小檗碱抗肿瘤新生血管形成作用机制的研究

目的：研究小檗碱对bFGF活化人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响，探讨其对肿瘤新生血管形成作用的机制。方法：MTT法检测小檗碱对bFGF活化HUVEC的增殖作用；流式细胞仪检测用药后细胞周期的变化；激光共聚焦扫描显微镜下观察药物对细胞形态、细胞内钙的影响；流式细胞仪检测小檗碱对细胞凋亡的作用。结果：小檗碱能明显抑制bFGF活化的HUVEC增殖，且存在剂量依赖关系；使细胞在G0-G1期的比例明显增多；使细胞核浓缩、甚至裂解成碎块，同时使细胞内钙增多；并诱导活化HUVEC发生细胞凋亡。结论：小檗碱可能通过将bFGF活化的HUVEC细胞周期阻滞在G0-G1期，抑制活化HUVEC的增殖：诱导活化HUVEC细胞发生凋亡等机制，阻止新生血管形成，发挥其抗肿瘤作用。     

重组人促红细胞生成素对人脐静脉内皮细胞PCNA表达的影响

目的研究重组人促红细胞生成素（rHuEPO）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的影响。方法从脐静脉体外分离培养HUVEC，采用细胞培养及免疫组织化学方法检测不同剂量rHuEP0（10U／ml、20U／ml、40U／m1）对HUVEC增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响。结果对组照及10U／ml、20U／ml、40U／mlrHuEP0实验组内皮细胞PCNA阳性表达百分率分别为（31±3）％、（40±5）％、（68±6）％和（65±5）％，与对照组相比，rHuEPO作用后内皮细胞PCNA表达明显增强（P〈0．05），且随rHuEPO剂量提高作用增强，呈剂量效应关系。结论rHuEP0可促进体外培养内皮细胞增殖。     

蜂胶水提液对体外培养的血管内皮细胞凋亡的影响

目的：探讨泰山蜂胶水提液对一定浓度的肿瘤坏死因子-α诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的作用。方法:用消化灌注法收集人脐静脉内皮细胞进行体外原代培养，用终浓度为50 μg/L的肿瘤坏死因子-α诱导其凋亡，培养液中分别加入终浓度为50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的蜂胶水提液干预，共同孵育24h，用流式细胞仪和缺口末端标记技术TUNEL检测细胞凋亡率。结果:模型组内皮细胞凋亡率均明显高于对照组，不同浓度蜂胶组内皮细胞凋亡率明显低于模型组（P＜0.01）。结论:泰山蜂胶水提液能抑制肿瘤坏死因子-α诱导的人脐静脉内皮细胞的凋亡，从而起到保护血管内皮细胞的作用。     

鼠内皮抑素基因腺病毒载体的构建及对血管内皮细胞的生长抑制

构建含鼠内皮抑素基因的腺病毒载体（pAd／mEnd），并观察内皮抑素蛋白对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）的生长抑制、细胞周期和凋亡的影响。结果发现pAd／mEnd感染BEL7402细胞后，能有效表达内皮抑素蛋白，显著抑制HUVEC增殖，阻滞HUVEC细胞S期，凋亡指数显著增加。     

小檗碱对高转移性人巨细胞肺癌PG细胞黏附特性的影响

目的：研究小檗碱对高转移性人巨细胞肺癌PG细胞黏附特性的影响，以探讨其抑制肿瘤侵袭转移的可能机制。方法：小檗碱（5、10μg／m1）处理PG细胞24小时，采用MTF法观察PC细胞与PG细胞的黏附（同质黏附），PG细胞与细胞外基质（FN和Martrigel）的黏附；用虎红染色法观察PG细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的黏附。通过SABC免疫细胞化学法及图像分析软件，半定量PG细胞E—cadherin、CD44的表达；RT—PCR法检测PG细胞E-cadherinmRNA和CD44mRNA的表达。结果：小檗碱（10μg/ml）可促进PG细胞的同质黏附（P〈0．05）；小檗碱（5、10μg／ml）可抑制PG细胞与FN和Martrigel的黏附（P〈0．01），并可抑制PG细胞与HUVEC的黏附（P〈0．05．P〈0．01）。经小檗碱（10μg／ml）作用的PG细胞，E-cadherinm及其mRNA表达明显增高（P〈0．01），而CD44及其mRNA的表达明显减少（P〈0．05）。结论：小檗碱通过促进PG细胞E—cadherin的表达而促进PG细胞间的同质黏附，抑制PG细胞CD44的表达而抑制其与细胞外基质及血管内皮细胞的黏附，这可能是小檗碱抗肿瘤转移的机制之一。     

