人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建

目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库.方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA,合成双链cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将胰腺癌双链cDNA分为两组,分别加上不同的接头,再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段.将该差异表达片段克隆至T/A载体,并转化大肠杆菌TOP 10F',经蓝白斑筛选后,再用PCR方法筛选阳性克隆,从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库.结果文库扩增后得到257个白色克隆,随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析,其中47个克隆有插入片段,克隆阳性率为94%,片段大小主要集中在300～600bp之间.结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础.     

人大肠癌和癌旁组织消减cDNA文库的构建和鉴定

背景：抑制消减杂交(SSH)是一种较成熟的分离差异表达基因的方法，但用该方法构建大肠癌特异性基因消减cDNA文库和筛选相关基因的研究较少。目的：构建人大肠癌和癌旁组织的消减cDNA文库。方法：应用SSH技术分离大肠癌和癌旁正常组织差异表达基因的cDNA片段，将其与pGEM-T Easy载体连接，构建消减cDNA文库。将连接产物转化大肠杆菌DH5α进行文库扩增。随机挑取200个白色克隆，以聚合酶链反应(PCR)进行鉴定。结果：进行PCR扩增的200个克隆中，176个克隆有插入片段，片段分布于200～700bp。结论：成功构建了人大肠癌组织和癌旁组织差异表达基因的消减cDNA文库，为高通量筛选、克隆大肠癌特异性基因奠定了基础。     

胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建及质量分析

目的构建人胰腺癌抑制消减cDNA文库.方法从来源于同一标本的胰腺癌和癌旁正常组织分离poly(A)+ RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库.结果挑取500个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示其中 457个克隆有插入片段,片段大小范围为 250～750 pb.结论应用消减杂交的方法,再经适当的改进,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的胰腺癌cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选胰腺癌发生的相关基因群并克隆胰腺癌相关表达基因,研究其胰腺癌发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础.     

胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建及质量分析

目的：构建人胰腺癌抑制消减cDNA库。方法：从来源于同一标本的胰腺癌的和癌旁正常组织分离poly(A)^ RNA,经反转录后，利用抑制消减杂交（SSH）方法，通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减库。结果：挑取500个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段，结果显示其中457个克隆有插入片段，片段大小范围为250－750pb。结论：应用消减杂交的方法，再经适当的改进，在去除相同遗传背景的条件下，可以建立较特异的胰腺癌cDNA消减库，该库为进一步批量筛选胰腺癌发生的相关基因群并克隆胰腺癌相关表达基因，研究其胰腺癌发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础。     

正常肝组织与肝癌组织差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的 构建人正常肝组织与肝癌组织差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交技术,以癌旁正常肝组织及肝癌组织作为对比材料,分离肝癌组织中不表达或低表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取100个白色克隆进行酶切鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得4000余个白色阳性克隆,随机挑取的100个白色克隆进行酶切鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得4000余个白色阳性克隆,随机挑取的100个白色克隆经酶切后均有200-600bp的插入片段。结论 用SSH法及T/A克隆技术成功构建了正常肝组织与肝癌组织差异表达基因的消减cDNA文库,该文库的建立为进一步筛选、克隆肝癌组织中失活或低表达的新的抑癌基因奠定了基因。     

应用抑制消减杂交技术筛选大肠癌新相关基因

目的利用抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）构建人大肠癌差异表达cDNA文序，分离并克隆出大肠癌发病的相关新基因。方法运用抑制消减杂交技术分离大肠癌组织及癌旁正常黏膜差异表达基因的cDNA片断，将其与T载体连接构建文库，从库中随机挑取200个白色菌落．使用PCR方法鉴定阳性克隆并对其中50个克隆进行测序，将测序结果登录GenBank进行卜司源性对比分析，并对部分有意义的差异表达片断进行Virtual Northern Blot分析。结果成功构建人源性大肠癌消减cDNA文库，通过筛选获得20个差异表达的基因，其中有2个片断未检测到同源性序列，根据杂交结果考虑可能是存大肠肿瘤中差异表达的新基因。结论运用SSH技术成功构建了人大肠癌的差异表达的cDNA消减杂交文库，并筛选出2个存大肠肿瘤中差异表达的新基因。     

