氟化钠对大鼠成骨肉瘤细胞增殖活性及碱性磷酸酶活力和骨钙素mRNA表达的影响

目的探讨氟化钠(NaF)对成骨样细胞大鼠骨肉瘤(UMR-106)细胞增殖活性及主要成骨活性标志物碱性磷酸酶(ALP)活力和骨钙素(BGP)mRNA表达的影响。方法将处于对数生长期的UMR-106细胞分别暴露于含终浓度为0(对照)、5×10、10~2、5×10~2、1×10~3、5×10~3、1×10~4、2×10~4、4×10~4、8×10~4μmol/L NaF的DMEM培养液中孵育24、48 h,采用CCK-8检测细胞活性。将处于对数生长期的UMR-106细胞分别暴露于含终浓度为0(对照)、1×10~3、2×10~3、4×10~3μmol/L NaF的DMEM培养液(不含FBS)继续培养12、24、48 h,测定细胞培养液和细胞ALP的活力及细胞中BGP mRNA的表达水平。结果与对照组比较,1×10~3~8×10~4μmol/L NaF染毒24 h和5×10~8×10~4μmol/L NaF染毒48 h时大鼠UMR-106细胞的存活率均较低,差异有统计学意义(P0.05)。5×10、1×10~3、5×10~3、1×10~4、2×10~4μmol/L NaF染毒48 h时大鼠UMR-106细胞的存活率均低于染毒24 h时,差异有统计学意义(P0.05)。各浓度NaF染毒组UMR-106细胞培养液和细胞中ALP活力均较对照组高,除1×10~3μmol/L NaF染毒24 h的细胞培养液和1×103μmol/L NaF染毒48 h的细胞内ALP活力外,差异有统计学意义(P0.05)。随着NaF染毒浓度的升高,UMR-106细胞培养液和细胞中ALP活力均呈上升趋势;随着NaF染毒时间的延长,细胞培养液中ALP的活力呈上升趋势,而细胞中ALP的活力呈先升高后下降的趋势。2×103、4×103μmol/L NaF染毒组UMR-106细胞的BGP mRNA表达水平均较对照组高,差异有统计学意义(P0.05)。随着NaF染毒浓度的升高,UMR-106细胞BGP mRNA的表达水平呈上升趋势;随着NaF染毒时间的延长,UMR-106细胞BGP mRNA的表达水平呈下降趋势。结论在本实验浓度下,NaF对UMR-106细胞的增殖呈抑制作用,但可促进其成骨活性标志物ALP活力及BGP mRNA的表达。     

氟化钠对成骨细胞内Gs/Gi-AC-PKA信号途径的影响

目的探讨氟化钠(NaF)对大鼠成骨骨肉瘤UMR-106细胞及小鼠MC3T3-E1成骨细胞内Gs/Gi-AC-PKA信号途径的影响。方法以不同剂量NaF染毒UMR-106和MC3T3-E1细胞,培养24 h,用CCK-8法测定细胞增殖活性;用qPCR和Western Blot分别测定刺激性G蛋白(Stimulating adenylate cyclase g protein,Gs)、抑制性G蛋白(inhibitory adenylate cyclase g protein,Gi)、腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的mRNA和蛋白的表达水平。结果 UMR-106细胞和MC3T3-E1细胞NaF染毒后的存活率随NaF浓度增加而降低(P0.05);不同剂量组之间,UMR-106细胞和MC3T3-E1细胞Gs、Gi mRNA的表达差异有统计学意义(P0.05),且随着染毒剂量的升高呈先升高后下降趋势;AC mRNA表达及蛋白表达差异均有统计学意义(P0.05),且呈明显下调趋势;UMR-106细胞和MC3T3-E1细胞的PKA mRNA和蛋白的表达差异有统计学意义(P0.05),且随着染毒剂量的增加而呈明显上升趋势。结论 Gs/Gi-AC-PKA信号途径在氟骨症的形成过程中可能发挥一定作用。     