重组人促红细胞生成素对体外培养内皮细胞增殖的影响

目的:研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)对体外培养内皮细胞增殖的影响.方法:从脐静脉体外分离培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),采用形态学观察及Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ-R Ag)检测进行内皮细胞鉴定,免疫组织化学方法检测rhEPO对HUVEC增殖细胞核抗原(PCNA)与细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达变化.结果:rhEPO实验组内皮细胞PCNA与Cyclin D1表达均明显高于对照组.当rhEPO剂量提高到20U/ml时其作用最强.结论:rhEPO对内皮细胞增殖有明显促进作用,这种促进作用町能是其影响血管生成的主要原因之一.     

肿瘤坏死因子a促进人冠状动脉内皮细胞的凋亡

背景：研究表明冠状动脉内皮细胞凋亡参与了动脉粥样硬化的发生、发展过程。 目的：观察肿瘤坏死因子a对人冠状动脉内皮细胞的诱导损伤作用。 方法：取对数生长期的人冠状动脉内皮细胞c-12221,分别加入含0(对照),200,400,600 mg/L肿瘤坏死因子a的培养液,采用MTT检测细胞增殖率变化,Hoechst 33258/PI双染观察凋亡细胞形态变化,Annexin V-FITC和PI双染流式检测细胞凋亡率变化,高内涵活细胞成像系统检测细胞线粒体膜电位变化。 结果与结论：肿瘤坏死因子a呈剂量依赖性抑制人冠状动脉内皮细胞的增殖。Hoechst 33258/PI染色观察可见凋亡细胞染色质凝集、细胞核碎裂成碎片等典型细胞凋亡的特征性变化,不同质量浓度肿瘤坏死因子a组细胞凋亡率高于对照组(P < 0.05),线粒体膜电位低于对照组(P < 0.05),且呈剂量依赖性。表明肿瘤坏死因子a呈剂量依赖性促进人冠状动脉内皮细胞凋亡,抑制其增殖,作用机制与线粒体凋亡通路有关。     

激活素受体样激酶1促进人脐静脉内皮细胞增殖和迁徙

目的： 研究激活素受体样激酶1（ALK1）对人脐静脉内皮细胞的作用。 方法： 体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs），RT-PCR分析ALK1和ALK5在HUVEC激活状态下表达的变化。脂质体转染pcDNA3.1+ALK1到HUVECs，流式细胞仪检测HUVECs增殖的改变，boyden小室检测ALK1对HUVECs迁徙的影响。 结果： ALK1在HUVEC安静状态高表达，ALK1能促进HUVECs的增殖和迁徙。 结论： ALK1通过促进内皮细胞的增殖和迁徙在血管重塑中发挥作用。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体参与雷帕霉素诱导血管内皮细胞功能损伤的体外研究

目的: 探讨雷帕霉素对内皮细胞凋亡和增殖、迁移能力的影响,以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)表达水平的变化。方法: 用浓度为0、1、10、100 μg/L 的雷帕霉素孵育内皮细胞24 h,应用CCK8法检测血管内皮细胞的增殖能力,Transwell小室和划痕试验检测细胞迁移能力,DAPI染色观察凋亡细胞核形态改变,Western blotting法检测caspase-3活性以显示血管内皮细胞的凋亡,并用 Western blotting检测TRAIL在凋亡的内皮细胞中的表达。结果: 雷帕霉素(1-100 μg/L)能诱导血管内皮细胞凋亡并抑制其迁移能力(P<0.01)。除雷帕霉素1 μg/L外, 10 μg/L和100 μg/L雷帕霉素均能抑制内皮细胞增殖能力(P<0.01),同时雷帕霉素(10-100 μg/L)使TRAIL蛋白表达增加,两者作用均呈浓度依赖性(P<0.01)。结论: 雷帕霉素能诱导内皮细胞发生凋亡并抑制其增殖和迁移能力。TRAIL表达上调与雷帕霉素诱导血管内皮细胞损伤有一定的相关性。     

