不同价态砷对DNA和砷甲基转移酶的影响

目的观察不同价态、不同剂量砷染毒大鼠肝脏中DNA甲基转移酶和砷甲基转移酶mRNA的表达情况,寻找两者间的相关性及不同价态砷(iAs3+和iAs5+)体内甲基化间的差异。方法将35只健康清洁级Wistar雄性大鼠按体重随机分为7组,分别为正常对照(去离子水)组和低剂量(1/45 LD50,2.33 mg/kg)、中剂量(1/15 LD50,6.67 mg/kg)、高剂量(1/5LD50,20.00 mg/kg)砷酸氢钠(iAs5+)染毒组以及低剂量(2.33 mg/kg)、中剂量(6.67 mg/kg)、高剂量(20.00 mg/kg)亚砷酸钠(iAs3+)组,每组5只。采用自由饮水方式进行染毒,连续染毒90 d。采用实时荧光定量PCR法测定肝脏中DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)和砷甲基转移酶(As3MT)mRNA的表达情况。结果与对照组相比,各染毒组大鼠肝脏中As3MT mRNA的表达量较高,DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达量较低,高、低剂量亚砷酸钠染毒组和高剂量砷酸氢钠染毒组DNMT1 mRNA的表达量均较高,中剂量亚砷酸钠染毒组和低剂量砷酸氢钠染毒组DNMT1 mRNA的表达量均较低,差异有统计学意义(P<0.05)。随着亚砷酸钠染毒剂量的升高,大鼠肝脏中As3MT mRNA的表达量呈上升趋势,DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达量呈下降趋势;随着砷酸氢钠染毒剂量的升高,大鼠肝脏中As3MT mRNA的表达量呈下降趋势,DNMT3A、DNMT3B、DNMT1 mRNA的表达量呈上升趋势。As3MT的表达量与DNMT3A和DNMT3B表达量呈负相关(P<0.01);与DNMT1表达量无相关关系(P>0.01)。结论长期亚慢性暴露iAs3+和iAs5+均可促进As3MT的表达,抑制DNMT3A及DNMT3B的表达,但iAs3+和iAs5+间在剂量-效应关系上呈反向性;机体As3MT表达上调与DNMT3A和DNMT3B表达抑制间具有协同效应,并可导致基因低甲基化。     

微囊藻毒素-LR对小鼠肝细胞DNA甲基化的影响

目的研究微囊藻毒素-LR(MC-LR)暴露对小鼠肝细胞DNA总体甲基化水平及DNA甲基转移酶(DNMTs)mRNA表达的影响。方法将40只健康SPF级昆明小鼠随机分为4组,分别为对照组(含0.02%DMSO)和5、10、20μg/kg MCLR染毒组,每组10只,雌雄各半。采用腹腔注射方式进行染毒,连续染毒20 d。采用高效液相色谱(HPLC)法检测小鼠肝细胞DNA中的脱氧胞苷和5-甲基脱氧胞苷含量,并计算DNA的总体甲基化水平;采用实时荧光定量PCR法检测DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B m RNA的表达水平。结果 10、20μg/kg MC-LR染毒组小鼠肝细胞DNA总体甲基化水平,DNMT1、DNMT3A及DNMT3B mRNA的表达水平均低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。小鼠肝细胞DNA总体甲基化水平与DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表达水平均呈正相关(P0.05)。结论 MC-LR可抑制小鼠肝细胞DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA的表达,降低DNA总体甲基化水平。     

香烟烟雾对小鼠卵母细胞染色质构型、DNA甲基化及相关基因表达的影响

目的探讨香烟烟雾暴露对小鼠卵母细胞染色质构型、全基因组DNA甲基化及相关基因表达的影响。方法将清洁级健康ICR雌鼠分成3组(对照组和香烟烟雾低剂量组、高剂量组),分别置于点燃0、1、2支香烟的染毒柜(容积18 L)中,每天2次,每次1 h,共4周。利用Hoechst 33342对细胞核染色,观察卵母细胞质量及染色质构型;间接免疫荧光法分析卵母细胞全基因组DNA甲基化模式,实时荧光定量PCR测定卵母细胞DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMT)1、DNMT3a及DNMT3b基因的mRNA表达水平。结果随着烟雾浓度的升高,去透明带卵母细胞直径显著减小(P0.05),核仁未包围(non surrounded nucleolus,NSN)染色质构型比例明显升高(P0.05)。高剂量组卵母细胞DNA甲基化水平显著下降(P0.05)。随烟雾浓度升高DNMT1表达量降低,DNMT3b在高剂量组中表达水平显著降低(P0.05)。结论香烟烟雾暴露可能通过改变卵母细胞染色质构型,降低DNA甲基转移酶的表达,使DNA甲基化水平下降,从而降低卵母细胞质量。     

