淫羊藿甙对大鼠成骨细胞分泌细胞因子的影响

目的观察不同浓度的淫羊藿甙对成骨细胞分泌的IL-6、TGF-β、TNF-αmRNA表达的影响,以17β-雌二醇作为阳性对照比较淫羊藿甙与雌激素对于细胞因子表达影响的差异。方法体外培养新生SD大鼠颅盖骨分离的成骨细胞,加入不同浓度的淫羊藿甙及17β-雌二醇,用RT-PCR测定的IL6、TGF-βα1、TNF-αmRNA的表达水平的变化。结果10μg／ml淫羊藿甙和三个浓度的17β-E2都能够促进TGF-β1 mRNA的表达,抑制IL-6和TNF-αmRNA的表达。5μg／ml的淫羊藿甙能够促进TGF-β1mRNA的表达并抑制IL-6 mRNA的表达。但对于TNF-α mRNA表达没有抑制作用。其中三个浓度的17β-E2组和淫羊藿甙组之间对于IL-6和TNF-αmRNA表达的影响没有显著性差别,而10-8mol／L17β-E2对TGF-β1 mRNA表达的影响作用最强。结论淫羊藿甙治疗骨质疏松的部分机理可能与抑制IL6、TNF-α mRNA的表达和促进TGF-β1 mRNA的表达有关。     

淫羊藿甙对成骨细胞凋亡的影响

目的 通过研究淫羊藿甙对体外培养的成骨细胞凋亡的影响,探讨淫羊藿甙防治骨质疏松的可能机制.方法 采用酶消化法和机械分离法获得新生SD大鼠成骨细胞,取第四代细胞随机分为,雌二醇组(1×10-8 mmol/l),淫羊藿甙低剂量组(1 ng/ml),中剂量组(10 ng/ml),高剂量组(100 ng/ml)对照组,经药物处理48 h后,用TUNEL和扫描电镜的方法检测成骨细胞的凋亡.结果 与对照组相比较,淫羊藿甙各剂量组的凋亡指数均下降(P<0.05),其中淫羊藿甙中剂量组的凋亡指数下降明显,差异有高度统计学意义(P<0.01);扫描电镜显示淫羊霍甙各组的凋亡细胞较对照组减少,尤以淫羊霍甙中剂量组最少.结论 淫羊藿甙可以通过抑制成骨细胞的凋亡,促进骨形成,减少骨吸收,从而发挥抗骨质疏松的作用.     

淫羊藿甙促成骨细胞分化的分子机制研究

【立论依据】 骨质疏松症是以骨量减少和骨的微观结构退化为特征,导致骨的脆性增加以致易于发生骨折的一种全身性代谢性骨病。骨质疏松严重威胁人类健康,且发病率呈逐年上升趋势,目前全世界约有2亿多骨质疏松症患者。目前临床上治疗骨质疏松的化学合成药物存在毒性大、价格昂贵等问题,而天然中草药及其制剂则可以克服上述缺点。淫羊藿(Herba Epimdii)是目前临床上治疗骨质疏松的常用中药,已有研究显示其主要成分淫羊藿甙(Icariine, ICA)具有促成骨分化功能,但具体机制不详。microRNA (miRNA)是一类长度约为20~25 nt、在基因转录后水平发挥调控作用的小分子非编码RNA,它几乎参与生物所有的生理病理过程。作为重要的生物调节分子,miRNA是否参与了ICA促成骨分化过程呢?关于ICA促成骨分化的分子机制的研究,可以为临床上提高淫羊藿治疗骨质疏松的效果提供理论和实验依据。 【设计思路】 首先确定ICA促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分化的合适的时间和剂量,然后进行差异miRNAs筛选并选取部分差异miRNAs进行验证,最后挑选miR-27a进行深入研究。 【实验内容】 (1)ICA处理时间和剂量的确定:用MTT、real-time PCR确定ICA促MC3T3-E1分化的合适的时间和剂量。(2)差异miRNAs的筛选:将5 μM ICA处理48 h 的MC3T3-E1 RNA及对照进行miRNA测序和分析。(3)差异miRNAs的验证:挑选15个差异miRNAs用Real-time PCR进行验证(已完成),并从中挑选miR-27a进行深入研究。(4)miR-27a在ICA促成骨分化中的作用及机制:① miR-27a靶基因的预测:运用miRWalk在线工具预测miR-27a的靶基因。② Osterix是miR-27a靶基因的验证:A. 构建含有Osterix 3'UTR以及miR-27a结合位点突变的荧光素酶报告质粒;B. 将miR-27a的mimic或对照和构建的荧光素酶报告质粒共转染HEK 293 T细胞,检测并比较荧光素酶活性;C. 将miR-27a的mimic或对照转染MC3T3-E1细胞,确定miR-27a对Osterix mRNA和蛋白表达的影响。③ miR-27a在ICA促成骨分化中的作用:将miR-27a的mimic、inhibitor和对照分别转染MC3T3-E1细胞,再用ICA处理,然后分别用Real-time PCR和碱性磷酸酶染色确定miR-27a在ICA促成骨细胞分化中的作用。 【材料】 HEK 293-T、MC3T3-E1细胞;pGL3-promoter荧光素酶报告基因载体、Real-time PCR用引物及试剂,蛋白质印迹用试剂及抗体;碱性磷酸酶染色用试剂。 【可行性】 我们具备本课题实施所需要的研究材料包括试剂和仪器;课题设计所用的方法均为指导教师课题组常用的方法;本课题已顺利实施,我们目前已完成了ICA处理时间和剂量的确定、差异miRNAs的筛选和鉴定、miR-27a靶基因的预测。以上实验的实施和结果的获得表明本课题在理论和技术上均可行。 【创新性】 (1)首次证明miRNAs参与ICA促成骨细胞分化过程;(2)首次证明miR-27a 在ICA促成骨细胞分化中起重要作用。研究结果将进一步阐明ICA促成骨细胞分化的分子机制,从而为提高淫羊藿的临床治疗效果提供理论和实验依据。     