氟化钠对大鼠成骨肉瘤细胞UMR-106成骨活性标志物的影响

目的研究氟化钠(Na F)对大鼠成骨肉瘤细胞UMR-106成骨活性标志物的影响。方法体外培养的UMR-106细胞,分别以0,500,1 000,2 000μmol/L Na F处理24h、48h、72h。应用实时荧光定量PCR法检测各组碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、I型胶原蛋白(Col I)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)mRNA的表达;采用磷酸苯二钠法及蛋白免疫印迹法检测各组ALP活性和Col I、Runx2蛋白表达。结果 Na F处理UMR-106细胞24h后,各浓度Na F均能刺激BGP基因表达;与对照组比较,Na F浓度高于1 000μmol/L时,ALP、Runx2、BMP-2基因表达减弱;Na F处理72h后,500μmol/L组ALP、Runx2、BGP基因表达上调;Na F处理48h、72h后,当Na F浓度高于1000μmol/L时,ALP、Runx2、BMP-2表达及Ⅰ型胶原的合成随着Na F浓度的增高,抑制作用逐渐增强。UMR-106细胞及细胞培养液中ALP活性在24h 2 000μmol/L组及48h,72h 1 000μmol/L组明显升高,随着Na F浓度的升高,UMR-106细胞Col I蛋白的表达呈下降趋势。Runx2蛋白在2 000μmol/L组降低,差异有统计学意义。结论氟化钠对成骨肉瘤UMR-106细胞成骨活性具有双向作用,与氟化钠剂量及细胞因子间联合作用有关。     

miR-208转染中国仓鼠肺成纤维细胞后炎症基因程序性细胞死亡因子-4表达的改变

目的研究miR-208转染中国仓鼠肺成纤维(CHL)细胞对炎症相关靶基因程序性细胞死亡因子-4(PDCD4)的调控作用。方法运用在线数据库Targetscan.org预测前期纳米二氧化硅经气管一次性灌注大鼠实验中筛选出差异表达上调miR-208可能调控的靶基因,并进行基因本体论(GO)分析,通过文献检索选择与炎症相关的靶基因为PDCD4;分别用miR-208模拟物、模拟物阴性对照转染CHL细胞,并设空白对照组(完全培养基),测定细胞增殖率和miR-208及PDCD4的mRNA表达水平及PDCD4蛋白的表达水平。结果预测miR-208可能调控的靶基因有146个。与空白对照组相比,转染后CHL细胞的增殖率差异无统计学意义(P0.05),miR-208 mRNA的表达增加(P0.01),PDCD4 mRNA和蛋白的表达无统计学意义(P0.05)。结论在CHL细胞中未见miR-208对PDCD4有间接调控作用,是否存在直接调控作用有待进一步研究。     

miR-369-3p和COL11A1对卵巢癌细胞增殖 迁移及侵袭的影响

目的探讨miR-369-3p和COL11A1对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响,并分析其分子机制。方法实时定量PCR(qRT-PCR)检测正常卵巢上皮细胞IOSE80和卵巢癌细胞SKOV-3中miR-369-3p、COL11A1 mRNA的水平,在卵巢癌SKOV-3细胞中转染miR-369-3p模拟物和pcDNA-COL11A1以过表达miR-369-3p、COL11A1,CCK8法和Transwell实验分别检测卵巢癌SKOV-3细胞增殖、迁移及侵袭能力,蛋白印迹实验(Western blot)检测细胞中COL11A1、Cyclin D1、p21、MMP-2及MMP-9蛋白水平,双荧光素酶报告系统验证miR-369-3p与COL11A1的调控关系。结果与正常卵巢上皮细胞IOSE80(1.00±0.05、1.01±0.08及0.28±0.03)相比,卵巢癌细胞SKOV-3中的miR-369-3p水平(0.41±0.04)显著降低,COL11A1 mRNA(3.26±0.31)和蛋白(0.64±0.06)水平显著升高,差异均有统计学意义(t=21.083、27.643及16.100,P0.05)。过表达miR-369-3p可降低Cyclin D1、MMP-2及MMP-9蛋白表达量,提高p21表达量,降低细胞OD值、迁移及侵袭细胞个数;miR-369-3p靶向负调控COL11A1的表达;过表达COL11A1可逆转miR-369-3p过表达对SKOV-3细胞增殖、侵袭及迁移的影响。结论 miR-369-3p通过靶向COL11A1调控SKOV-3细胞增殖、迁移及侵袭。miR-369-3p是卵巢癌潜在分子靶点。     

