甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法的建立

目的构建一种可同时检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法。方法根据不同流感亚型HA与NA的差异,设计五对引物及五条探针,构建合适的检测体系,分析特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,并将其与常用检测试剂盒进行比对。结果本研究成功构建多重荧光RT-PCR检测体系,能同时检出甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒,检测灵敏度为101~102拷贝/μl,可重复性好(变异系数为0.47%~4.03%),比常用检测试剂具有更好的荧光值水平,可适用于多种常见的荧光定量PCR仪。结论本方法所构建检测流感亚型体系具有较好的特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,适用于各基层疾控及医疗机构。     

六重荧光RT-PCR快速检测A、B型流感等呼吸道病毒方法的建立

目的利用六重荧光RT-PCR法建立起一种快速检测A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒的方法。方法根据A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒的保守序列,设计相应的引物和Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒优化反应体系后,采用十倍稀释体外转录RNA检验建立体系的灵敏度和重复性,并建立相对定量的标准曲线;利用具有多种相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性。结果 A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒的检测灵敏度为100 copies/μL,标准曲线的相关系数都在99%以上,重复性良好,特异性实验未发现有非特异性扩增。结论本研究建立的六重荧光RT-PCR技术可以快速、准确地检测A、B型流感病毒/人偏肺病毒/NL63型、HKU1型和OC43型冠状病毒等六种呼吸道病毒。     

检测甲型H1N1流感病毒富集方法的初步探索

目的探索甲型H1N1流感病毒的富集方法,提高流感病毒核酸检测的灵敏度。方法分别用ProteinA/G及H1N1特异性血清处理流感病毒样品,根据国家流感中心设计的H1N1亚型检测通用引物,采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法,扩增产物为527bp,来评价病毒的富集效果。结果两种富集方法均能提高检测灵敏度,用ProteinA/G富集处理后检测灵敏度可达10-6,用H1N1特异性血清沉淀富集处理后灵敏度为10-5。结论初步建立的富集甲型H1N1流感病毒方法,有效提高了流感病毒RT-PCR检测的灵敏度,可用于甲型H1N1流感病毒的检测。     

腺病毒、呼吸道合胞病毒和博卡病毒三重荧光RT-PCR快速检测的研究分析

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测腺病毒、合胞病毒和博卡病毒的方法。方法从Gen Bank随机下载腺病毒、合胞病毒和博卡病毒的目的基因,通过MEGA分析,利用Primer Express3.0软件设计三对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR来建立和优化反应体系。10倍稀释阳性对照,来检验建立体系的灵敏度和重复性。利用具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性。结果建立了一个单管对腺病毒、呼吸道合胞病毒和博卡病毒进行检测的三重荧光RT-PCR反应体系。该体系的检测灵敏度为102 copies/μl,扩增效率分别为92.24%、96.95%和99.70%,标准曲线的相关系数大于99%,重复性变异系数3.5%,特异性实验未发现有非特异性扩增。结论建立的三重荧光可以快速、准确地检测腺病毒、合胞病毒和博卡病毒。     

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与传统的血凝抑制法进行比较。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2.56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.999,扩增效率为108.5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法只有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

双重荧光实时RT-PCR技术鉴定H9N2亚型禽流感病毒

采用双重荧光实时RT-PCR技术,建立一种简便易行的H9N2亚型禽流感病毒的快速鉴定方法。通过比对GenBank甲型禽流感病毒H9N2亚型的HA和NA基因序列,设计特异性针对HA和NA的引物,分别选用FAM和JOE两种不同荧光标记探针,构建双重实时荧光PCR一步法反应体系,同时检测样本中的HA和NA基因。结果显示:扩增曲线和特异性实验结果显示,该体系具有很好的扩增效率,且仅特异性识别H9N2亚型AIV的HA、NA基因,与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用重组质粒pMD19-T构建HA、NA阳性质粒,10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。结果证实,本研究所建立的双重荧光定量RT-PCR体系敏感性能达到10个RNA拷贝数。采用本方法检测60份感染动物样品及60份环境样品,与传统PCR方法相比,检测敏感性提高了100倍;与病毒分离鉴定方法比较,二者的鉴定结果完全吻合。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速易操作等优点,是H9N2亚型禽流感病毒鉴定的有效方法。     

我国研制出快速检测甲型H1N1流感病毒试剂盒

军事医学科学院军事兽医研究所近日研制成功能快速检测出甲型H1N1流感病毒的试剂盒——流感病毒RT-PCR检测试剂盒，能特异性检测H1、H3、H5、H7、H9亚型流感病毒，可对甲型H1N1流感病毒进行特异性分型检测。     

