗人CD4+T细胞抗体标记的纳米免疫SPIO牛物探针MRI,可以检查异种胰岛细胞移植后免疫排斥反应,并能早期、实时、无创性的对移植受体免疫排斥反应进行诊断.     

模拟微重力条件下体外培养神经细胞模型的初步建立

目的研究模拟微重力条件下构建新生大鼠神经细胞培养体系的方法。方法分离新生鼠海马区原代神经细胞，接种于Cytodex3型微载体，培养3d后转移入旋转细胞培养系统，用倒置显微镜和扫描电镜观察神经细胞在微载体上的生长情况，进行神经元细胞特异性烯醇酶的免疫组织化学染色，用Image-Pro Plus软件进行神经细胞胞体面积的测量。结果微重力条件下神经细胞在微载体上均匀分布，免疫组织化学结果显示神经元被染成棕色，其胞体面积较正常重力条件培养的神经细胞有显著增加（P〈0．01）。结论神经细胞可以在微重力条件下进行培养，这个体系的建立有着广泛的应用前景。     

胰岛移植的分子影像

对不稳定1型糖尿病而言,胰岛移植是使患者脱离胰岛素治疗的一种有效方法。传统影像检测不能有效地监测与评估体内移植的胰岛,分子影像学能实时对移植的胰岛移植物的存活状态及功能进行评估,从而为临床提供更有参考价值的、实时反映移植物状态的数据,对移植物的活力及功能进行活体评估,有利于胰岛移植的后续干预治疗,将有望推动胰岛移植临     

胰岛移植的分子影像北大核心CSCD

对不稳定1型糖尿病而言,胰岛移植是使患者脱离胰岛素治疗的一种有效方法。传统影像检测不能有效地监测与评估体内移植的胰岛,分子影像学能实时对移植的胰岛移植物的存活状态及功能进行评估,从而为临床提供更有参考价值的、实时反映移植物状态的数据,对移植物的活力及功能进行活体评估,有利于胰岛移植的后续干预治疗,     

大鼠胰岛分离与纯化的实验研究

为探讨胰岛移植物的制备方法，采用胰管注射胶原酶、胰腺静止消化方法，分离成年大鼠胰岛，葡聚糖离心纯化。纯化后胰岛收获量为６１０～８２０个／胰腺，纯度达９２％；胰岛形态结构完整，内分泌细胞超微结构保持良好；对葡萄糖刺激反应胰岛素释放量是基础分泌水平的８倍；异种移植可逆转实验性糖尿病小鼠的高血糖达１周。结果表明：胰管注射胶原酶胰腺静止消化可获得高产量、高纯度、功能良好的胰岛。为临床胰岛移植开辟了新的途径。     

口服抗原对同种异体移植免疫反应的影响

将Wistar大鼠预先喂养同种异基因SD大鼠脾细胞7天，然后接受SD大鼠的皮肤移植，7天后，再接近SD大鼠的心脏移植，观察口服抗原后体外混合淋巴细胞培养（MLC）、体内迟发型超敏反应（DTH）以及心脏存活时间。口服抗原后，体外MLC及体内DTH反应均出现明显的抗原特异性降低，口服抗原组大鼠并接近供者皮肤致敏后的心脏移植存活时间达到7天，与对照组未致敏鼠的心脏移植存活时间一致；而未口服抗原组接受皮肤致敏后的心脏移植存活时间不超过2天。提示口服抗原可以使异基因抗原的特异性免疫应答降低，延长移植存活时间，阻皮肤移植物的事先致敏反应的发生，并使加速排斥反应时间明显延迟。     

Dextran分离纯化大鼠胰岛的生物学特性

目的探讨一种分离纯化大鼠胰岛的方法,并评价该法分离得到的胰岛的生物学特性。方法常规外科手术分离胰腺。然后将其剪为1mm3左右碎块,置于0·9mg/ml胶原酶V37℃振荡消化10~17min,以含10%胎牛血清的Hank’s液终止消化。60目筛网过滤。Dextran T40非连续密度梯度离心纯化胰岛。纯化后的胰岛经DTZ染色,吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色、放射免疫分析检测胰岛素分泌量,纯化后的胰岛进行异种移植,检测降糖效果。结果胰岛分布于11?xtran和1640及11%和22?xtran界面之间,平均每只Wistar大鼠消化后可获得2181±14个胰岛,纯化后回收1826±24个胰岛,胰岛收获量达(85·7±5·9)%,纯度高达95%以上。胰岛对葡萄糖刺激有良好的反应性,纯化后胰岛异种移植,可逆转实验性糖尿病SD大鼠血糖7~10天。结论胶原酶消化,Dextran T40纯化是一种简单、高效的胰岛分离纯化方法,获得的胰岛有良好的生物学特性。     

