应用手足口病病原体验证改良的DNase-SISPA方法检测未知病毒感染的特异性

目的以引起手足口病的肠道病毒EV71为研究对象,在DNaseI-非序列依赖的单引物扩增技术的基础上建立感染性疾病RNA病毒性病原体的检测方法。方法根据卫生部发布的《手足口病预防控制指南》(2008年版)附件手足口病实验室检测方案(试行),收集临床诊断手足口病的患儿粪便,经实验室RT-PCR检测阳性后,进行过滤、DNase消化处理。反转录、合成病毒RNA的双链cDNA,Taq I酶切双链cDNA,加接头分子,并以接头分子为引物非特异扩增病原基因,测序并进行序列分析。结果非序列依赖的单引物扩增粪便标本中外源核酸得到多个DNA片段;将所有PCR产物克隆测序,有的序列与已知病原EV71基因序列同源性达99%;有的序列与单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) strain CDC 54007同源性达81%。结论应用DNase处理及非序列依赖的单引物扩增方法可以检测粪便标本中的RNA病毒性病原,并应用该改良技术检测到单核细胞增生李斯特菌。     

依赖核酸序列扩增技术检测呼吸道合胞病毒方法的建立

目的建立依赖核酸序列扩增技术(NASBA)检测呼吸道合胞病毒(RSV)的方法。方法依据美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因数据库,利用Primer 5软件进行RSV特异性引物设计。收集经免疫荧光法检测确认RSV阳性的咽拭子样本,以同批检测RSV阴性样本作为阴性对照。优化样本处理条件和扩增反应体系,建立NASBA检测RSV的方法,并与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行比较。结果采用直接冻融法处理咽拭子样本,取上清检测;引物设计原则为引物加T7启动子序列。NASBA在RSV RNA标准品浓度为2.81×102拷贝/μL时仍能检测出目的片段,而RT-PCR在2.81×104拷贝/μL时目的条带隐约可见,提示NASBA的灵敏度比RT-PCR高出至少100倍。NASBA在7例RSV阳性咽拭子样本中特异性扩增出RSV RNA,而在其他病毒阳性(包括流感病毒A阳性2例、副流感病毒3阳性2例、腺病毒阳性1例)及RSV阴性(3例)样本中未见目的条带,提示NASBA的特异性较高。结论建立的NASBA特异性强、灵敏度高、耗时相对较短,克服了目前实验室病毒检测方法的局限性,为RSV的检测提供了有效的实验室检测手段。     

链置换扩增术(SDA)及其进展

链置换扩大增术（stranddisplacementamplification,SDA）是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列,核酸内切酶在其识别位点将双链DNA打开缺口,DNA聚合酶继之延伸缺口的3’端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行,使靶序列被高效扩增。本文主要介绍SDA的原理及其发展。     

2种RT-PCR技术检测肠道病毒RNA的对比研究

目的　比较 2种逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术检测脑脊液中肠道病毒 (EV)RNA。方法　设计与肠道病毒基因组保守的 5′非编码区同源的引物。方法A :采用AMV逆转录酶和TaqDNA聚合酶 ,逆转录合成cDNA与PCR在不同缓冲体系中分别完成 ;方法B :AMV逆转录酶和TflDNA聚合酶同时加入 ,逆转录与PCR在同一缓冲体系中进行 ,逆转录后不打开反应管。结果　通过检测不同稀释度的PV1、CVB3和CVB4病毒及无菌性脑膜炎病人CSF中EVRNA ,证明 2种方法有相同的敏感性 ,而方法B在逆转录后不需打开反应管 ,降低了污染的危险 ,更便于自动化操作。结论　 2种RT PCR技术均是检测EV感染的有效方法 ,方法B更值得推广应用     