穿心莲内酯对人皮肤基底细胞癌A431细胞生长、凋亡及增值细胞核抗原蛋白表达的影响

目的 探讨穿心莲内酯（AD）对人皮肤基底细胞癌A431细胞生长、凋亡及增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达的影响。方法 应用酸性磷酸酶（APA）法检测细胞增殖抑制率,荧光显微镜观察细胞形态,Annexin V-FITC/PI双染法、流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率, Rh123染色FCM检测细胞线粒体膜电位,免疫细胞化学法检测细胞PCNA蛋白表达。结果AD呈时间、剂量依赖性抑制A431细胞生长增殖;且同一时间点50mg/L、100mg/L AD组与溶媒对照组相比差异显著（P＜0.05）。AD组作用A431细胞24h时,部分细胞核染色质出现典型凋亡形态学改变。不同浓度AD作用A431细胞24h,早期凋亡率、晚期凋亡及坏死率均随AD浓度升高而逐渐增加,且50mg/L、100mg/L AD组与溶媒对照组相比差异显著（P＜0.05）。AD作用A431 24h细胞内PCNA蛋白随AD浓度升高表达逐渐减少。AD作用A431细胞24h后,线粒体膜电位下降明显,与溶媒对照组相比较,50mg/L、100mg/L AD组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 AD可明显抑制A431细胞生长增殖,其抑制细胞增殖可能与下调PCNA蛋白表达有关。AD能诱导A431细胞凋亡,其凋亡机制可能与细胞线粒体膜电位下降有关。     

小檗碱对人高转移肺癌细胞与脐静脉内皮细胞黏附的影响

目的： 探讨小檗碱对人高转移肺癌细胞株PG细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）黏附的影响及其机制。方法：用MTT法检测不同浓度（2.5-40 mg/L）的小檗碱对HUVECs增殖的影响,用2.5、5和10 mg/L小檗碱分别处理人高转移肺癌细胞株PG细胞6、12和24 h, 用虎红染色法测定小檗碱对PG细胞与HUVECs黏附能力的影响, 用荧光抗体染色法测定小檗碱对PG细胞表面黏附分子CD44s表达的影响, 用双光子各向异性度成像系统观察小檗碱对PG细胞膜流动性的影响。结果：（1）2.5、5和10 mg/L小檗碱作用HUVECs 6、12和24 h后对其生长无影响。（2）用不同浓度小檗碱处理PG细胞6、12和24 h后,与TNF-α刺激后的HUVECs相互作用后,能够显著抑制其黏附率,且呈浓度依赖性(P<0.05, P<0.01)。（3）各剂量组的小檗碱均能使PG细胞表面的CD44s分子表达增高（P<0.05或P<0.01）。（4）小檗碱作用PG细胞24 h后能够抑制PG细胞膜的流动性,且随药物浓度的升高这种抑制作用增强。结论：小檗碱对PG细胞与HUVECs的黏附具有抑制作用,可能与小檗碱增加PG细胞表面黏附分子表达、降低其细胞膜流动性有关。     

小檗碱对人高转移肺癌系（PG）细胞增殖的影响及机制研究

目的：通过离体实验初探小檗碱对高转移性人肺癌细胞株（PG）增殖能力的影响，并探讨其作用机制。 方法： 用MTT法测定小檗碱对PG细胞增殖能力的影响。用流式细胞术测定小檗碱对PG细胞细胞周期及凋亡的影响。用激光共聚焦显微镜观察小檗碱诱导PG细胞氧自由基的产生。 结果： 小檗碱能够抑制PG细胞增殖，且随药物浓度增加抑制效应增强，呈浓度依赖性(P<0.05，P<0.01)。小檗碱对PG细胞细胞周期具有阻滞作用，40 mg/L的小檗碱能引起PG细胞的凋亡。小檗碱作用6 h、12 h只有在终浓度大于或等于10 mg/L时开始产生氧自由基，低浓度的小檗碱作用24h后就能诱导氧自由基的产生。 结论： 小檗碱对PG细胞增殖具有抑制作用，后者可能与调节细胞内活性氧自由基产生从而影响细胞周期进程有关。     