同基因胰岛移植—γ射线照射的作用

<正> 已证明移植前用γ射线(2.5Gy)照射胰岛可使同种异体移植存活期延长。此研究的目的在于探讨使用不同量的γ射线(40,20,10,5Gy)照射胰岛时对胰岛活力的作用。照射前将鼠胰岛分离进行48小时培养,经过96小时进一步培养之后,将可成功地逆转糖尿病(第7天时血糖<10mmol/L)最少量750个胰岛移植到由链脲霉素制造的糖尿病鼠(血糖>20mmol/L)肾被膜下。移植后第14天,对这些被逆转的糖尿病鼠进行静脉糖耐量测定,其糖耐量曲线下面积(AUC)用计算机处理。可以观察到40Gy组     

负载猪源性CTLA4Ig的猪胰岛细胞阻断直接识别途径在异种移植中的作用

目的：探讨负载供体源性CTLA4Ig的胰岛细胞通过阻断直接识别途径,诱导异种胰岛细胞抑制免疫耐受的可行性及有效性。方法：使用本实验小组前期构建的携带供体源性（猪）CTLA4-Ig的腺病毒载体（Adv-pCT-LA4-Ig）转染猪胰岛细胞,植入糖尿病大鼠肾包膜下,建立猪-大鼠异种胰岛移植模型,监测移植术后大鼠血糖变化及IL-4、γ-IFN的水平变化,检测移植物中pCTLA4-Ig、猪源性胰岛素（p-Insulin）表达情况。结果：1.大鼠血糖在移植术后即开始明显下降,于第3 d左右降至正常,三组大鼠血糖分别在移植术后6、7、35 d左右开始升高;2.三组大鼠术后胰岛平均存活时间为7.43±1.72 d、7.22±1.72 d、34.50±4.14 d,实验组胰岛细胞存活时间较对照组明显延长（P〈0.01）;3.细胞因子变化：（1）γ-IFN：对照组在移植术后第1 d开始轻度升高,于第3 d后开始明显升高,第7 d达到高峰,此后缓慢升高;实验组在移植术后第1～28 d波动较小,同术前相比无明显变化,在移植后第28 d开始上升,第35 d开始急剧上升;（2）IL-4：实验组在移植术后第1 d开始下降,第7 d达到谷值;对照组在移植术后第3～5 d轻微上升,在移植后第28 d开始下降至移植术前水平,第35 d开始急剧下降;4.病理学检查：实验组移植物无明显破坏,炎细胞浸润不明显;免疫组化可见大量pCTLA4-Ig、p-Insulin表达。结论：转染供体源性CTLA4-Ig的胰岛细胞通过阻断直接识别途径,可诱导异种胰岛细胞产生较长时间的免疫耐受。     

bcl-2基因转染对大鼠胰岛细胞培养的影响

目的探讨bcl-2基因转染对培养的胰岛细胞凋亡和生物活性的影响。方法用腺病毒介导的基因转染方法把bcl-2转染人胰岛细胞，用RT—PCR和免疫细胞化学方法检测转染细胞中bcl-2的表达，原位末端标记（TUNEL）检测细胞凋亡，台盼蓝测定细胞活度，放免法测定培养液巾胰岛素水平了解胰岛功能。结果转染的胰岛细胞中70％的细胞有bcl-2蛋白的表达，转染细胞的凋亡率为6％，对照组为22死，转染胰岛细胞的活度为91％，对照组为68％，转染胰岛细胞在高糖培养基中胰岛素水平高于对照组。结论腺病毒介导的基冈转染方法能成功转染胰岛细胞，bcl-2基因转染能降低细胞凋亡率，改善胰岛细胞功能。     

海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化胰岛细胞移植治疗糖尿病的实验研究

采用Ｓｕｎ海藻酸钠－多聚赖氨酸－海藻酸钠（ＡＰＡ）微囊制作技术,分别包裹大鼠胰岛和胰岛素分泌细胞系,移植于糖尿病小鼠腹腔。结果表明ＡＰＡ微囊化大鼠胰岛或胰岛素分泌细胞移植,均可使糖尿病小鼠血糖降低至接近正常水平达３周至１１０天;移植微囊无明显的组织学反应。证明该ＡＰＡ微囊化胰岛细胞移植具有较好的治疗效果,微囊具有较好的生物相容性和免疫隔离作用。为进一步发展生物型人工胰岛奠定了基础。     

大鼠胰岛细胞原代培养方法比较研究

目的：比较减碎消化法和原位灌注消化法在大鼠胰岛细胞原代培养中的优缺点,探讨一种简单易行的大鼠胰岛细胞培养方法。方法：雄性SD大鼠30只随机分成减碎组（CC组,n=15）,胰腺剪为小组织块后,Ⅴ型胶原酶逐级消化分离;原位灌注组（YY组,n=15）,采用胆总管逆行灌注Ⅴ型胶原酶分离胰岛。双硫腙（DTZ）染色检测胰岛纯度,葡萄糖刺激胰岛素释放试验检测胰岛功能。结果：2组获得的胰岛对于葡萄糖刺激均具有良好的分泌活性（P〈0.01）;YY组比CC组获得的胰岛数量多（P〈0.01）,形态较好,等量胰岛的胰岛素释放量亦多（P〈0.05）。结论：胆总管原位灌注Ⅴ型胶原酶消化可以获取数量多,活性和纯度较好的胰岛。     