淫羊藿对体外培养成骨细胞影响的研究进展

淫羊藿是抗骨质疏松症中运用较多的中药。近年来,淫羊藿在抗骨质疏松方面的研究,无论从实验还是临床方面都取得了显著的成就。实验研究发现,淫羊藿不但可以促进体外成骨细胞增殖、分化,促进成骨作用;还可通过作用于成骨细胞相关基因的转录和信号通路的转导来影响成骨细胞的活性,为研制新型抗骨质疏松药物提供了前景。     

淫羊藿甙对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

本实验根据小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力对巨噬细胞产生白细胞介素－１（ＩＬ－１）和肿瘤坏死因子的能力进行活测定。观察了淫羊藿甙对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响。     

淫羊藿提取液对去睾尺大鼠骨代谢的影响

应用去睾丸方法，研究淫羊藿水提液对去睾丸ＳＤ大鼠骨生长的促进作用。淫羊藿水提液，口服给药５ｇ／ｋｇ，每周６次，持续７周。结果显示，与对照组比较去睾丸喂水组胫骨近端骨小梁的骨吸收周长明显增加（＋１０８％），而类骨质和荧光也增加（＋８９％，＋７６％）。骨形成率增（＋６５％），出现骨高转化率的改变。而且骨小梁面积出现减少的趋势。用淫羊藿治疗的去睾丸组与去睾丸给水组比较，治疗组降低了胫骨近端骨小梁的骨吸收     

淫羊藿对小鼠成骨细胞增殖、功能及凋亡的影响

目的:观察淫羊藿提取液对体外培养的小鼠成骨细胞增殖、功能及凋亡的影响.方法:利用序列酶消化法从新生小鼠颅盖骨中分离和培养成骨细胞,用组织化学和免疫组化染色进行细胞鉴定.用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测淫羊藿对成骨细胞增殖的影响,通过检测成骨细胞碱性磷酸酶的活性反映淫羊藿对细胞功能的作用.建立地塞米松诱导的成骨细胞凋亡体系,并利用流式细胞仪观察淫羊藿对这一凋亡体系的影响.结果:分离和获得的大量单一多角形细胞,经碱性磷酸酶组织化学染色呈强阳性,经Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨涎蛋白免疫组化染色呈阳性,证实获得的细胞为成骨细胞.淫羊藿提取液不影响成骨细胞的增殖,但可以显著提高成骨细胞碱性磷酸酶的活性,其中相当于生药1 g/L组的作用最明显.100 nmol/L和1 000 nmol/L地塞米松可以显著增加成骨细胞凋亡率,但同时加入相当于生药1 g/L的淫羊藿提取液,并不引起细胞凋亡率的明显变化.结论:淫羊藿对成骨细胞的增殖和凋亡没有明显作用,但却显著增加了成骨细胞碱性磷酸酶的活性.淫羊藿防治骨质疏松症的重要机制之一可能是促进成骨细胞的成骨功能.     

