牛视网膜微血管内皮细胞培养方法的研究

目的 探求一种简单、易行的体外培养牛视网膜微血管内皮细胞的方法。方法 采用胶原酶消化获得细胞，并用低浓度人血浆提纯细胞。加入视网膜提取液促进细胞生长。结果 经过多次探索、观察，比较成功的进行了视网膜血管内皮细胞的培养，并成功的进行了鉴定。结论 此方法适合一般实验室开展视网膜血管内皮细胞培养。     

IKKε基因敲除小鼠血管内皮细胞的原代培养及鉴定

目的:建立简单有效地获取I?资B激酶复合物?着(inhibitor-?资B kinase ?着,IKK?着)基因敲除小鼠血管内皮细胞的培养方法?方法:在超净台中取小鼠主动脉,撕去其外膜和脂肪组织,纵行剖开血管,切成1 mm × 1 mm的血管块,内面朝下贴于培养皿底部,加入含内皮细胞生长辅助因子(ECGS)的DMEM培养液,贴壁培养;用倒置显微镜观察细胞形态并用Ⅷ因子相关抗原免疫荧光的方法进行鉴定?结果:72 h后在倒置显微镜下可见内皮细胞从血管块边缘游出,12~14 d血管内皮细胞融合成片,Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测呈阳性?结论:本方法可获取纯度高?结构和功能良好的IKKε基因敲除小鼠血管内皮细胞?     

血管抑素体外对兔视网膜微血管内皮细胞增生的抑制

目的 观察血管抑素对体外培养的兔视网膜微血管内皮细胞生长的抑制作用及对细胞外信号调节蛋白激酶1(ERK-1)活化的影响。方法 利用L-Lysine耦联的Sepharose 4B亲和层析柱从血浆中分离和纯化血管抑素。原代培养兔视网膜微血管内皮细胞，MTT法检测不同浓度的血管抑素对其生长的抑制作用，Western blot检测血管抑素对血管内皮细胞生长因子刺激的视网膜微血管内皮细胞ERK-1水平的影响。结果 血管抑素在体外能显著抑制视网膜微血管内皮细胞增生，其ED50约为160μg／ml。VEGF刺激兔视网膜微血管内皮细胞后，ERK-1被迅速激活，而血管抑素能使其表达量降低35．6％。结论 血管抑素有望成为极有临床价值的防治视网膜新生血管形成的新药。     

牛视网膜微血管内皮细胞的选择性培养方法

目的探讨牛视网膜微血管内皮细胞(BREC)的体外选择性培养方法。方法体外分离牛视网膜组织,结合选择性培养基的使用等方法选择性培养BREC,Von Willebrand因子免疫组化鉴定,观察其形态学特点并绘制生长曲线。结果选择性培养的BREC能够连续传代,且纯度达到98%以上,对Von Willebrand因子抗体染色阳性,BREC融合后呈铺路石样单层生长,有接触抑制。其生长曲线显示该细胞在传代后的第3～4天进入对数生长期,到第10～12天进入平台期。结论选择性培养方法的应用可获得较高纯度的BREC,简单且重复性好,无需额外除杂步骤。     

选择性培养的牛视网膜微血管内皮细胞VEGF的表达(摘要)

目的建立牛视网膜微血管内皮细胞选择性分离培养的简便经济方法,并检验视网膜微血管内皮细胞合成分泌的VEGF.     

高糖对牛视网膜微血管内皮细胞损伤的实验研究

目的　利用体外培养的牛视网膜微血管内皮细胞来观测高浓度葡萄糖在细胞的损伤中所起的作用。方法体外培养牛视网膜微血管内皮细胞。通过MTT (四唑氮盐 )法及3 H -TDR掺入法研究高糖对牛视网膜微血管内皮细胞的损伤作用。结果　内皮细胞在含高糖 (2 8、 4 0mmol/L)DMEM培养基及不同培养时间 (2d、 7d)下MTT测定结果与对照组 (生理浓度葡萄糖 ,5 5mmol/L)比较有显著性差异P <0 0 5 ,3 H -TDR掺入法研究结果显示高糖对视网膜微血管内皮细胞的增殖有明显抑制作用 ,亦呈剂量及时间依赖性损伤细胞。结论　高浓度葡萄糖对牛视网膜微血管内皮细胞有显著的损伤作用     