益气养阴活血方对2型糖尿病大鼠胰腺miR-375表达水平和胰岛功能的影响

 目的 探讨益气养阴活血方对2型糖尿病大鼠胰腺组织中miR-375表达水平的影响,并分析其与胰岛β细胞功能的相关性。方法 采用小剂量链脲佐菌素(STZ)加高脂饮食诱导2型糖尿病大鼠模型。设空白组、模型组、益气养阴活血方(自拟) 高、中、低剂量治疗组,于治疗8周后处死大鼠。分别测定大鼠体质量、空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(2hBG)、胰岛素敏感指数(ISI)并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),胰岛素分泌指数(HOMA-β)光镜下观察胰岛形态学变化,通过实时荧光定量PCR技术检测胰腺组织中miR-375的表达水平。结果 经益气养阴活血方治疗后,大鼠的体质量、FBG、2hBG均不同程度降低(P<0.05);HOMA-IR均有所降低,ISI HOMA-β均有所升高(P<0.05);胰岛细胞形态有不同程度改善;胰腺组织中的 miR-375 表达量显著降低,模型组(2.29±0.91),益气养阴活血方低剂量组(0.33±0.21),中剂量组(0.43±0.32),高剂量组(0.48±0.19),治疗前后比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 益气养阴活血方可改善胰岛β细胞功能。其改善的原因可能与胰腺中miR-375表达下调有关。     

桑银降糖胶囊对实验性糖尿病大鼠脂质过氧化物酶水平的影响

目的观察桑银降糖胶囊对实验性糖尿病大鼠脂质过氧化物酶水平的影响。方法用微量血糖测定法测定链脲霉素（STZ）实验性糖尿病大鼠实验前后各组空腹血糖浓度。用放免法测定血清胰岛素和C肽。用黄嘌呤-鲁米诺化学发光法测定血液超氧化物歧化酶（SOD）的活性。用硫化巴比妥酸（TBA）比色法测定血清丙二醛（MDA）的含量。用HE染色方法观察桑银降糖胶囊治疗前后胰腺、肝脏、肾脏的组织学变化。结果桑银降糖胶囊可升高糖尿病动物模型SD大鼠胰岛素（36．08±11．40μIU／ml）和C肽（0．10±0．04μIU／ml）的浓度，具有明显降糖（6．33±1．66）mmol几作用，对糖尿病动物模型SD大鼠具有提高血液SOD的活性（591．00±53．03ug/g．HB），降低MDA水平的功效f6．30．85umol／L）。对糖尿病动物模型SD大鼠的胰腺、肝脏、肾脏等组织有改善作用。结论桑银降糖胶囊减少自由基对糖尿病动物模型SD大鼠的胰腺、肝脏、肾脏等组织的损伤并具有保护作用．纠正糖尿病动物模型SD大鼠的糖代谢紊乱，减少并发症的发生。     

胃转流术对GK大鼠胰岛纤维化的影响

目的探讨胃转流术对GK大鼠胰岛纤维化的影响。方法雄性GK大鼠40只,高脂饲料喂养1 w模后,随机分为手术组和假手术组各20只。手术组行胃转流术,假手术组行胃窦十二指肠离断原位吻合术,分别于术前、术后1、2、4 w,测定各组空腹血糖、口服糖耐量试验（OGTT）后2 h血糖;术后4 w,分别采用免疫组化及免疫荧光双染检测各组胰岛内胰岛素、纤维连接蛋白（FN）、胶原蛋白-Ⅲ（CO-Ⅲ）和巨噬细胞的表达水平。采用Image-Pro plus 6.0图像分析软件测定胰岛素含量及FN、CO-Ⅲ和巨噬细胞表达情况。结果与术前相比,手术组术后2、4 w的空腹和术后4 w的OGTT 2 h血糖显著降低（P〈0.05）;与假手术组相比,手术组术后2、4 w空腹和术后4 w的OGTT 2 h血糖显著降低（P〈0.01）;与假手术组比较,手术组术后4 w单位胰岛面积中FN、CO-Ⅲ、巨噬细胞的累计光密度值（IOD）明显降低（P〈0.05）,胰岛素的IOD明显增高（P〈0.05）;术后4 w,手术组较假手术组的胰岛形态规则。结论胃转流术后,GK大鼠胰岛的纤维化有所减轻,是其治疗2型糖尿病的可能机制之一。