Pkd2基因低表达调控ERK1/2途径诱导血管平滑肌细胞表型转化

目的探讨ERK1/2途径是否参与Pkd2基因低表达诱导主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化及可能分子机制。方法原代培养小鼠主动脉VSMCs,转染Pkd2+/-突变载体,构建Pkd2基因低表达细胞模型。实验共分为空白对照的Control组、Pkd2+/-组、空病毒组、Ets1组(Pkd2促进剂)、PD98059组(ERK抑制剂)、EGF组(ERK激动剂)。Western blot检测多囊蛋白2(PC2,Pkd2编码蛋白)、a-SMA(VSMCs收缩型标志蛋白)、骨桥蛋白(OPN,VSMCs增殖型标志蛋白)、ERK1/2、ERK磷酸化蛋白(P-ERK1/2)表达水平;RT-PCR检测PC2、a-SMA、OPN、ERK1、ERK2 mRNA表达水平;MTT法检测细胞增殖。结果 (1)Pkd2+/-组中PC2蛋白及mRNA表达明显下调,Pkd2基因低表达模型构建成功。(2)Pkd2+/-组中a-SMA表达下调、OPN表达升高,VSMCs细胞增殖明显,细胞发生了表型转化;加入Ets1后被明显抑制(P0.05)。(3)Pkd2+/-组中ERK1/2及P-ERK1/2表达明显升高,加入PD98059后表达被抑制,但PC2表达无变化(P0.05)。(4)Pkd2+/-组中加入PD98059后,a-SMA表达升高、OPN表达下调,VSMCs细胞增殖被抑制,细胞表型转化被抑制。结论 Pkd2基因低表达可以诱导小鼠主动脉VSMCs表型转化,这一过程可能与ERK1/2异常活化有关。     

miR-140通过下调Pin1抑制乳腺癌BT549细胞上皮细胞-间充质转化

目的用miR-140模拟物转染三阴型乳腺癌BT549细胞,检测Pin1在乳腺癌细胞系BT549中的表达情况,研究在BT549细胞中miR-140如何通过Pin1发挥对上皮细胞-间充质转化(EMT)的抑制作用。方法用miR-140模拟物(miR-140模拟物组)、miR-140阴性对照(阴性对照组)转染BT549细胞,同时设置未处理组为空白对照组。利用实时PCR法检测不同组BT549细胞中的Pin1 mRNA表达水平;利用Western Blot检测E-钙黏蛋白及Pin1蛋白的表达水平;利用划痕试验研究转染miR-140对BT549侵袭能力的影响。结果划痕后24 h,miR-140模拟物组、阴性对照组和空白对照组划痕宽度相对0 h变化的比例分别为23.4%、41.4%和53.1%。与阴性对照组和空白对照组相比,miR-140模拟物组BT549细胞迁移能力明显降低(χ~2=5.550,P0.05;χ~2=6.995,P0.05)。miR-140模拟物组、阴性对照组和空白对照组Pin1 mRNA表达水平分别为(0.55±0.02)、(0.89±0.06)和(1.05±0.06)。miR-140模拟物组Pin1 mRNA表达水平显著低于阴性对照组和空白对照组(t=8.823,P0.05;t=11.480,P0.05)。miR-140模拟物组、阴性对照组和空白对照组E-钙黏蛋白表达水平分别为(0.98±0.11)、(0.68±0.07)和(0.38±0.04)。miR-140模拟物组E-钙黏蛋白表达水平显著高于阴性对照组和空白对照组(t=7.990,P0.05;t=21.348,P0.05)。miR-140模拟物组、阴性对照组和空白对照组Pin1蛋白表达水平分别为(0.57±0.12)、(0.78±0.08)和(1.08±0.21)。miR-140模拟物组Pin1蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白对照组(t=8.921,P0.05;t=18.657,P0.05)。结论 miR-140可以抑制Pin1 mRNA转录,进而降低Pin1蛋白的表达水平,抑制EMT的发生。     

miR-34a抑制SW480细胞增殖的机制研究

目的探索miR-34a的生物学功能及其对肠癌细胞的抑制作用。方法通过检索miRTar Base和miRBase数据库,筛选出已经实验验证的miR-34a靶基因,使用Cytoscape软件对筛选出的靶基因进行功能富集分类,构建靶基因相互作用网络,用DAVID数据库对miR-34a的靶基因进行信号通路富集分析;免疫印迹技术检测miR-34a对SIRT1、NOTCH1蛋白表达的影响;MTT法检测转染miR-34a对SW480细胞增殖的影响。结果共有56个基因被确定为miR-34a的靶基因,对靶基因进行功能富集分析包含Wnt Signaling Pathway and Pluripotency、Pathways in cancer、MicroRNAs in cancer、Notch signaling pathway等;对靶基因进行信号通路富集分析(p<0.001;FDR<0.05),共富集到8条通路,包含Pathways in cancer、Small cell lung cancer、Colorectal cancer等。免疫印迹结果显示SW480细胞转染miR-34a类似物后,SIRT1、NOTCH1蛋白的表达水平较对照组明显下降(p<0.01);SW480细胞转染miR-34a类似物后生长速度明显减慢,培养5天后检测两组有显著统计学差异(p<0.05)。结论 miR-34a靶基因参与多个信号通路;miR-34a可能通过负性靶向调控SIRT1、NOTCH1基因的表达而抑制SW480细胞的增殖。     