活化蛋白C对脂多糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞凋亡的影响研究

目的：观察不同剂量活化蛋白C(APC)对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）凋亡的作用。方法:将培养成功的HUVECs通过LPS（1 mg/L）孵育诱导细胞凋亡模型，并给予APC（10 μg/L）或APC（50 μg/L）建立药物治疗组，同时设立正常对照细胞组和单独LPS（1 mg/L）诱导细胞凋亡组。应用电镜观察细胞超微结构；DNA ladder与TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡情况；Annexin-Ⅴ/PI双标记行流式细胞仪测定定量观察细胞凋亡率。同时采用MTT法测定细胞存活率和Western blotting测定增殖细胞核抗原（PCNA），以观察细胞的增殖变化。结果:通过细胞形态，DNA ladder和TUNEL荧光染色发现单独LPS诱导组的细胞可见明显的凋亡现象，而通过APC治疗组的细胞凋亡改变明显减轻和细胞凋亡率下降，同时细胞存活率和PCNA表达率增高，尤其在50 μg/L时，与单独LPS诱导组细胞比较差异显著（P<0.05）。结论:APC拮抗LPS诱导的血管内皮细胞凋亡并促进细胞的增殖，发挥保护细胞的作用。     

恒磁场对内皮细胞凋亡、黏附分子表达及其与单核细胞黏附率的影响

目的： 初步观察恒磁场对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用下人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 凋亡、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）的分泌与表达及HUVEC与人单核细胞株THP-1黏附率的影响。方法： 采用体外培养第3代的HUVEC，实验分为6组：对照组、AngⅡ（10^-6 mol/L）组及AngⅡ+不同磁感应强度（1 Gs、5 Gs、10 Gs、20 Gs）的恒磁场组。各组细胞于单纯培养或磁场作用24 h后收集样品，用末端脱氧核糖核酸酶介导的dUTP末端标记法 (TUNEL)和流式细胞仪碘化丙锭染色法检测细胞凋亡，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养液中ICAM-1、VCAM-1的含量，免疫细胞化学检测ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达，计数法观察HUVEC与THP-1的黏附率。 结果： AngⅡ10-6 mol/L可诱导HUVEC凋亡（P<0.05 vs 对照组），而1 Gs、5 Gs、10 Gs和20 Gs恒磁场组细胞凋亡率显著低于AngⅡ组（P<0.05）。AngⅡ(10^-6 mol/L)组HUVEC的ICAM-1和VCAM-1含量和表达量显著高于对照组（P<0.05），而1 Gs、5 Gs、10 Gs和20 Gs恒磁场组细胞ICAM-1的含量和表达量显著低于AngⅡ组（P<0.05）。AngⅡ (10^-6 mol/L)组HUVEC与THP-1的黏附率显著高于对照组（P<0.05），而1 Gs、5 Gs、10 Gs和20 Gs恒磁场组HUVEC与THP-1的黏附率显著低于AngⅡ组（P<0.05）。 结论： 恒磁场可拮抗AngⅡ的作用，抑制HUVEC凋亡、HUVEC的ICAM-1和VCAM-1分泌与表达及HUVEC与单核细胞的黏附率。     

Toll样受体4介导的自噬减轻糖基化高密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞凋亡

目的:探讨自噬对糖基化高密度脂蛋白(glycosylated high-density lipoprotein,gly-HDL)所致的血管内皮细胞凋亡的影响及其分子机制。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),分别与100 mg/L HDL和不同浓度(25、50和100 mg/L)gly-HDL共同孵育24 h;另再培养HUVECs给予1μmol/L自噬诱导剂雷帕霉素或2 mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)预处理1 h,或5 mg/L抗Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)单克隆中和抗体预处理30 min,再与gly-HDL(100 mg/L)共同孵育24 h。采用MTT法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,试剂盒测定培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,采用Western blot技术检测自噬标志分子beclin-1和微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)、内质网应激凋亡途径关键分子caspase-12及TLR4的表达变化,采用激光共聚焦显微镜观测细胞内LC3的变化。结果:经gly-HDL处理的HUVECs活力下降,LDH漏出和细胞凋亡显著增加(P<0.01),且caspase-12被激活(P<0.05);雷帕霉素预处理HUVECs后,gly-HDL对细胞的损伤作用和对caspase-12的活化作用减弱(P<0.05);而3-MA预处理HUVECs后,gly-HDL对细胞的损伤作用和对caspase-12的活化作用则进一步加强(P<0.05)。gly-HDL显著上调TLR4的表达,并触发自噬反应,表现为beclin-1和LC3-Ⅱ表达上调及LC3显著颗粒化,且呈浓度依赖性(P<0.05);而抗TLR4单克隆中和抗体预处理可显著抑制gly-HDL所诱导的beclin-1上调和LC3颗粒化(P<0.01)。结论:TLR4介导gly-HDL对HUVECs自噬的诱导作用,而一定程度的自噬可通过抑制caspase-12活化减轻gly-HDL所诱导的HUVECs凋亡。