新伤续断汤对成骨细胞增殖及骨形态发生蛋白的影响

【目的】探讨新伤续断汤(由骨碎补、续断、地鳖虫等组成)对大鼠成骨细胞增殖以及骨形态发生蛋白2(BMP-2)表达的影响。【方法】采用血清药理学方法制备新伤续断汤含药血清,与α-MEM培养基配成细胞培养液。按酶序列消化法从SD大鼠乳鼠颅骨获取、培养成骨细胞,以碱性磷酸酯酶染色和钙结节染色鉴定细胞。取第3~4代细胞用细胞增殖—毒性(CCK-8)法检测经体积分数为5%、10%、20%新伤续断汤含药血清处理24、48、72 h后的细胞增殖情况。用含体积分数10%的新伤续断汤、续断、骨碎补、空白对照含药血清分别培养细胞,采用微量酶标法检测碱性磷酸酶的活性,酶联免疫吸附法检测BMP-2的表达。【结果】新伤续断汤对成骨细胞的影响呈时间、浓度上的依赖性,其中浓度为10%时效果明显。体积分数10%的新伤续断汤、骨碎补、续断含药血清的成骨细胞碱性磷酸酶活性较空白对照组显著升高,差异有统计学意义(P0.01);7 d时,新伤续断汤组、骨碎补组与空白对照组比较,BMP-2表达显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。【结论】新伤续断汤能促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性及BMP-2的表达,其中单味药骨碎补可能发挥重要作用,其促进骨折愈合机制可能与提高细胞的成骨功能有关。     

高效液相色谱法测定清宫龙凤宝中淫羊藿甙的含量

用高效液相色谱法测定清宫龙凤宝中淫羊藿甙的含量，采用SpherisorbC18柱，4．6mm×150mm，流动相甲醇-水（50：50），流速1．0mL／min，检测波长270nm。测定结果平均回收率为101．38％，RSD＝2．1％。     

类胰岛素一号增长因子微球对成骨细胞功能的影响

目的：研究不同浓度类胰岛素一号增长因子（IG F‐1）微球对成骨细胞功能的影响。方法缓释微球制作采用乳化冷凝聚合交联法;根据微球的药代动力学特性,将载不同浓度的IGF‐1明胶微球分为0．25,2．5,25,250 ng／mg组及空白对照组,通过细胞增殖和分化实验评价不同浓度IGF‐1微球对成骨细胞功能的影响。结果载不同浓度IGF‐1的微球对细胞增殖的影响有显著性差异,0．25,2．5,25 ng／mg组对成骨细胞均具有显著的促增殖作用,其中25 ng／mg组的促增殖作用最为显著。载不同浓度IGF‐1的微球对细胞分化的影响有显著性差异,其中25 ng／mg组的促分化作用最为显著。结论 IGF‐1明胶微球有显著促进成骨细胞增殖和分化的作用,其最佳浓度为25 ng／mg。     

辛伐他汀对人骨髓基质细胞Cbfa1,Cbfb和Osterix表达的影响

目的:通过对成人骨髓基质细胞(hBMSC)体外培养的观察,研究辛伐他汀(SIM)对hBMSC成骨分化,增殖的影响和作用机制. 方法: 取人髓腔内骨髓,采用全骨髓培养法进行原代和传代培养. 传代后实验组添加10-7 mol/L的SIM,同时做不加药的空白对照. 应用半定量RT-PCR方法分别检测核心结合因子a1(Cbfa1),β(Cbfb)和Osterix(OSX)在成骨细胞分化过程中的表达;应用碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒及茜素红法检测细胞ALP比活性和细胞矿化能力;应用CCK-8测定细胞增殖情况. 结果: SIM作用后第3,6,9和12日的Cbfa1和OSX表达均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),Cbfb差异无统计学意义(P＞0.05);与对照组相比,SIM作用后的第3日[(63.54±2.99) vs (54.05±1.14),(P＜0.05)] ;第6日[(70.39±3.98) vs (60.53±3.08),(P＜0.01)];第9日[(86.28±1.20) vs (72.93±0.85), (P＜0.01)];第12日[(94.99±3.20) vs (74.13±1.79),(P＜0.01)],ALP比活性高于对照组. SIM能增强形成钙结节的能力并抑制细胞增殖(P＜0.05). 结论: SIM通过促进成骨细胞相关基因的表达从而促进hBMSC成骨分化,同时具有抑制细胞增殖的作用.     

整合素β1、α2亚基在培养大鼠椎间盘纤维环细胞中的表达

目的: 检测培养大鼠椎间盘纤维环细胞整合素β1、α2亚基的表达.方法: 用酶消化法分离、培养大鼠椎间盘纤维环细胞,采用免疫荧光细胞化学染色和流式细胞术检测培养细胞整合素β1、α2亚基的表达,并对其进行定量分析.结果: 培养大鼠椎间盘纤维环细胞表达整合素β1、α2亚基,整合素β1表达量较高,α2亚基表达较低.结论: 培养大鼠椎间盘纤维环细胞表达整合素β1、α2亚基.     