miR-181a对耳蜗毛细胞c-fos表达调控的研究

目的 探讨在耳蜗毛细胞氧化损伤中表达异常的miR-181a对原癌基因c-fos的生物学调控作用.方法 采用叔丁基过氧化氢(t-BHP)染毒,设50、100、200μmol/L 3个浓度组和未染毒对照组对HEI-CO1细胞染毒12h,提取细胞总RNA及细胞总蛋白,采用荧光定量PCR(qPCR)检测miR-181a/-181d表达;选择表达异常的miR-181a为研究对象,检索生物信息学网站,对c-fos 3'端非翻译区域(3'-UTR)上miR-181a可能的作用靶序列进行预测分析;用脂质体转染入miR-181a的mimics,qPCR检测转染效率;qPCR观察c-fos mRNA水平表达量的改变;免疫印迹(Western blotting)法观察毛细胞中c-fos蛋白表达量的改变;构建野生型的融合c-fos-3' UTR的重组pGL3质粒(pGL3-c-fos-3' UTR-WT),利用双荧光素酶报告基因检测系统检测在高表达miR-181a后荧光素酶活力的改变情况.结果 qPCR结果显示,miR-181a在100、200 μmol/L染毒浓度组表达下调,低表达倍数分别为0.744和0.766,差异均有统计学意义(P＜0.01);而miR-181d在50 μmol/L浓度组表达升高,高表达倍数为1.29,差异亦有统计学意义(P＜0.01),在100、200 μmol/L 2个染毒浓度组中的表达变化的差异无统计学意义(P＞0.05);通过预测显示,在人类和小鼠中,c-fos均受miR-181a的调控,在种子区域完全互补,靶序列在物种之间也十分保守;脂质体转染入miR-181a mimics 24h后,qPCR结果显示,在miR-181a mimics转染组中miR-181a升高892.979倍;与对照组相比,在miR-181a mimics转染组的耳蜗毛细胞中c-fos mRNA的表达增高,差异有统计学意义(P＜0.05);Western blotting观察结果显示,与对照组相比,c-fos蛋白在miR-181a mimics转染组中表达升高,差异有统计学意义(P＜0.01);成功构建pGL3-c-fos-3' UTR-WT的重组质粒,双荧光素报告基因检测系统结果显示,在高表达miR-181a时,野生型pGL3-c-fos-3' UTR-WT报告载体的荧光素酶活力并未受到抑制,反而增强.结论 miR-181a对c-fos mRNA和蛋白的表达无直接抑制作用.c-fos可能不是miR-181a的靶基因,生物信息学预测结果可能是假阳性的.     

miR-182抑制HES激活Notch信号协调TGF-β信号途径促进急性川崎病

目的探讨miR-182抑制HES1激活Notch信号与TGF-β信号途径,促进急性川崎病的发生及与急性川崎病(KD)临床特征的关系。方法通过血液常规检测KD各组的临床研究数据并检测血清miR-182表达水平与KD患儿临床特征的相关性;采用流式细胞法检测各组外周血中Treg细胞比例;qRT-PCR检测各组外周血中Foxp3、TGF-β、TGF-βRI、TGF-βRII及Smad3、Smad4 mRNA的表达水平;qRT-PCR检测各组中Notch信号途径配体Notchl、Notch3 mRNA及Notch信号途径受体Jagged1、Jagged2 mRNA的表达水平;RT-PCR检测Notch信号途径靶基因HES1 mRNA的表达水平;利用靶基因数据库、荧光素酶报告基因法、qRT-PCR及Western blot检测HES1为miR-182的靶基因及相关靶向调控关系;Western blot检测在HES1处理组中Notch及TGF-β途径受体Notch1、Notch3、TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4的磷酸化蛋白表达。结果 KD急性组血清中miR-182表达量相对较低;miR-182表达与KD急性期患儿的血小板计数有关(P0.05);KD急性组Foxp3、TGF-β、TGF-βRI、TGF-βRII、Smad3、Smad4、Notch1、Notch3、Jagged1、HES1 mRNA的表达水平明显低于KD治愈组和正常对照组;miR-182能够抑制HES1的mRNA翻译及其蛋白表达;HES1激活了Notch及TGF-β信号通路,诱导了途径受体表达升高。结论 miR-182可以通过下调HES1的表达影响Notch及TGF-β信号途径Treg细胞减少,导致促进急性川崎病的病理进程,miR-182与HES1的靶向调控可能会成为急性川崎病检测与治疗医学的新靶点。     