三氯乙酸对L-02细胞DNA甲基化转移酶1蛋白及mRNA表达的影响

目的探讨三氯乙酸(TCA)染毒对L-02细胞DNA甲基化转移酶1(DNMT1)蛋白及mRNA表达的影响。方法取处于对数生长期的正常肝细胞(L-02细胞),分别加入含0(对照)、0.1、0.3、0.9 mmo/L TCA的培养液继续培养24、48、72 h,同时,设DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza-d C,5μmol/L)处理组,TCA-re组(0.9 mmol/L TCA处理后换正常培养基继续培养24 h)和人肝癌(HepG2)细胞组作为对照。检测细胞DNMT1蛋白和mRNA的表达水平。结果与对照组比较,各浓度TCA染毒组及5-aza-d C处理组、TCA-re组L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均较低,而HepG2细胞组DNMT1 mRNA的表达水平较高,差异均有统计学意义(P0.05)。与相同剂量TCA染毒24 h比较,各浓度TCA染毒48、72 h后L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均较低,除0.1、0.9 mmol/L TCA染毒48 h外,差异均有统计学意义(P0.05)。且随着TCA染毒浓度的升高和染毒时间的延长,L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均呈下降趋势。与0.9 mmol/L TCA染毒组比较,TCA-re组L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平较高,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,各浓度TCA染毒组及5-aza-d C处理组L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平均较低,除0.1 mmol/L TCA染毒24、48 h及0.3mmol/L TCA染毒24 h外,差异均有统计学意义(P0.05);而TCA-re组L-02细胞和HepG2细胞组DNMT1蛋白的表达水平均无明显变化。与相同剂量TCA染毒24 h比较,各浓度TCA染毒48、72 h后L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平均较低,差异均有统计学意义(P0.05)。除TCA染毒24 h时L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平随染毒浓度的升高而呈先升高后下降的趋势外,随着TCA染毒浓度的升高和染毒时间的延长,L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平均呈下降趋势。与0.9 mmol/L TCA染毒组比较,TCA-re组L-02细胞DNMT1蛋白表达水平较高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 TCA体外染毒可能通过抑制DNMT1的表达维持或者促进细胞的DNA低甲基化状态。     

妊娠期至性成熟期饮水砷暴露对子代小鼠海马组织中DNA甲基转移酶mRNA表达的影响

目的研究妊娠期至性成熟期砷暴露致子代小鼠海马DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)水平的影响,探讨不同浓度砷暴露导致子代小鼠学习与记忆能力损伤的相关分子机制。方法将24只妊娠第1天的SPF级小鼠随机分为对照组、15、30和60 mg/L亚砷酸钠染毒组,仔鼠断乳之前经母鼠染砷,断乳至出生后(postnatal day,PND)40天以自行饮水方式进行砷暴露。对PND40子代小鼠进行水迷宫检测,PND10、PND20和PND40仔鼠取脑并分离海马,采用实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)法测定子代小鼠海马DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA水平。结果水迷宫结果显示,从训练第4天开始,不同浓度砷暴露组仔鼠寻找平台潜伏期均明显长于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);在撤平台后,30和60 mg/L亚砷酸钠染毒组与对照组相比,仔鼠在第Ⅱ象限停留时间明显缩短,差异具有统计学意义(P0.05);30和60 mg/L亚砷酸钠染毒组PND20仔鼠海马DNMT1 mRNA的表达水平明显高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);PND10和PND40各组仔鼠海马DNMT1 mRNA的表达水平均无统计学差异(P0.05)。不同发育阶段各组仔鼠海马DNMT3a和DNMT3b mRNA的表达水平均无统计学差异(P0.05)。结论砷暴露损伤仔鼠学习记忆能力可能与海马DNMT1 mRNA水平升高有关。     