实时荧光定量PCR检测HIV-1逆转录酶活性方法的建立

目的 体外模拟HIV-1的逆转录起始过程,建立实时荧光定量PCR测定HIV-1逆转录(RT)酶活性的方法.方法 以人类基因组DNA为模板PCR扩增得到tRNALys+3基因,在其5'端加入T7转录启动子,应用T7 RNA聚合酶转录得到cRNA;以HIV-1感染性克隆为模板PCR扩增得到HIV的5'-LTR-PBS,将其克隆连接至pGEM-T easy载体上,利用SP6 RNA聚合酶转录得到SP6-5'-LTR-PBScRNA;分别应用两种标准RT酶(SuperScript Ⅲ和HIV-1标准RT酶)催化体外逆转录反应合成相应cDNA.实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,进而得出逆转录酶的相对活性.结果 成功获得长度为93 bp的tRNALys-3引物和872 bp的SP6-5'-LTR-PBS RNA模板.将SuperScriptⅢ和HIV-1标准RT酶分别按1:10、1:100、1:1 000、1:10 000比例稀释后催化逆转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的逆转录产物cDNA,其循环阈值分别为13.9、18.3、20.9、24.9和20.4、25.5、28.7、32.5.结论 成功模拟HIV-1逆转录的起始过程并建立了基于实时荧光定量PCR检测RT酶活性的新型方法,为临床治疗、新药筛选和耐药检测提供了参考指标.     

NASBA(核酸序列依赖的扩增)及其在医学上的应用

NASBA（Nucleicacidsequence－basedamplification）即核酸序列依赖的扩增，是一种扩增RAN的新技术，是由一对引物引导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在42℃进行，可以在2h左右将模板RNA扩增约109倍，不需特殊的仪器。本文就NASBA的原理、特点及实际应用作了介绍。     

风湿性心脏病心肌组织噬菌体表达文库的构建和分析

目的:构建风湿性心脏病患者心脏组织噬菌体表达文库.方法:外科手术治疗中取风湿性心脏病患者新鲜心耳组织,用QIAGEN试剂盒提取RNA,用逆转录酶合成cDNA第一链,用长距离PCR合成双链cDNA,SfiⅠ酶切cDNA后过柱分级收集,用T4 DNA连接酶重组连接入λTriplEx2载体,最后用λ噬菌体包装后构建成原始文库,用PCR、X-gal等方法进行文库质量鉴定.结果:构建了风湿性心脏病心肌组织噬菌体表达文库,原始文库滴度为3.3×106 pfu/mL,重组率为99％,81.25％外源重组片段大于1 kb.结论:成功构建了高质量的风湿性心脏病患者心肌组织噬菌体表达文库,为风湿性心脏病的分子机制寻找新的研究策略奠定了实验基础.     

大鼠agrin基因实时定量聚合酶链反应的检测方法

目的:agrin基因对神经肌肉接头的形成、维持起着决定作用,也对神经元轴突的形成、延长、维持有重要作用,其表达产物在机体内分布广泛.设计绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法,并检测其特异性、敏感性和可重复性.方法:实验于2007-04/11在吉林大学基础医学院三综合实验室和吉林大学第一医院传染科实验室完成.以Primer 3软件设计大鼠agrin基因、ACTB基因mRNA嵌合荧光实时定量聚合酶链反应检测引物,经检索Blast验证特异性,并以Primer 5设计构建agrin基因标准品引物.选择清洁级Wistar大鼠交配,获取3日龄乳鼠,取脑,获取mRNA、cDNA,常规反转录-聚合酶链反应获取agrin 554个碱基DNA片断.PCR填加T7启动子后,T7 RNA Polymerase合成agrin基因标准品,消化模板.分光光度计测定其浓度,1∶5倍比稀释3次;经反转录反应合成agrin基因cDNA标准品,测序验证特异性.以ACTB引物反转录cDNA,1∶5倍稀释3次,构建ACTB基因标准品.常规聚合酶链反应确定、优化反应条件.标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性,融解曲线验证检测方法的特异性,作重复性检测.结果:①agrin基因有意义链引物序列:GAA GGC CAG GTG CGA ATC A,反义链引物序列:CAC AGG TAG CAG TGG AGC CAA G,内标:ACTB基因有意义链引物序列:GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA,反义链引物序列:GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG,优化反应条件:95 ℃变性5 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s.②agrin基因、ACTB基因标准品所获得的标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性均＞ 0.95.③聚合酶链反应产物电泳、测序、实时定量聚合酶链反应融解曲线证明特异性高、重复性好、灵敏度达到精确定量要求.结论:绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法可以作为大鼠agrin基因mRNA检测的标准方法.     