实时荧光定量RT-PCR快速检测四种呼吸道病毒的研究

目的利用实时荧光定量RT-PCR建立快速检测人腺病毒(HADV)、人博卡病毒(HBoV)、人偏肺病毒(HMPV)、人呼吸道合胞病毒(HRSV)等四种呼吸道病毒的方法。方法寻找四种呼吸道病毒的相对保守序列,针对该序列分别设计4对引物对及其相应的Taqman探针,将此保守序列作为目的基因片段,使用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系;采用10倍稀释体外转录RNA,检测建立的体系的灵敏度和重复性并建立反应体系标准曲线;通过临床样本检验体系的特异性。结果 HADV、HBoV、HMPV、HRSV四种病毒的检测灵敏度均为10 copies/μl,标准曲线的决定系数分别为:HADV R2=0.9998,HBoV R2=0.9981,HMPV R2=0.9981,HRSV R2=0.9947和0.9965,扩增效率分别为:HADV 105.08%,HBoV 107.81%,HMPV 102.08%,HRSV FAM荧光106.38%及CY5荧光107.95%。荧光RT-PCR反应体系检测体外转录的RNA的各个拷贝数浓度的变异系数均较低,对临床样本检验的特异性为100%。结论本研究建立的实时荧光定量RT-PCR体系可快速、准确地检测人HADV、HBoV、HMPV、HRSV等四种呼吸道病毒,且重复性较好,特异性高。     

快速检测人新甲型H1N1、季节性和乙型流感病毒多重PCR方法的建立

目的 建立一种可以同时检测人类新甲型H1N1、季节性H1N1和H3N2亚型流感病毒及乙型流感病毒的多重PCR方法.方法 根据以上4种流感病毒的特异性基因设计4对引物,建立可同时扩增出4个流感病毒特异性片段的多重PCR的方法.用人的GAPDH基因作为内参判断标本来源和实施质量控制的依据.并进行敏感性、特异性和盲样检测评价实验.结果 该方法可同时扩增出流感病毒亚型的HA基因片段长度分别为106 bp(新甲型H1N1)、135 bp(季节性H1N1)、118 bp(季节性H3N2)、170 bp(乙型流感病毒).该实验检测新甲型H1N1(A/colifornia/07/ 2009)的敏感性为102copies/反应.特异性实验结果显示每对引物只检测对应的病毒,32份盲样检测结果特异性好.结论 该多重PCR方法可同时检测新甲型H1N1及季节性流感病毒,敏感性、特异性强,可用于人类流感病毒的鉴别分型检测.     

登革热病毒RNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定登革热病毒(DV)及DV病毒的RNA拷贝数.方法 利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对登革热病毒RNA定量外标准品的定量分析,优化反应体系.检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性.结果 该方法检测灵敏度可达1×103 copies/mL,特异性及重复性良好,对同一样品进行5次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为O.792.结论 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定登革热病毒及DV RNA载量.     

实时荧光RT-PCR法快速检测流感病毒的应用研究

目的应用实时荧光RT-PCR快速检测2009～2012年河池市流感病毒核酸,为流感的预防控制提供科学依据。方法采集河池市哨点医院的流感样病例和暴发疫点现患病例的咽拭子标本,采用实时荧光RT-PCR方法进行流感病毒核酸检测分型。结果以实时荧光RT-PCR法检测2 090份标本,流感病毒核酸阳性801份,总阳性率为38.28%。其中甲型H1N1流感468份,B型126份,季节性流感H1亚型14份,季节性流感H3亚型109份。结论实时荧光RT-PCR法检测流感病毒具快速、操作方便、特异性强、灵敏度高等优点,值得推广应用。     

建立禽流感H7和H9亚型荧光定量PCR检测方法

目的建立高致病性禽流感H7和H9亚型荧光定量PCR方法。方法根据禽流感病毒(avian influenzavirus,AIV)HA-H7基因和HA-H9基因分别设计特异AIV H7和H9亚型特异荧光定量PCR引物和探针,优化反应体系和反应条件,分析该试剂的敏感性、特异性、重复性等。结果经优化反应体系和反应条件后,AIV H7试剂和AIV H9试剂的敏感性达到1×104.67EID50和1×103.80EID50水平,特异性与细胞培养敏感性类似;批内和批间精密度Ct值的CV值均远小于10%,可重复性良好。结论本项目研制的AIV H7和H9亚型的敏感性、特异性、重复性均好,适合在禽流感H7和H9亚型疫情和人类疑似禽流感病例中检测使用。     