DNA甲基转移酶1基因低表达的人支气管上皮细胞基因组甲基化水平的体外试验

目的 观察人支气管上皮细胞(16HBE)的DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因低表达细胞株细胞周期和基因组整体甲基化水平的改变.方法 用慢病毒介导的RNA干扰方法将4个不同的短发夹RNA片段转染16HBE细胞,并用免疫印迹法(Western blotting)检测该细胞DNMT1蛋白表达水平,用流式细胞仪和5-甲基胞嘧啶(5-mC)免疫荧光法检测该细胞的细胞周期和细胞基因组整体甲基化水平.结果 16HBE-shDNMT1-4细胞株的DNMT1蛋白表达与对照组相比平均降低约44%,差异有统计学意义(P＜0.05),但细胞周期和基因组整体甲基化水平无明显改变.结论 成功建立DNMT1基因低表达的16HB细胞株,其细胞周期和基因组整体甲基化水平无明显改变.

Abstract：

Objective To construct DNA methyltransferase 1 (DNMT1) low expression 16HBE cell line and observe the variation of cell cycle and global genomic DNA methylation. Methods The method of Lenti-virus induced RNA interference was applied to introduce four different shRNA fragment into 16HBE cells. Flow cytometry and 5-mC immunofluorescence methods were used to observe the cell cycle and global DNA methylation status of DNMT1 low expression 16HBE cells. Results The DNMT1 protein relative expression level of 16HBE-shDNMT1-4 cell line was down regulated about 44%(P＜0.05 ) compared with the control. No obvious differences of cell cycle and global genome DNA methylation status were observed between the 16HBE and 16HBE-shDNMT1. Conclusion The DNMT1 gene low expression cell is successfully constructed, and there are no obvious changes happened on the cell cycle and global genomic DNA methylation.     

镉亚急性暴露对小鼠肝肾功能及甲基化水平的影响

[目的]初步探讨氯化镉(cadmium chloride,CdCl2)亚急性暴露(4周染毒)对小鼠肝肾功能、全基因组甲基化水平及去甲基化酶Tet1表达的影响. [方法]将48只SPF级KM小鼠(昆明小鼠,雌雄各半)随机分为4组:对照组(ddH2O)、CdCl2 17.5 mg/kg组、25 mg/kg组、35 mg/kg组.经口灌胃染毒(每天1次、每周5d),共染毒4周,CO2麻醉法处死动物.测定肝脏和肾脏的脏器系数、血液常规及血液生化检查、肝肾组织病理学检查、全基因组DNA甲基化水平及Tet1酶表达水平. [结果]35 mg/kg染毒组小鼠活动度及精神状态较差.小鼠体重在各染毒周期和染毒剂量组间差异均有统计学意义,且存在交互作用(P＜ 0.05).与对照组相比,雄性小鼠肝脏质量和肝脏脏器系数在25 mg/kg和35 mg/kg剂量组差异具有统计学意义(P＜0.05);血液常规检查结果显示,雌、雄性小鼠35 mg/kg染毒组血液白细胞(WBC)、血小板(PLT)、淋巴细胞(LYM)计数,均高于对照组(P＜0.05);雄性小鼠在各个染毒剂量组间,WBC、PLT、LYM、RBC计数差异有统计学意义(P＜0.05).此外,血生化实验结果显示,各剂量组雄性和雌性小鼠中肝功能的主要指标谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)差异有统计学意义(P＜0.05),肾功能的主要指标尿酸(UA)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CR)差异均有统计学意义(P＜0.05).组织病理学分析发现25 mg/kg和35 mg/kg组雄性小鼠肝脏及肾脏呈现明显的病理性改变.Tet1 mRNA及其蛋白表达水平仅在雄性小鼠的肝脏、肾脏中表达的差异有统计学意义(P＜0.05).焦磷酸测序结果显示,雄性小鼠肝脏、肾脏甲基化水平表达差异有统计学意义(P＜0.05),且其与Tet1 mRNA表达呈负相关(r=-0.473,P＜0.05;r=-0.134,P＜0.05). [结论]CdCl2亚急性染毒可以诱导小鼠肝肾功能损伤,且对全基因组甲基化水平和去甲基化酶Tet1表达呈现出性别差异影响,雄性小鼠的肝肾组织Tet1表达参与调控全基因组DNA甲基化水平改变.     