乳腺癌T7噬菌体展示文库的构建

目的本研究拟构建人乳腺癌T7噬菌体展示文库,为进一步筛选特异性高的乳腺癌分子标志物原奠定基础。方法确诊乳腺癌患者手术标本20例,Trizol法提取总RNA,逆转录合成双链cDNA后,与T7Select 10-3载体连接,体外包装并扩增得到人乳腺癌T7噬菌体展示cDNA文库。结果构建了乳腺癌T7噬菌体展示cDNA文库,文库滴度2.1×107pfu/ml。随机从文库抽取50个克隆PCR扩增插入片段,电泳结果显示乳腺癌文库插入率98%(49/50)。结论成功构建了乳腺癌T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选和鉴定乳腺癌相关抗原奠定基础。     

大鼠agrin基因实时定量聚合酶链反应的检测方法

目的：agrin基因对神经肌肉接l头的形成、维持起着决定作用，也对神经元轴突的形成、延长、维持有重要作用．其表达产物在机体内分布广泛。设计绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法，并检测其特异性、敏感性和可重复性。 方法：实验于2007—04／11在吉林大学基础医学院三综合实验室和吉林大学第一医院传染科实验室完成。以Primer 3软件设计大鼠agrin基因、ACTB基因mRNA嵌合荧光实时定量聚合酶链反应检测引物，经检索Blast验证特异性，并以Primer5设计构建agrin基因标准品引物。选择清洁级Wistar大鼠交配，获取3日龄乳鼠，取脑，获取mRNA、cDNA，常规反转录一聚合酶链反应获取agrin554个碱基DNA片断。PCR填加T7启动子后，T7 RNA Polymerase合成agrin基因标准品，消化模板。分光光度计测定其浓度，1：5倍比稀释3次；经反转录反应合成agrin基因cDNA标准品，测序验证特异性。以ACTB引物反转录cDNA，1：5倍稀释3次，构建ACTB基因标准品。常规聚合酶链反应确定、优化反应条件。标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性，融解曲线验证检测方法的特异性，作重复性检测。 结果：①agrin基因有意义链引物序列：GAA GGC CAG GTG CGA ATC A，反义链引物序列：CAC AGG TAG CAG TGG AGC CAA G，内标：ACTB基因有意义链引物序列：GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA，反义链引物序列：GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG，优化反应条件：95℃变性5S，60℃退火20S，72℃延伸20s。②agrin基因、ACTB基因标准品所获得的标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性均〉0．95。③聚合酶链反应产物电泳、测序、实时定量聚合酶链反应融解曲线证明特异性高、重复性好、灵敏度达到精确定量要求。 结论：绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法可以作为大鼠agrin基因mRNA检测的标准方法。     

病毒载量实时扩增检测技术的研究进展

近年来 ,运用基因扩增技术对病毒进行定性或定量检测已取得了巨大进步 ,尤其是定量检测技术的发展 ,使得临床能够更加有效地监测患者治疗效果、是否有耐药性发生等病情 ,并可依据病毒荷载量的变化合理地解释病情的变化[1 3 ] 。目前实验室常用的基因扩增技术包括PCR技术和核酸序列依赖的扩增 (nucleicacidsequence basedamplification ,NASBA)技术。PCR技术可以以DNA或RNA为模板 ,以RNA为模板时要先进行逆转录反应 ,实时检测策略可以使用SYBRGreenI、杂交探针、分子信标或TaqMan探针等 ;NASBA技术则是一种专以RNA为模板的扩…     

环介导等温扩增技术的应用

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换型DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温65℃左右保温几十分钟快速进行核酸扩增的方法.由于其具有快速、简便、特异性好、灵敏度高、成本低等优...     

人乳腺癌细胞cDNA噬菌体表达文库构建及鉴定

目的:进一步分离人乳腺癌组织特异性表达基因和腺癌特异性相关基因。方法:采用SMART技术,构建人乳腺癌细胞cDNA噬菌体表达文库,从人乳腺癌细胞中分离总RNA并纯化mRNA,利用经修饰的oligo(dT)引物合成cDNA第一链,利用SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA5′端延伸出去的模板,采用LD-PCR合成双链cDNA,双链cDNA经酶切和过柱分级分离后,克隆入λTriplEx2载体后经体外包装而成cDNA文库。结果:原始人乳腺癌细胞cDNA噬菌体表达文库获得1.68×107个重组子,重组率达到98%。文库扩增后,滴度达到4.2×109pfu/mL,插入cDNA平均长度为2800bp。结论:构建的人乳腺癌细胞cDNA噬菌体表达文库具有良好的质量,该cDNA文库为进一步筛选乳腺癌抑癌基因及乳腺癌特异性表达基因奠定了基础。     