川芎嗪对缺氧时视网膜血管内皮细胞ATP分泌的影响

目的探讨川芎嗪对缺氧牛视网膜血管内皮细胞中ATP含量的影响。方法用酶消化法分离牛眼视网膜血管内皮细胞,进行形态学的观察并用Ⅷ相关免疫组化法鉴定。取3代的细胞用于实验。细胞分组：取常规培养的第3代细胞,分为5组：正常对照组（F12培养基常规培养）,缺氧组（加入终浓度125μmmol/L的CoCl2）和缺氧加药物组（加入含20、40、120μg/ml川芎嗪）。免疫组化法和生物荧光法分别检测川芎嗪对CoCl2诱导的缺氧的牛视网膜血管内皮细胞中ATP含量。结果缺氧BREC细胞ATP含量增加,而川芎嗪可减少缺氧引起的ATP浓度升高,且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20μg/ml时,其ATP含量水平已显著下降（P〈0.01）。结论川芎嗪可减少缺氧诱导的血管内皮细胞ATP含量增加。     

新生大鼠肺微血管壁周细胞的培养方法及其生长特性

用 型胶原酶消化和微孔过滤法分离新生大鼠肺微血管段的内皮细胞和周细胞 ,再用富含 PDGF的选择性条件培养液刺激周细胞的生长和抑制内皮细胞生长而建立了肺血管壁周细胞的培养方法。 S180细胞条件培养液(SCCM)的灭活 ,分离、纯化微血管段 ,静置及筛选周细胞是获得新生大鼠肺血管壁周细胞纯培养的关键。用该方法培养的第 5代周细胞 ,经相差显微镜和免疫细胞化学法检查 ,纯度达 98%以上 ;细胞倍增时间为 5 4.3h,且在 12代以内 ,细胞形态结构特征保持稳定 ,适合做周细胞的体外实验研究     

犬骨髓基质干细胞源性血管内皮样细胞的诱导分化及细胞特征鉴定

目的采用血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导犬骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs),探讨BMSCs向内皮细胞(endothelial cells,ECs)分化的潜能和内皮细胞的特征性鉴定方法。方法采集犬髂骨骨髓15～20 mL,全骨髓10%FBS DMEM培养液进行原代培养。将第2代纯化的BMSCs细胞悬液接种于含VEGF、bFGF的DMEM/F12培养液(细胞接种密度为1×106.mL-1)体外诱导培养。对细胞形态特征进行观察,对诱导分化的细胞行CD31、vWF、VEGFR-2荧光免疫蛋白检测。结果原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长。诱导分化后的细胞光镜下单层融合生长,呈铺路石样形态;电镜下细胞呈多边形,可见特征性的Weibel-Palade小体;经成血管内皮细胞诱导培养7～14 d后,BMSCs诱导分化细胞CD31、vWF和VEGFR-2的表达呈阳性。结论犬BMSCs易于体外分离培养及扩增,经VEGF、bFGF体外定向诱导后的细胞具有血管内皮细胞的特征且细胞纯度高、数量大。     

组织工程心脏瓣膜构建中内皮细胞增殖的影响因素

目的:研究影响种植在脱细胞猪主动脉瓣叶上的新生牛主动脉内皮细胞(BAECs)增殖的因素。方法:以脱细胞猪主动脉瓣叶为支架,在其上种植BAECs。实验分3组:A组单次种植和多次重复(间隔24 h)种植内皮细胞,细胞总数相同;B组细胞培养液含和不含内皮细胞生长物质(ECGS);C组种植前分别以PBS和 FCS预处理12 h;通过细胞计数,观察种植细胞增殖的变化。结果:多次重复连续种植较单次种植的细胞数明显增加(P<0.05);培养液中加ECGS组细胞计数明显比未加ECGS组高(P<0.05);细胞种植前以FCS浸泡者比以PBS浸泡者细胞数增加(P<0.05)。结论:单独种植内皮细胞于脱细胞猪主动脉瓣叶上时,将瓣叶支架以FCS浸泡,培养液中加ECGS,多次重复、间隔24 h种植细胞能明显促进内皮细胞的增殖。     

