血友病的携带者与产前分子诊断

目的：建立一种简便、快速的血友病携带者检测与产前诊断体系。方法：用聚合酶链反应(PCR)方法分别检测FⅧ内含子22倒位及血友病A家系中FⅧ基因内的BclⅠ位点、内含子13和22中STR和FⅧ基因外的DXS 52(ST14)位点的多态性；对血友病B家系检测FⅨ基因外6个STR位点(DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXSS013、DXS1227、DXS102)的多态性。结果：综合应用直接检测倒位和遗传连锁分析。21个血友病A家系的可诊断率为94．7％；联合FⅨ基因外6个STR位点对血友病B家系进行遗传连锁分析。使10个家系全部得到诊断。结论：FⅧ内含子22倒位检测阳性，可以直接诊断血友病A的携带者及患儿；检测FⅧ基因内、外及FⅨ基因外多个位点的多态性并进行遗传连锁分析，是血友病携带者检测与产前诊断的简便、快速的方法。     

血友病A携带者检测与产前诊断

目的 建立简便、快速的血友病A携带者检测与产前诊断体系。方法 用PCR方法直接检测FⅧ内含子22倒位或对FⅧ基因内的BclⅠ位点、内含子13和22中STR和FⅧ基因外的DXS52（ST14）位点的多态性进行遗传连锁分析。结果 应用内含子22例位的直接诊断率为47．6％;Bcl Ⅰ位点的可诊断率为27．8％;内含子13和22中STR的可诊断率分别为28．6％及29．4％;DCS52的可诊断率为81．3％;综合应用直接诊断和间接遗传连锁分析,对21个家系进行检测,可诊断率为94．7％。结论 血友病A的携带者检测与产前诊断可先进行内含子22倒位的检测,若结果为阳性即可作出诊断;若内含子22例位的检测结果为阴性,则可利用FⅧ基因内、外的多个位点多态性结果进行遗传连锁分析,以作出最终的诊断。     

两个特殊血友病A患者家系的基因诊断

目的 探讨特殊血友病A(HA)家系的基因诊断。方法 用内含子22倒位检测及FⅧ基因内外4个位点的多态性进行遗传连锁分析;用核酸直接测序法对FⅧ各外显子及其侧翼序列进行检测。结果 家系1先证者表型为重型HA,FⅧ内含子22倒位检测及FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析未获得诊断信息;直接核酸测序证实先证者及其妹FⅧ基因24号外显子第2209位氨基酸存在R2209Q错义突变,后者胎儿DNA检测为正常男性。家系2中HA先证者已去世,一名要求做携带者检测的女性表型正常,内含子22倒位检测及直接核酸测序没有发现基因缺陷,用FⅧ基因内外4个位点的多态性遗传连锁分析均显示该成员未携带血友病A基因。结论 联合应用直接核酸测序法及多态性遗传连锁分析可以对特殊血友病A家系进行基因诊断。     

血友病携带者与产前基因诊断

目的建立1种简便、快速的血友病携带者检测与产前诊断体系。方法对38个血友病A家系,用长链PCR及序列特异PCR作F8基因内含子22及1倒位检测;有家族史家系可联合F8基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析,DXS 52(ST14)位点多态性以PCR产物凝胶电泳法检测,7个STR位点(F8C ivs13、CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108)的多态性以多重荧光PCR法检测,产前诊断加用性别位点(Amelo);对于散发家系,通过直接核苷酸测序查找先证者的基因突变,继而对家系女性成员作携带者与产前诊断。对12个血友病B家系采用直接核苷酸测序法确定基因突变,多重荧光PCR法检测F9基因外6个STR位点(DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102)的多态性。结果38个血友病A家系中,10名先证者的F8基因内含子22倒位检测为阳性,1例先证者为F8基因内含子1倒位阳性,对于有家族史的家系,综合应用倒位检测和遗传连锁分析,携带者与产前诊断率均为100%;4个散发家系均可找到致病突变;38个血友病A家系的携带者及产前诊断总诊断率为94.81%。12个血友病B家系中有10个家系通过直接测序可找到突变,联合F9基因外6个STR位点对血友病B家系的遗传连锁分析的可诊断率为96.88%。结论F8基因内含子22及1倒位筛检联合F8基因内、外多个位点的遗传连锁分析可以进行血友病A的携带者及产前诊断;直接核苷酸测序可确定F9基因突变,而联合基因外多个多态性位点检测并进行遗传连锁分析,是血友病B携带者检测与产前诊断的简便、快速的方法。     

血友病A／B的携带者和产前诊断研究

目的：建立一套简易、快速且准确率高的血友病携带者和产前诊断体系。方法：对血友病A（HA）家系采用长距离聚合酶链反应（LD-PCR）及序列特异PCR进行F8基因内含子22及内含子1倒位检测。对有家族史的HA家系可联合F8基因内外的8个多态性位点进行遗传连锁分析．产前诊断加测性别位点（Amelo）。而对散发家系，则通过直接核苷酸测序查找先证者的基因突变，继而对家系女性成员进行携带者与产前诊断。对血友病B（HB）家系，采用直接核苷酸测序法确定其基因突变．结果：100个HA家系中。22例先证者的F8基因内含子22倒位检测结果为阳性；2例患者母亲为F8基因内含子1倒位的携带者：对有家族史的家系，综合应用倒位检测和遗传连锁分析，携带者与产前诊断率均为100％。34个HA散发家系除2个家系外均可找到致病突变：发现可能携带者105例，产前诊断65例，总诊断率为95．9％：23个HB家系中19个家系通过直接测序可找到突变．而联合F9基因外6个STR位点对HB家系进行遗传连锁分析，发现31例可能携带者及需产前诊断者16例，总诊断率为95．7％。结论：F8基因内含子22及1倒位筛检联合F8基因内、外多个位点的遗传连锁分析．可作为HA的携带者检测及产前诊断的方法；直接核苷酸测序可确定F9基因突变．而联合基因外多个多态性位点检测并进行遗传连锁分析．是HB携带者检测及产前诊断的简便、快速方法。     