燃煤污染型砷中毒人群MGMT基因甲基化、转录及表达的研究

目的了解O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因(MGMT基因)启动子区甲基化、转录及表达以及DNA甲基转移酶1(DNMT1)的转录及表达与砷中毒的关系。方法采集68例燃煤污染型砷中毒(以下简称砷中毒)患者(轻度24例、中度28例、重度16例)及23例非病区居民外周血。用甲基化特异性PCR法(MSP)检测MGMT基因启动子区甲基化,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测MGMT及DNMT1 mRNA的水平。利用自愿手术治疗的砷中毒患者皮肤组织标本(61例,其中34例为一般病变,21例为癌前病变,6例为癌变)和对照皮肤组织标本(15例),以免疫组织化学(IHC)法检测砷中毒患者及对照皮肤组织中MGMT及DNMT1蛋白的表达。结果 MGMT基因启动子区甲基化阳性率与砷中毒程度有关(χ2=13.739,P0.01)。砷中毒组MGMT mRNA表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P0.05);MGMT基因启动子区甲基化患者和非甲基化患者之间MGMT mRNA和DNMT1 mRNA表达差异无统计学意义(P0.05)。但轻、中度患者DNMT1 mRNA表达明显低于对照组(P0.01);癌前病变组和癌变组皮肤组织中MGMT蛋白表达明显低于对照组(P0.01),与皮肤损害程度有关(rs=-0.446,P0.01);MGMT基因启动子区甲基化患者MGMT蛋白表达明显低于非甲基化组(P0.05)。砷中毒组皮肤组织中DNMT1蛋白表达强于对照组(P0.01),并与皮肤损害程度有关(rs=0.740,P0.01);且MGMT基因启动子区甲基化患者组织中DNMT1蛋白表达明显高于非甲基化组(P0.05)。结论 MGMT基因启动子区高甲基化抑制了燃煤污染型砷中毒患者皮肤组织中MGMT蛋白的表达,且DNMT1蛋白的高表达参与了此抑制过程。     

短期暴露于纳米SiO_2对HaCaT细胞基因组DNA甲基化的影响

目的探讨纳米SiO2对体外培养细胞基因组总体DNA甲基化水平的影响。方法分别以2.5、5、10μg/ml纳米SiO2溶液和10μg/ml微米级SiO2处理人皮肤表皮细胞系(HaCaT)24h;以3μmol/L DNA甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(DAC)处理48 h的10μg/ml组为阳性对照,并设立溶剂对照组。应用高效毛细管电泳(HPCE)定量分析纳米SiO2处理细胞24h后,基因组DNA总体甲基化的变化,用Q-PCR和Western Blot方法检测甲基化相关蛋白mRNA和蛋白的表达变化,并用DNA甲基化转移酶活性试剂盒检测DNA甲基化转移酶的活性。结果 HPCE定量分析结果显示纳米SiO2可引起HaCaT细胞总体甲基化程度降低,呈剂量依赖性关系;与正常细胞相比,微米SiO2以及2.5、5和10μg/ml纳米SiO2组分别降低37.8%、43.9%、54.9%和52.8%,差异有显著性(P<0.05);对照组5-aza-dC处理后使HaCaT细胞甲基化程度减少27.3%。各组酶的蛋白表达与mRNA表达水平及DNMTs活性变化具有相同的变化趋势,经纳米SiO2处理的HaCaT细胞,DNMT1、DNMT3a及MBD2表达随着纳米SiO2剂量的上升而下降,DAC组表达水平最低。结论纳米SiO2能引起HaCaT细胞整体基因组DNA甲基化水平降低,可能与DNA甲基化转移酶的酶活性降低有关。     