嗜人按蚊雌蚊消减cDNA文库的构建及分析

目的 构建嗜人按蚊雌雄蚊差异表达cDNA文库。为进一步筛选、克隆嗜人按蚊雌雄蚊差异新基因奠定基础。方法 以嗜人按蚊为实验模型．分别将雌蚊和雄蚊作为T组和D组．采用抑制消减杂交方法和T／A克隆技术构建嗜人按蚊差异表达cDNA文库。扩增正向消减cDNA文库获得3000余个阳性克隆．随机挑取100个克隆进行PCR扩增，90％的克隆中均有200～1000bp的插入片段。测序显示．有与冈比亚按蚊未知功能基因同源的克隆，去除重复序列，得到72个EST序列．其中40与已知序列具有相似性．32个为新的EST序列。本项研究成功构建了嗜人按蚊雌蚊差异表达cDNA文库，获得了32个新的EST序列。从而为下一步筛选、克隆嗜人按蚊性别差异新基因打下了基础。     

应用SSH技术研究H_2O_2胁迫下细粒棘球蚴基因的表达

目的构建H2O2胁迫下细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)与正常组织差异表达的消减cDNA文库。方法以H2O2胁迫细粒棘球蚴cDNA为试验方(tester),正常生长的细粒棘球蚴cDNA为驱动方(driver),应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)研究H2O2胁迫下细粒棘球蚴基因的表达。结果文库扩增后得到124个阳性克隆,菌落PCR分析,均得到200~1000bp插入片段。将整个文库克隆进行测序,测得序列结果利用BLAST在线软件与GenBank数据库进行同源序列比对分析和BlastX分析。结果获得重要基因的cDNA序列,如氧化还原酶、蛋白激酶、生长因子等。另有部分克隆在GenBank中无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因。结论成功构建了H2O2胁迫与正常组织差异表达的消减cDNA文库,为研究细粒棘球蚴在抗氧化过程中的相关靶基因筛选奠定基础。     

日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝星状细胞差异表达cDNA文库的构建和筛选

目的构建日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝星状细胞差异表达基因的消减cDNA文库,并筛选差异表达基因。方法取日本血吸虫尾蚴经腹部感染小鼠致肝纤维化。采用抑制性消减杂交技术(SSH),分离小鼠肝星状细胞(HSC)及正常小鼠HSC,通过对比寻找差异表达基因。将其与T载体连接(T/A克隆),其产物转化大肠埃希菌DH5α,经文库扩增后,随机挑取白色克隆进行酶切鉴定,克隆经过正、反向杂交,阳性克隆经过测序和BLAST(局部相似性基本查询工具)进行表达序列标签(ESTs)差异基因分析。最后经模拟Northern印迹确认基因表达差异。结果扩增消减cDNA文库获得400余个白色阳性克隆,随机挑取的克隆经酶切鉴定后均有200～600 bp插入片段。ESTs分析获得76个序列,其中70个序列提示与血吸虫病肝纤维化或与其相关的基因,6个在公共数据库中未找到同源序列片段。结论用SSH法及T/A克隆技术成功构建了肝纤维化小鼠HSC与正常小鼠HSC差异表达基因的消减cDNA文库。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因克隆化的研究

目的 应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HBX反式激活相关基因。方法 以HBX表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照。制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组。分别与两组不同的接头衔接，再对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制聚合酶链反应（PCR），将产物与T/A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HBX反式激活基因差异表达的cDNA消减文库；文库扩增后得到85个白色克隆，进行菌落PCR分析。均得以200-1000bp插入片段，挑取含有插入片段的65个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得19种已知基因序列。和15个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了HBX反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HBX反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

Construction of a metastasis-associated gene subtracted cDNA library of human colorectal carcinoma by suppression subtraction hybridization

AIM: To construct a differentially-expressed gene subtracted cDNA library from two colorectal carcinoma (CRC) cell lines with different metastatic phenotypes by suppression subtractive hybridization. METHODS: Two cell lines of human CRC from the same patient were used. SW620 cell line showing highly metastatic potential was regarded as tester in the forward subtractive hybridization, while SW480 cell line with lowly metastatic potential was treated as tester in the reverse hybridization. Suppression subtractive hybridization (SSH) was employed to obtain cDNA fragments of differentially expressed genes for the metastasis of CRC. These fragments were ligated with T vectors, screened through the blue-white screening system to establish cDNA library. RESULTS: After the blue-white screening, 235 white clones were picked out from the positive-going hybridization and 232 from the reverse. PCR results showed that 200-700 bp inserts were seen in 98% and 91% clones from the forward and reverse hybridizations, respectively. CONCLUSIONS: A subtractive cDNA library of differentially expressed genes specific for metastasis of CRC can be constructed with SSH and T/A cloning techniques.     