脂肪干细胞的分离提取、鉴定及与脂肪颗粒的混合移植研究

目的分离提取脂肪干细胞(ADSCs),对其进行成脂、成骨的鉴定,并与脂肪颗粒混合移植,观察移植后的脂肪组织的存活情况。方法取大鼠腹股沟脂肪,磷酸盐缓冲液清洗,0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化1 h,离心,取沉淀,用含10%血清的DMEM培养基进行培养、传代,取第3代ADSCs用于成脂、成骨鉴定;另取第3代ADSCs用于移植,分为两组:ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组、脂肪颗粒1.5 mL组,分别移植于大鼠背部两侧,共移植24只大鼠,分别于2周、1、3个月时脱颈椎处死8只大鼠,再取出背部脂肪组织。结果大鼠ADSCs成脂、成骨诱导后,经油红O、茜素红染色呈阳性,移植2周、1个月时,两组取出的脂肪组织的体积变化不大;但移植3个月后,取背部脂肪组织,称重:脂肪颗粒1.5 mL组平均重量为(0.4551±0.0024)g,而ADSCs(密度为5×107/mL)0.9 mL+脂肪颗粒0.6 mL组的平均重量为(0.7798±0.0033)g,两组脂肪组织的重量差异有统计学意义(P<0.05)。结论原代分离、培养的ADSCs生长状况良好,具有向成脂、成骨分化的能力,与脂肪颗粒混合移植后组织的存活率高,并能够改善脂肪颗粒单独移植时的液化吸收情况。     

体外培养大鼠胰岛细胞的观察

目的：对大鼠胰岛细胞培养方法进行改进并对胰岛细胞进行体外观察。方法：选用 ３～４ 周龄 Ｗ ｉｓｔａｒ 大鼠胰腺,用 ２００ Ｕ／ｍ ｌ的 Ｖ 型胶原酶消化,１０８ μｍ 孔径尼龙筛网滤过消化产物后,得到大小较一致的细胞团,加入含有１１１ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ 葡萄糖的 Ｒ Ｐ Ｍ Ｉ１６４０ 培养液内,进行体外培养。利用倒置相差显微镜、透射电镜、免疫组织化学技术对胰岛 β细胞形态和结构进行观察;应用放射免疫技术对胰岛素进行检测和分析。结果：胰岛细胞可以在体外培养 １７ ｄ。培养初期,细胞形态及分泌功能较稳定;随培养时间延长,细胞逐渐破碎死亡,上清液内胰岛素水平也持续下降。结论：改进后的胰岛细胞培养方法简单可靠,细胞培养至 ４８～７２ ｈ 时,可用于实验研究。     

大鼠海马神经元及星形胶质细胞的体外培养

目的：改进大鼠海马神经元、星形胶质细胞及两者混合状态的体外培养方法,获得高纯度的海马神经细胞。方法：选取孕期18~20 d 的SD 大鼠胎鼠作为原代海马细胞培养的材料来源。断头后于冰板上剥离双侧海马,去除表面血管及薄膜,利用眼科剪分离为小块。随后使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,将海马组织碎块移入酶消化液中。本方法选择Accutase 和0.1% DNase 作为酶消化液,37 ℃消化 15 min,期间轻柔振动。使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,终止消化。0.1% DNase 加入Neurobasal 和B-27 的混合液对消化后的海马组织碎块进行轻柔吹打,获得单细胞悬液。将悬液过200 目筛,进行细胞计数。将过筛的单细胞悬液移入DMEM 培养基（DMEM+10%胎牛血清）中,按照每平方厘米2.5×104 的细胞密度进行接种。经PDL 孵育的塑料片置于培养基底部。细胞于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。4 h 后,依据所需细胞种类的不同,更换相应培养基。海马神经细胞于培养后7~10 d 可用于实验。结果：通过本方法可得到高纯度的大鼠海马神经细胞,且根据实验需求,通过更换培养基,可得到纯神经元、纯胶质细胞及两者混合的三种培养状态。培养的神经元及星形胶质细胞纯度均>98%。结论：该文在传统海马神经细胞体外培养方法基础上,进一步降低了实验操作难度,方法稳定有效。     

胎鼠肝nestin阳性细胞的分离培养和诱导分化研究

目的建立胎鼠肝nestin阳性细胞的体外分离、培养和诱导分化的方法。方法采用机械分离法结合悬滴培养法获得胎肝干细胞,原代培养2d后改变培养基,添加含20%胎牛血清的DMEM(含25ml/L葡萄糖,100U/ml青链霉素,pH值7.6),添加烟酰胺10mmol/L,胰岛素1mg/L,N2添加剂,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、干细胞因子、白血病抑制因子各20μg/L诱导分化为nestin阳性细胞。结果和结论大鼠胎肝内存在nestin阳性细胞,在体外扩增后加入诱导剂可定向分化为胰岛β细胞。     