肥胖小鼠DNA甲基化改变以及n-3多不饱和脂肪酸的影响作用

【目的】 探讨肥胖状态下脂肪组织基因组DNA甲基化及甲基转移酶表达改变以及n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFAs)的影响作用。 【方法】 使用30只3~4周龄C57BL/6J雄性小鼠,随机分为3组,每组10只。小鼠分别给予两种高脂饲料(脂肪含量为34.9%,供能比为60%)-n-6 PUFAs(脂肪来源于葵花籽油)饲料和n-3 PUFAs(脂肪来源于鱼油)饲料喂养14周;以正常脂饲料(脂肪含量为4.3%,供能比为10%)(脂肪来源于葵花籽油)为对照。喂养结束后对小鼠脂肪组织基因组DNA总甲基化以及甲基转移酶(DNMTs)进行测定。 【结果】 与正常脂饲料喂养小鼠相比,两组高脂饲料诱导肥胖小鼠的脂肪组织DNA总甲基化程度均明显升高,但n-3 PUFAs高脂饲料组升高的程度显著低于n-6 PUFAs组。n-6 PUFAs高脂饲料诱导肥胖小鼠的脂肪组织DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达均显著高于正常脂饲料组小鼠,而n-3 PUFAs高脂饲料喂养小鼠脂肪组织中这3种酶的表达无变化。 【结论】 肥胖状态下脂肪组织基因组DNA甲基化程度升高;鱼油n-3 PUFAs具有抑制DNA甲基化的作用。     

亚砷酸钠致早期鸡胚胚胎发育毒性与基因甲基化的关系

目的:研究亚砷酸钠致鸡胚胚胎毒性与基因组DNA整体甲基化的关系以及补充甲基供体胆碱对无机砷致胚胎毒性的影响。方法:以鸡胚为模式动物检测亚砷酸钠及其与胆碱联合处理对鸡胚生存能力、体重及形态的影响;采用whole-mount免疫荧光技术检测鸡胚基因组DNA整体甲基化水平;应用荧光定量PCR技术,研究受甲基化调节的bcl2、c-myc、cdkn2a,calb2基因在不同处理组鸡胚中的表达模式。结果:砷处理组鸡胚存活率下降(P<0.01),体重降低(P<0.01),并诱导鸡胚发育畸形,基因组DNA整体甲基化水平降低(P<0.01),受甲基化调节的基因bcl2(P<0.05)、c-myc(P<0.01)表达下调;补充甲基供体胆碱,未明显恢复鸡胚的生存力和改变鸡胚发育异常,对鸡胚基因组DNA整体甲基化水平亦无明显影响,但c-myc(P<0.01)、cdkn2a(P<0.01)、calb2(P<0.05)基因的表达均显著下降。结论:亚砷酸钠能够诱导鸡胚发育异常,其作用可能是通过降低基因组DNA整体甲基化水平实现。补充甲基供体胆碱不能拮抗其致畸效应。     

叔丁基对苯二酚对Chang肝细胞无机砷甲基化代谢的影响

目的探讨叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)对Chang肝细胞无机砷甲基化代谢的影响。方法将Chang肝细胞密度调整为1×105个/ml,采用25μmol/L tBHQ溶液预处理24 h后,再用5μmol/L的tBHQ溶液和0.1、0.5、1.0和5.0μmol/L亚砷酸钠溶液联合染毒24 h;并采用0.1、0.5、1.0和5.0μmol/L亚砷酸钠溶液单独染毒24 h;并设溶剂对照(三蒸水)。采用超低温捕集-氢化物发生-原子吸收分光光度法分别测定细胞内和培养液中的无机砷(inorganicarsenic,iAs)、一甲基砷(monomethylated arsenic,MMA)和二甲基砷(dimethylated arsenic,DMA)含量,并计算一甲基化率(primary methylation index,PMI)和二甲基化率(secondary methylation index,SMI)。结果随着亚砷酸钠染毒剂量的增加,亚砷酸钠单独染毒组和tBHQ+亚砷酸钠染毒组Chang肝细胞内tAs和iAs含量及Chang肝细胞和培养液中的总MMA含量均升高;亚砷酸钠单独染...     