568份疑似甲型H1N1流感病例标本病原学检测结果分析

目的对河池市568份疑似甲型H1N1流感病例标本进行核酸检测,为甲型H1N1流感疫情的防控提供依据。方法对疑似甲型H1N1流感病例标本用实时荧光定量RT-PCR法（Real-time RT-PCR）检测,检测项目为A型流感病毒核酸、B型流感病毒核酸和甲型H1N1流感病毒核酸,对A型流感病毒核酸阳性而B型流感病毒核酸和甲型H1N1流感病毒核酸均阴性标本再进行季节性流感病毒H1N1、H3N2亚型流感病毒核酸检测。结果检测疑似病例标本568份,其中甲型H1N1流感病毒核酸阳性334份,季节性流感病毒H1N1亚型核酸阳性14份,季节性流感病毒H3N2亚型核酸阳性25份,A未分型流感病毒核酸阳性40份。结论实验室检测为甲型H1N1流感疫情的确认、防控以及病人的处理提供了依据,对提高实验室检测技术的敏感性、特异性和实效性具有重要的意义。     

环介导等温扩增法对乙肝病毒的快速检测和分型

目的针对乙肝病毒(HBV)不同亚型,建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,实现对HBV的快速检测及基因分型。方法分别设计HBV B、C、D三亚型基因组特征序列的LAMP引物,优化反应条件,建立特异灵敏的HBV亚型LAMP检测方法,并与Real-time PCR方法进行临床样本检测结果比对。结果 LAMP法在数十分钟内有效地检测出HBV的B、C、D三亚型;其中,HBV-B亚型的检出限为17拷贝;C亚型的检出限为25拷贝;D亚型的检出限为10拷贝。与Real-time PCR法相比,灵敏度提高1 000倍左右。结论 LAMP法可实现HBV的快速检测及分型,具有高特异度和高灵敏度,可用于临床检测诊断。     

Generation and characterization of a cold-adapted attenuated live H3N2 subtype influenza virus vaccine candidate

Background H3N2 subtype influenza A viruses have been identified in humans worldwide, raising concerns about their pandemic potential and prompting the development of candidate vaccines to protect humans against this subtype of influenza A virus. The aim of this study was to establish a system for rescuing of a cold-adapted high-yielding H3N2 subtype human influenza virus by reverse genetics, Methods In order to generate better and safer vaccine candidate viruses, a cold-adapted high yielding reassortant H3N2 influenza A virus was genetically constructed by reverse genetics and was designated as rgAA-H3N2. The rgAA-H3N2 virus contained HA and NA genes from an epidemic strain A/Wisconsin/67/2005 （H3N2） in a background of internal genes derived from the master donor viruses （MDV）, cold-adapted （ca）, temperature sensitive （ts）, live attenuated influenza virus strain A/Ann Arbor/6/60 （MDV-A）. Results In this presentation, the virus HA titer of rgAA-H3N2 in the allantoic fluid from infected embryonated eggs was as high as 1：1024. A fluorescent focus assay （FFU） was performed 24-36 hours post-infection using a specific antibody and bright staining was used for determining the virus titer. The allantoic fluid containing the recovered influenza virus was analyzed in a hemagglutination inhibition （HI） test and the specific inhibition was found. Conclusion The results mentioned above demonstrated that cold-adapted, attenuated reassortant H3N2 subtype influenza A virus was successfully generated, which laid a good foundation for the further related research.     

荧光定量RT—PCR检测发热患者甲型H1N1流感效果

目的探讨荧光定量RT—PCR检测新型甲型H1N1流感在发热患者中的分布规律,为甲型H1N1流感疫情的防控提供参考。方法对发热门诊233例患者咽拭子标本进行荧光定量RT—PCR检测甲型H1N1流感病毒核酸。并对检测结果进行统计计算。结果甲型流感病毒检出率为51。5％;甲型H1N1流感病毒的检出率为14．2％;没有猪甲型流感病毒检出。结论方法灵敏度高、特异性强、检测时间短,能安全、及时、有效开展发热门诊甲型H1N1流感病例检测工作。     

甲型H1N1流行性感冒临床特征分析

对3499例甲型H1N1流行性感冒病例进行流行病学调查和咽拭子采样,用实时荧光定量聚合酶链反应方法检测患者甲型H1N1流行性感冒病毒核酸,分析患者临床特点和排毒时间.结果 显示,有13例（0.37%）为隐性感染,症状中出现最多见为发热（86.77%）,平均咽拭子转阴时间为发病后6 d,未发现与咽拭子转阴时间的临床相关因素。