Construction of a metastasis-associated gene subtracted cDNA library of human colorectal carcinoma by suppression subtraction hybridization

AIM:To construct a differentially-expressed gene subtractedcDNA library from two colorectal carcinoma (CRC) cell lineswith different metastatic phenotypes by suppressionsubtractive hybridization.METHODS:Two cell lines of human CRC from the samepatient were used.SW620 cell line showing highlymetastatic potential was regarded as tester in the forwardsubtractive hybridization,while SW480 cell line with lowlymetastatic potential was treated as tester in the reversehybridization.Suppression subtractive hybridization (SSH)was employed to obtain cDNA fragments of differentiallyexpressed genes for the metastasis of CRC.These fragmentswere ligated with T vectors,screened through the blue-white screening system to establish cDNA library.RESULTS:After the blue-white screening,235 white cloneswere picked out from the positive-going hybridization and232 from the reverse.PCR results showed that 200-700 bpinserts were seen in 98% and 91% clones from the forwardand reverse hybridizations,respectively.CONCLUSIONS:A subtractive cDNA library of differentiallyexpressed genes specific for metastasis of CRC can beconstructed with SSH and T/A cloning techniques.     

抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA，克隆HCV-F蛋白反式激活相关基因。方法 以HCV-F表达质粒pcDNA3．1（-）-F转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HcVF蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200～1000bP插入片段的克隆，随机挑选其中28个插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得19种编码基因，其中2个为未知功能的新基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。     

应用抑制性消减杂交技术筛选转化生长因子β1刺激LX02细胞的反式调节基因

目的 构建转化生长因子(TGF)β1刺激大鼠肝星状细胞(LX02)反式调节基因的cDNA消减文库,筛选并克隆TGF β1反式调节相关基因,以阐明TGF β1介导肝纤维化的分子生物学机制.方法 以TGF β1刺激LX02细胞,同时以磷酸盐缓冲液刺激的LX02细胞作为对照.提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应.将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增;随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到146个200～1000bp插入片段的阳性克隆;随机挑取其中35个克隆进行测序,30个列序成功,并通过生物信息学分析发现有28个与已知基因序列和2个与未知功能基因序列高度同源.结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库,筛选到一些与细胞生长调节、蛋白质合成,信号传导、细胞外基质代谢、扰脂质过氧化等密切相关的蛋白质编码基因,为进一步阐明TGF β1介导肝纤维化的分子生物学机制提供了线索.     

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒E1蛋白反式激活基因

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)E1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVE1蛋白反式激活相关基因。方法　以HCVE1表达质粒pcDNA3 .1( -) E1转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( -)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成 2组 ,分别与 2种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果　成功构建人HCVE1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 89个阳性克隆 ,进行菌落PCR分析 ,均得到 10 0 10 0 0bp插入片段。挑取 46个含有插入片段的阳性克隆测序分析 ,获得 44个已知基因序列和 2个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录。结论　应用SSH技术成功构建了HCVE1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE1反式调节的靶基因及致肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据     

截短型HBsAg中蛋白反式激活基因的克隆

目的：应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒（HBV）截短型中蛋白（MHBs^t)反式 激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HBV截短型中蛋白反式激活相关基因。方法：以HBV截短型中蛋白表面质粒pcDNA3.1(-)-Tt167转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa I酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应（PCR），将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果：成功构建人HBV截短型中蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到94个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到200－800bp插入片段。挑取50个插入片段测序，并通过生物学信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得23种编码基因，包括19种已知基因的4种未知基因。结论：筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、免疫应答及肿瘤发生密切相关的蛋白编码基因，因此可能是HBV截短型中蛋白反式激活靶基因。     

不同毒力株弓形虫速殖子消减cDNA文库的构建

目的构建不同毒力株弓形虫速殖子cDNA消减文库。方法以弓形虫强毒株RH株速殖子为Tester、弱毒株Prugniaud株速殖子为Driver,进行正向抑制性消减杂交;以Prugniaud株为Tester、RH株为Driver,进行反向抑制性消减杂交。分别将获取的2组抑制性消减杂交产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并以PCR扩增鉴定插入片段。结果获得正向和反向cDNA消减文库,每个消减文库分别随机挑取384个阳性克隆,PCR扩增显示插入率为98%,片段长度在200~2000bp之间。结论通过抑制性消减杂交技术成功构建2个消减文库,为进一步筛选和鉴定弓形虫毒力相关基因奠定了基础。