亚砷酸钠对人淋巴细胞白细胞介素和穿孔素及颗粒酶B的影响

目的探讨亚砷酸钠体外染毒对人淋巴细胞白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、穿孔素(perforin,PFP)和颗粒酶B(granzyme B,Gr B)水平的影响。方法采集健康成年人外周血,密度梯度离心分离出淋巴细胞,分别暴露于含终浓度为0.00(对照)、5.00、10.00、20.00、30.00μmol/L亚砷酸钠的培养基染毒12、24、48 h。采用HE染色法鉴定染毒模型;MTT比色法检测细胞存活率;ELISA法检测IL-6、IL-10、PFP和Gr B的水平。结果与不同时间的对照组相比,5.00μmol/L亚砷酸钠染毒组淋巴细胞的存活率均升高,而10.00~30.00μmol/L亚砷酸钠染毒组淋巴细胞的存活率均降低,差异有统计学意义(P0.05)。与相同浓度亚砷酸钠染毒12 h比较,20.00、30.00μmol/L亚砷酸钠染毒24 h及10.00~30.00μmol/L亚砷酸钠染毒48 h淋巴细胞的存活率均降低,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,10.00~30.00μmol/L亚砷酸钠染毒12 h组和各浓度亚砷酸钠染毒24 h组及20.00、30.00μmol/L亚砷酸钠染毒48 h组淋巴细胞分泌的IL-6水平均较高,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,30.00μmol/L亚砷酸钠染毒12 h组和20.00、30.00μmol/L亚砷酸钠染毒24 h组及10.00~30.00μmol/L亚砷酸钠染毒48 h组淋巴细胞分泌的IL-10水平均较高,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,10.00~30.00μmol/L亚砷酸钠染毒12、24 h组及各浓度亚砷酸钠染毒48 h组淋巴细胞分泌的PFP水平均较高,差异有统计学意义(P0.05)。与相同浓度亚砷酸钠染毒12 h比较,各浓度亚砷酸钠染毒组淋巴细胞分泌的PFP水平均升高,除10.00μmol/L亚砷酸钠染毒24 h外,差异均有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,30.00μmol/L亚砷酸钠染毒12 h组和20.00、30.00μmol/L亚砷酸钠染毒24、48 h组淋巴细胞分泌的Gr B水平均较高,差异有统计学意义(P0.05)。不同浓度亚砷酸钠染毒12、24、48 h后淋巴细胞分泌的IL-6、IL-10、Gr B水平间比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论砷暴露可诱导IL-6、IL-10、穿孔素及颗粒酶B表达水平升高,导致细胞因子分泌平衡紊乱,此可能在砷致免疫系统损伤中发挥重要作用。     

6Co γ射线诱发小鼠DNA甲基化改变

目的 探讨基因组启动子甲基化谱及DNA甲基化酶1(DNMT1)表达量在60Co-γ射线照射小鼠各组织的变化及其意义.方法SPF级C57BL/6J雄性小鼠12只随机分为对照组和照射组,照射组小鼠接受4Gy60 Co-y射线单次全身照射后,均眼球摘除取血后处死,收集各脏器组织,进行外周血白细胞计数和骨髓嗜多染红细胞微核计数,应用甲基化DNA免疫沉淀-芯片(MeDIP-chip)杂交技术对y射线照射小鼠肝组织基因组启动子(promoter) CpG岛甲基化改变进行分析,并采用免疫组化(SP)法和蛋白质印记( western blot)法检测小鼠各组织DNMT1的表达情况.结果与对照组比较,照射组小鼠基因组启动子甲基化谱发生了明显改变,照射组1 300个基因的启动子CpG岛发生了新的甲基化,660个基因发生去甲基化;提高筛选标准,最后可得到发生明显甲基化的基因有Trim71、Sema3f、Pcdh8、Sox4、1110034A24Rik、Limk1、Nef1、Xpr1,明显去甲基化的基因有Sfrs18、Dr1、Ankrd42、Nae1、Sii1、Accn1、Srd5a1、Nsun2、Eif1a、Dusp5;照射组小鼠除肺组织外肝脏、肾、睾丸及脑组织的DNMT1表达量均高于对照组(P＜0.05).结论在电离辐射损伤中基因组启动子甲基化模式发生了改变,DNMT1表达增加可能是导致启动子发生甲基化的原因.     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古抑酶素A对亚砷酸钠处理细胞中DNMT1和HDAC1基因转录及表达的影响