补骨脂素对酒精诱导的成骨细胞增殖的影响

【目的】观察补骨脂素对酒精诱导的成骨细胞增殖的影响,探讨补骨脂素防治酒性性骨质疏松的机制。【方法】采用碱性磷酸酶(ALP)染色法鉴定从大鼠乳鼠头盖骨分离的成骨细胞。将鉴定成功的成骨细胞随机分为4组:空白对照组、酒精组(即模型组)、补骨脂素组、补骨脂素+酒精组。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞增殖情况。【结果】与空白对照组比较,酒精组24、48、72、96 h各时间点成骨细胞增殖活性均显著降低(P0.05),补骨脂素组各时间点成骨细胞增殖活性虽升高,但差异均无统计学意义(P0.05)。与酒精组比较,补骨脂素+酒精组24 h成骨细胞增殖活性显著升高(P0.05),2组48、72、96 h细胞增殖活性差异均无统计学意义(P0.05)。【结论】补骨脂素对体外酒精诱导的成骨细胞增殖有促进作用。     

膜转铁蛋白1在成骨细胞上表达的初步研究

目的观察膜转铁蛋白1（FP1）基因在人成骨细胞株（hFOB1.19）内的表达情况。方法 hFOB1.19在34℃、5%CO2条件下培养,添加细胞生长营养液,细胞培养3～4d后用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测FP1在成骨细胞内的表达情况。结果在成骨细胞株hFOB1.19内,FP1基因呈阳性表达。结论 FP1基因成功表达对＂铁调素与成骨细胞内铁离子关系＂有十分重要的解释作用。     

成骨细胞与血管内皮细胞直接混合培养的体外实验研究

目的　通过观察不同比例和不同时间成骨细胞和血管内皮细胞直接混合培养时细胞增殖和功能的变化 ,选择适宜的两种细胞直接混合培养比例及时间 ,为骨组织工程血管化研究提供理论基础。方法　取兔骨膜成骨细胞 (RPOB)和肾血管内皮细胞 (RRVEC) ,以成骨和内皮细胞数目比 1∶2 ,1∶1和 2∶1直接混合培养 4 ,8,12d ,通过细胞计数、碱性磷酸酶 (ALP)活性测定及　3 H -脯氨酸掺入试验观察细胞增殖分化能力及功能状态。结果　 2∶1组细胞 4d增殖最活跃 (P <0 .0 5 ) ,8d和 12d细胞增殖减慢。ALP活性和　3 H -脯氨酸掺入呈时间依赖性增长 ,其中共培养 12dALP活性组间无差异 ,但　3 H -脯氨酸掺入较高 ,与其他各组差异显著 (P <0 .0 5 )。结论　成骨细胞和血管内皮细胞 2∶1直接混合培养 12d ,功能活跃 ,适宜组织工程研究。     

人参总皂甙对培养乳鼠心肌细胞的组织化学的影响

本文探讨了人参总皂甙对缺氧缺糖培养的乳鼠心肌细胞的组织化学影响。将Wistar系大白鼠乳鼠心肌原代培养4～6天,取生长良好的培养瓶共40瓶,将其分为4组:对照组、缺氧缺糖组、缺氧缺糖组滴入0.35mg人参总皂甙组和糖原对照及酶对照组。4个组都在37℃恒温培养箱里培养60分钟,取出盖玻片进行PAS反应并显示SDH活性。结果加药组PAS反应呈强阳性,SDH活性增强。总之,人参总皂甙对缺氧缺糖心肌具有良好的供能、保护作用。     

大鼠成骨细胞的体外培养和生物学特性的研究

目的 :建立一种成骨细胞的体外培养方法 ,并研究不同培养时期成骨细胞的生物学特性。方法 :选用成年雌性大鼠松质骨为培养细胞来源 ,组织块培养法和胰酶消化法相结合进行成骨细胞培养 ,并测定成骨细胞不同培养阶段的碱性磷酸酶 (AKP)活性和骨钙素 (OC)分泌水平。结果 :体外培养所获成骨细胞纯度高、数量多 ,且培养时间明显缩短。培养细胞近融合时 ,产生的AKP和OC处于低水平 ,融合后 3d、14dAKP和OC的产生明显增加。结论 :实验采用的改良大鼠成骨细胞培养方法较为方便、切实可行。体外培养的大鼠成骨细胞在不同生长阶段 ,其骨基质蛋白的产生发生相应变化