体外诱导成体大鼠骨骼肌组织来源的干细胞向神经干细胞的转化

目的研究成体Sprague-Dawley(SD)大鼠骨骼肌来源的干细胞(MDSCs)体外诱导向神经干细胞(NSCs)分化的可行性。方法通过酶消化和连续贴壁的方法体外分离成年SD大鼠腓肠肌中的MDSCs。当传代至4-6代时,加入神经干细胞的特殊培养基Neurobasal-A和细胞因子进行诱导分化。用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR方法进行鉴定。结果MDSCs在神经干细胞特殊培养基中培养7~10 d后可形成类似神经球的细胞聚集物。运用免疫细胞化学、Western blot以及realtime-PCR检测发现MDSCs的标记蛋白结蛋白(desmin)表达下调,NSCs的特异性抗原神经巢蛋白(Nestin)开始表达。结论在神经干细胞的特殊培养基培养7~10 d后,MDSCs能够向神经干细胞转化。这种现象提示MDSCs有可能作为治疗神经系统疾病尤其是神经退行性疾病的一种新的干细胞来源。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

加速溶剂萃取-HPLC-TOF/MS法同时测定重楼中6种甾体皂苷类成分

目的引入加速溶剂萃取(accelerated solvent extraction, ASE)技术,并结合HPLC-TOF/MS法同时测定重楼中6种甾体皂苷类成分的含量。方法加速溶剂萃取仪在120℃、1.17 MPa (1 700 psi)压力下,用70%的乙醇静态萃取样品6 min;6种重楼皂苷的含量用HPLC-TOF/MS同时测定,色谱柱: MGC18柱(3.0 mm×100 mm,3.0 μm);流动相: 乙腈与0.1%(V/V)甲酸水,梯度洗脱;流速: 0.8 ml/min;柱温: 25℃;进样量: 3 μl;离子源: ESI正离子模式;雾化气压力: 275.85 kPa(40 psi);干燥气流速: 10 L/min;干燥气温度: 350℃。结果重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、薯蓣皂苷和纤细薯蓣皂苷的线性范围(μg/ml)分别为: 0.500 0~50.00(r=0.999 8)、0.422 3~42.23(r=0.999 7)、0.612 0~61.20(r=0.999 9)、0.714 0~71.40(r=0.999 5)、0.448 0~44.80(r=0.999 9)和0.436 0~43.60(r=0.999 7);各成分的平均回收率(n=6)分别为98.9%、98.0%、102.5%、101.9%、103.1%和97.9%。结论该法溶剂消耗少、耗时短、便于自动化,可实现高通量分析,可用于重楼中皂苷类成分的含量测定。     

大鼠足细胞的原代培养及其Nephrin的特异表达

目的 建立简便的大鼠足细胞原代培养体系,检测其去氧肾上腺素(Nephrin) mRNA及蛋白的表达水平.方法 无菌取肾,分离肾皮质,胶原酶消化法分离肾小球,培养9～10d,胰蛋白酶差异消化法传代,过筛去除肾小球继续培养5～7 d:形态学观察和间接免疫荧光法进行足细胞鉴定;流式细胞仪分析足细胞纯度;实时定量PCR(qRT-PCR)、间接免疫荧光法和Western blot法比较前三代足细胞中Nephrin mRNA及蛋白的表达水平.结果 接种5d后大部分肾小球贴壁,肾小球周围有细胞爬出,其最外缘有树枝状细胞分布,形态学及特异性抗体Nephrin、WT-1鉴定为足细胞;流式细胞仪分析足细胞纯度为94.7％;间接免疫荧光和qRT-PCR均显示:与第二、三代足细胞相比,第一代足细胞中Nephrin mRNA和蛋白表达均较高(均P＜0.05);Western blot示体外培养大鼠足细胞表达两种分子量的Nephrin,且第一代足细胞Nephrin灰度值高于第二、三代足细胞(P＜0.05).结论 酶消化法结合差异过筛法接种可促进肾小球贴壁,有利于培养纯度高的足细胞;大鼠足细胞体外培养条件下能特异性表达Nephrin结构及功能蛋白.     

牛视网膜毛细血管周细胞的原代培养

目的：建立牛视网膜毛细血管周细胞原代培养的方法。 方法：以酶消化法原代培养牛视网膜毛细血管周细胞,用透射电镜和免疫细胞化学法对细胞 进行鉴定。 结果：培养的周细胞贴壁生长,胞体肥大,呈不规则状、有较多突起。细胞生长缓慢,呈现非接触抑制的重叠状生长。电镜下周细胞核大、不规则、有切迹,可见多个核仁。细胞表面有微绒毛,胞质内有丰富的细胞器,无Ⅷ因子小体;免疫细胞化学显示细胞呈平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性,Ⅷ因子相关抗原阴性。 结论：酶消化法原代培养牛视网膜周细胞是一种稳定、可靠的方法。