目的 探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-AZA-dC)和曲古抑酶素A(TSA)对亚砷酸钠(NaAsO2)处理的人皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)中DNA甲基转移酶1(DNMT1)、组蛋白去乙酰化酶1(HDA C1)基因mRNA转录和蛋白表达的影响.方法 以25 μmol/L NaAsO2重复间隔染毒HaCaT细胞72 h(25 μmol/L NaAsO2处理24h,隔天再次进行相同处理,共处理3次),再分别以1.5、3.0、6.0 μmol/L 5-AZA-dC作用于NaAsO2处理细胞72 h,125、250、500 nmol/L TSA作用于NaAsO2处理细胞48 h,以实时荧光定量PCR(Q-PCR)技术检测DNMT1及HDA C1基因的mRNA转录,以免疫印迹分析(western blotting)检测DNMT1及HDAC1蛋白表达.设不进行任何处理的细胞为空白对照,仅染砷的细胞为阳性对照.结果 1.5、3.0、6.0 μmol/L 5-AZA-dC作用于NaAsO2处理细胞后,DNMT1及HDAC1 mRNA转录相对表达量与仅染砷的阳性对照比较,差异无统计学意义;DNMT1蛋白相对表达量降低,与仅染砷的阳性对照比较,差异有统计学意义(P＜0.05);HDAC1蛋白相对表达量与仅染砷的阳性对照比较,差异无统计学意义.125、250、500 nmol/L TSA作用于NaAsO2处理细胞后,DNMT1及HDAC1 mRNA转录相对表达量与仅染砷的阳性对照比较,差异无统计学意义;DNMT1及HDAC1蛋白相对表达量降低,与仅染砷的阳性对照比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 5-AZA-dC能抑制砷所致的DNMT1蛋白高表达,TSA能抑制砷所致的DNMT1及HDAC1蛋白高表达,这为进一步探索砷中毒的表观遗传学治疗提供了科学依据.     

人Chang肝细胞对亚砷酸钠蓄积和甲基化能力的研究

目的 探讨Chang肝细胞对砷的蓄积和甲基化能力.方法利用超低温捕集-氢化物发生-原子吸收分光光度法测定不同浓度(0.1、0.2、0.5 μmol/L)亚砷酸钠染毒条件下Chang肝细胞在培养24、48和72h时,细胞内和培养液中的不同形态砷化物含量.结果 同一染毒水平下,Chang肝细胞对砷的蓄积率随染毒时间的延长上升(P<0.05);24h各染毒剂量组对砷的蓄积率差异无统计学意义(P>05);48h0.1和0.2μmol/L染毒组对砷的蓄积率显著高于0.5μmol/L染毒组(P<0.05);72h0.1μmol/L染毒组对砷的蓄积率显著高于0.2和0.5μmol/L染毒组(P<0.05);72h0.1μmol/L染毒组细胞对砷的蓄积率最高,为13.78%.同等染毒剂量下,细胞对砷的甲基化率随染毒时间延长而升高(P<0.05);同一染毒时段,0.5μmol/L染毒组细胞甲基化率显著低于0.1和0.2μmol/L染毒组(P<0.05).结论 Chang肝细胞对砷的蓄积和甲基化能力较弱,且随染毒剂量升高,Chang肝细胞对砷的蓄积和甲基化能力呈下降趋势.     

子痫前期胎盘全基因组DNA甲基化水平研究

目的:探讨子痫前期(pre-eclampsia PE)胎盘全基因组DNA甲基化水平。方法:收集子痫前期患者胎盘标本21例,分为足月组(9例)和非足月组(12例),另选择正常孕妇胎盘19例作为对照。检测胎盘全基因组DNA甲基化水平,并收集患者的临床资料进行回顾性研究。结果:子痫前期足月组胎盘与正常胎盘全基因组DNA甲基化水平差异无统计学意义(P>0.05),非足月组较正常胎盘差异有统计学意义(P<0.05);非足月组子痫前期胎盘全基因组DNA甲基化水平仅与收缩压存在相关性,与24 h尿蛋白定量无关。结论:表观遗传修饰异常存在于非足月分娩的子痫前期胎盘中,可能参与了子痫前期发生发展。     