一例凝血因子Ⅷ1680A→G点突变

为了研究在无内含子２２倒位的甲型血友病中的ＦⅧ基因的其他遗传性点突变。应用变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）、单链构象多态性（ＳＳＣＰ）对５１例无内含子２２倒位的甲型血友病患者的ＦⅧ基因外显子１４３′侧进行研究。结果发现一例遗传性点突变，密码子１６８０ＴＡＴ（酪）→ＴＧＴ（半胱）的突变。阐明甲型血友病的点突变有助于了解ＦⅧ蛋白各功能域的精细功能，为甲型血友病家系携带者检测和产前诊断提供一种有价值的方法     

一例凝血因子Ⅷ1680A→C点突变

为了研究在无内含子２２倒位的甲因友病中的ＦⅧ基因的基他遗传性点突变。应用变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）、单链构象多态性（ＳＳＣＰ）对５１例无内含子２２倒位的甲型血友病患者的ＦⅧ基因外显子１４３＇侧进行研究。结果发现一例遗传性点突变，密码子１６８０ＴＡ（酷）→ＴＧＴ（半胱）的突变。阐明甲型血友病的点突变有助于了解ＦⅧ蛋白各功能域的精细功能，为甲型血友病家系携带者检测和产前诊断提供一种有价值的方法。     

无先证者血友病A家系的基因诊断

目的 :探讨无先证者血友病A(hemophilia A,HA)家系的基因诊断。方法 :对5个无先证者的HA家系,采用长距离PCR及序列特异PCR直接检测疑似携带者的凝血因子Ⅷ(coagulation factorⅧ,FⅧ)基因内含子22倒位及1倒位;对其中未检测出的家系通过联合FⅧ基因内外的7个STR位点(FⅧCivs13、Intron25、3_486、5_147、5_226、DXS8069、DXS1073)进行遗传连锁分析,对于有产前诊断要求的孕妇则结合其男性胎儿脐带血的FⅧ活性检测结果作出分析。结果 :5个HA家系中,有3例疑似携带者的FⅧ基因内含子22倒位检测结果为阳性,1例疑似携带者的FⅧ基因内含子1倒位检测结果为阳性。对于另1例22倒位、1倒位检测结果均为阴性但有产前诊断要求的孕妇,通过联合FⅧ基因内外的7个STR位点进行遗传连锁分析,发现胎儿是携带1条致病X染色体的男性,且胎儿脐带血的FⅧ活性为1%,故联合诊断胎儿为男性HA患者。结论:在无HA先证者情况下,通过FⅧ基因内含子22及1倒位筛检,联合FⅧ基因内、外多个位点的遗传连锁分析及胎儿脐带血FⅧ活性检测,可为家系女性携带者的诊断及产前诊断提供有用信息。     

两个同源重组血友病家系的基因诊断

目的探讨特殊血友病家系的基因诊断。方法通过FⅧ基因内含子22倒位及内含子1倒位的直接检测与遗传连锁分析的间接诊断相结合对1个血友病A（HA）家系进行基因诊断；采用核酸直接测序法对FⅨ各外显子及其侧翼序列进行检测，并联合FⅨ基因相关的6个微卫星（STR）位点对1个血友病B（HB）家系进行基因诊断。结果HA家系先证者为FⅧ内含子1倒位阳性，家系中要求做携带者诊断的女性成员为内含子1倒位携带者；而FⅧ基因内外8个多态性位点遗传连锁分析证实该女性成员发生同源染色体重组。HB家系先证者除7号外显子测序未成功外，其余部分均未找到突变，家系中要求做携带者与产前诊断的女性，其羊水细胞经直接核酸测序未找到突变，利用FⅨ相关的6个STR位点进行遗传连锁分析发现该女性有染色体同源重组现象存在，胎儿为正常男性。结论在应用间接诊断方法进行HA和HB的携带者及产前基因诊断时，要考虑到染色体同源重组现象的发生可能导致误诊与漏诊的情况。在中国人群中应该开发更多的FⅧ和FⅨ分子中信息量大的多态性位点，以提高HA和HB的携带者及产前诊断的准确率。     

FⅧ基因内二核苷酸重复序列在中国人群中多态性的研究与血友病甲基因诊断

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）和ＤＮＡ序列分析技术对中国人群中ＦⅧ基因１３内含子（ＣＡ）ｎ二核苷酸重复序列多态性进行了研究。结果显示，中国人群中该位点存在明显的多态性，共有７种等位片段，（ＣＡ）ｎ拷贝数分别为１８，１９，２０，２１，２２，２３和２４。频率分布在０．００８～０．４９６，多态信息量为６４．６％。利用该位点的多态性对１０个甲型血友病家系进行了连锁分析，其中５个家系可用该多态性区分携带者的正常和有缺陷的ＦⅧ基因，诊断率为５０％。