核酸依赖性扩增技术研究现状及展望

自19世纪90年代以来,等温核酸扩增技术及其衍生技术迅速发展。等温核酸扩增技术的流程简易、成本和应用要求更低,应用前景广泛。其中,核酸依赖性扩增技术(NASBA)已广泛用于病原体检测、单核苷酸突变检测和环境监测等领域。本文主要对近5年来NASBA技术的研究进展及其在分子诊断中的应用进行综述,探讨NASBA技术的前景与瓶颈。     

大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体的构建与测序

[目的]构建测序大鼠视黄醇结合蛋白-1(CRBP-1)基因短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体.[方法]针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1基因RNA干扰(RNAi)有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒裁体,命名为Lv-shCRBP-1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.[结果]PCR鉴定与DNA测序证实合成的Lv-shCRBP-1寡核苷酸链插入正确.[结论]成功构建大鼠CRBP-1基因shRNA慢病毒载体.     

低密度脂蛋白受体基因全长cDNA 序列分析法检测1例家族性高胆固醇血症患儿基因突变

目的建立低密度脂蛋白受体(LDLR)基因全长cDNA序列分析方法并对1例家族性高胆固醇血症(FH)患儿进行基因检测。方法设计7对LDLR基因cDNA引物并验证;对1例临床诊断为FH的患儿进行家系调查和临床体检,提取外周血DNA和RNA,DNA扩增结合测序分析LDLR基因并找出其突变位点;RNA经PCR反转录为cDNA后扩增LDLR基因,将扩增产物进行正、反双向核苷酸序列分析,并与GenBank中LDLR基因的正常序列对比找出突变位点后与传统DNA测序方法结果比对。结果 LDLR基因全长cDNA序列分析方法检测LDLR基因为2 583个碱基,与标准序列完全一致;本例患儿确诊为"FH纯合子",cDNA测序结果与传统DNA测序结果相符,均为第2外显子终止突变和第6外显子点突变及框移突变。结论 LDLR基因全长cDNA序列分析法检测FH患儿突变,与传统DNA方法检测结果相符,可为FH的基因诊断提供新的方法依据。     

感染性眼病中病原菌的PCR诊断技术

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)又称为无细胞分子克隆技术，将扩增的两条DNA链作为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物介导，以4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)为底物，通过DNA多聚酶酶促反应，于体外快速扩增特异性DNA序列。一般样品经2～4h(20～30周期)后，DNA片段可扩增百万倍以上，然后采用其它的核酸分子检测手段，可从极微量的样品中获得足够DNA供分析研究，检出灵敏度可达10^-5pg，是最灵敏、可靠的现代分子生物学技术之一。     

不同亚型神经细胞黏附分子重组质粒的构建及鉴定

目的:构建不同亚型神经细胞黏附分子(NCAM)的重组质粒载体.方法:取成年小鼠大脑皮质提取总RNA,以提取的总RNA为模板,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到NCAM-120cDNA、NCAM-140cDNA和NCAM-180cDNA后用Xba Ⅰ、HindⅢ酶切,在T4DNA连接酶的作用下,将酶切产物定向插入于质粒pcDNA4相应位点中,经PCR、酶切及测序鉴定其序列正确性.结果:PCR、酶切和测序鉴定证实pcDNA4-NCAM-120、pcDNA4-NCAM-140及pcDNA4-NCAM-180构建成功.结论:成功构建pcDNA4-NCAM-120、pcDNA4-NCAM-140和pcDNA4-NCAM-180的重组质粒,有助于进一步研究不同亚型NCAM的作用及其作用的差异性.     

多聚酶链反应技术及其在临床血液学上的应用

多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种在体外由引物(primers)介导的特定DNA序列的酶扩增,又称基因扩增.这种技术能在数小时内合成一百多万个特定DNA序列考贝,既敏感,又快速、方便.因此,虽然PCR于1985年底首见报道,但其应用日趋广泛.本文就PCR原理、基本过程及其在临床血液学上的应用作一综述.PCR原理PCR扩增的DNA片段的特异性基于两个寡核苷酸引物,这两个引物位于待扩增的DNA片段的两侧,并与相应的DNA链互补.该过程包括:DNA热变性使之成为单链状,然后退火,使引物连接于与引物互补的特定DNA链上,再在DNA多聚酶的作用