雌鼠全氟辛烷磺酸暴露对仔鼠DNA甲基化影响

目的 探讨大鼠出生前暴露于全氟辛烷磺酸(PFOS)对其出生后肝脏可能发生的DNA甲基化修饰程度的改变.方法 在雌性SD大鼠受孕后2～21 d,给予不同剂量PFOS[0(对照),0.1,0.6,2.0 mg/kg]灌胃染毒,子鼠出生后21 d,收集肝脏,用总甲基化检测试剂盒进行DNA总甲基化水平检测,并用亚硫酸氢钠处理后测序法(BSP)产物纯化结合质粒克隆后测序法检测LINE-1的甲基化状态,以及用AP-PCR方法评估胞嘧啶鸟嘌呤(CpG)岛的甲基化状态.结果 总甲基化水平在高剂量组明显降低(P＜0.05),均值为对照组的(90.8±4.7)%;测序显示LINE-1的甲基化水平各组间差异无统计学意义(P＞0.05);各剂量组CpG岛甲基化水平均与对照组有明显差异(P＜0.05);DNA甲基转移酶(DNMT)DNMT 3 a在高剂量组表达明显升高.结论 总甲基化与出生前PFOS暴露水平相关,CpG岛甲基化状态也与出生前PFOS暴露水平相关.     

赖氨酸甲基转移酶PR-Set7在亚砷酸钠致人永生化皮肤角质形成细胞DNA损伤中的作用

目的探讨组蛋白甲基转移酶PR-Set7在亚砷酸钠致人永生化皮肤角质形成细胞(Ha Ca T细胞)DNA损伤中的作用机制。方法将处于对数生长期的Ha Ca T细胞暴露于含终浓度分别为0(对照)、1.25、2.5、5、10μmol/L亚砷酸钠的DMEM高糖培养基染毒24 h。采用MTT法测定Ha Ca T细胞的存活情况。另设对照(24 h)组、亚砷酸钠(10μmol/L,24 h)染毒组、PR-Set7小干扰RNA干扰组(Si PR-Set7,50 nmol/L,48 h)和联合暴露(50 nmol/L Si PR-Set7干扰48 h后,10μmol/L亚砷酸钠暴露24 h)组。分别采用q RT-PCR法检测PR-Set7 m RNA的表达水平,采用Western blot法检测H4K20me1和PR-Set7蛋白的表达水平,采用单细胞凝胶电泳法检测DNA损伤水平。结果与对照组相比,5、10μmol/L亚砷酸钠染毒组Ha Ca T细胞的存活率均较低,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,5、10μmol/L亚砷酸钠染毒组Ha Ca T细胞PR-Set7蛋白和m RNA的表达水平均升高,而H4K20me1蛋白的表达水平降低;2.5、5、10μmol/L亚砷酸钠染毒组Ha Ca T细胞尾部DNA%及尾矩升高,差异有统计学意义(P0.05)。随着亚砷酸钠染毒浓度的升高,Ha Ca T细胞PR-Set7蛋白和m RNA的表达水平均呈上升趋势,而H4K20me1蛋白和m RNA的表达水平呈下降趋势,DNA损伤水平(尾部DNA%及尾矩)呈上升趋势。与对照组比较,Si PR-Set7干扰组Ha Ca T细胞PR-Set7蛋白的表达大幅下降;亚砷酸钠染毒组、Si PRSet7干扰组和联合暴露组Ha Ca T细胞H4K20me1蛋白的表达水平均降低,而尾部DNA%及尾矩均升高,差异有统计学意义(P0.05)。与亚砷酸钠染毒组比较,联合暴露组Ha Ca T细胞PR-Set7蛋白和m RNA以及H4K20me1蛋白的表达均降低,而Ha Ca T细胞尾部DNA%及尾矩均升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论在对Ha Ca T细胞进行PR-Set7干扰后,亚砷酸钠可能通过抑制组蛋白甲基转移酶PR-Set7蛋白及m RNA的表达水平,从而降低H4K20me1的修饰水平,影响Ha Ca T细胞DNA损伤修复能力,使DNA损伤加重。