氟对原代培养的大鼠成骨细胞分化相关指标的影响

目的研究氟对原代培养的大鼠成骨细胞的细胞活性及对成骨细胞分化相关指标的影响。方法取出生24 h内的大鼠胎鼠的颅盖骨,采用胰酶和Ⅱ型胶原酶交替消化的方法获得原代成骨细胞。分别加入终浓度为0(对照组)、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L氟化钠进行染毒72 h,采用MTT法检测细胞活性;染氟72 h后,采用Real-time RT-PCR法检测成骨细胞分化标志物COL1A1、ALP和ON mRNA的表达情况;染氟5 d后,采用染色法检测成骨细胞ALP蛋白的表达情况。结果与对照组相比,10-6~10-4 mol/L染氟组成骨细胞存活率及10-7~10-5 mol/L染氟组成骨细胞ALP蛋白的表达水平均较高,差异有统计学意义(P0.05,P0.01);且随着NaF染毒浓度的升高,成骨细胞存活率和ALP蛋白的表达水平均呈先升高后下降的趋势。与对照组相比,各浓度NaF染毒组成骨细胞ALP、ON mRNA的表达水平及10-7、10-6 mol/L NaF染毒组成骨细胞COL1A1 mRNA的表达水平均升高,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论本实验条件下,较低剂量的氟可促进大鼠成骨细胞的分化。     

miR-146a和miR-196a2基因多态性对高危型 HPV感染者宫颈癌易感性的影响

目的探讨微小RNA(miR)-146a和miR-196a2基因多态性对高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染患者宫颈癌易感性的影响及诊断价值。方法选择2018年1月-2019年12月海南医学院第二附属医院收治的高危型HPV感染宫颈癌患者70例作为宫颈癌(CC)组,选择同期接受治疗的高危型HPV感染宫颈上皮内瘤变(CIN)患者70例作为CIN组,选择同期无宫颈病变但存在高危型HPV感染的体检者50名作为对照组。分别采用DNA测序法和2~(-△△ct)法检测三组miR-146a基因rs2910164位点、miR196a2基因rs11614913位点基因多态性及其mRNA表达水平。采用受试者工作特征曲线(ROC)对其诊断价值进行评价。结果三组研究对象miR-146a基因rs2910164位点GC、CC基因型、miR196a2基因rs11614913位点CC、TT分布差异具有统计学意义(P0.05);三组研究对象整体miR-146a基因rs2910164位点G/C等位基因、miR196a2基因rs11614913位点C/T等位基因分布差异具有统计学意义(P0.05); CC组miR-146a mRNA、miR196a2 mRNA表达水平高于CIN组及对照组,CIN组高于对照组(P0.05); ROC分析结果显示,外周血中miR-146a、miR196a2 mRNA诊断CC的曲线下面积(AUC)均0.7。结论 miR-146a和miR-196a2基因多态性可能是本地区高危型HPV感染女性宫颈癌的易感因素,其mRNA水平对于宫颈癌具有一定的诊断价值。     

结肠癌细胞OPN和HIF-1a基因表达水平与结肠癌恶性生物学行为的关系

目的探讨结肠癌细胞OPN和HIF-1a基因表达水平与结肠癌细胞恶性生活学行为的关系。方法培养人结肠癌细胞,采用荧光定量PCR法检测患者细胞中OPN和HIF-1a的表达水平,并检测细胞增殖、迁移、侵袭功能。结果腺病毒转染后12 h、24 h、36 h、48 h,rAd-OPN组和rAd-HIF-1a组细胞中OPN和HIF-1a基因表达mRNA含量均高于rAd-NC组,rAd-OPN组和rAd-HIF-1a组细胞迁移率均高于rAd-NC组,rAd-OPN和rAd-HIF-1a组的穿膜细胞数目均多于rAd-NC组,以上差异均有统计学意义(P0.05)。结论 OPN和HIF-1a基因高表达的重组腺病毒能够抑制结肠癌恶性生物学行为。     

丙泊酚调控miR-133a/SOX4表达对结直肠癌HCT116细胞增殖凋亡的影响

目的探讨丙泊酚对结直肠癌HCT116细胞增殖凋亡的影响及其机制。方法以1、5和10μg/mL丙泊酚处理HCT116细胞后,采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞检测细胞凋亡,real-time PCR检测细胞中miR-133a的表达,Western blot检测细胞中SOX4蛋白的表达。采用双荧光素酶基因报告实验检测miR-133a与SOX4的靶向关系。将HCT116细胞分为对照组、丙泊酚组、丙泊酚+anti-NC组和丙泊酚+anti-miR-133a组,采用脂质体法将miR-133a inhibitor转染至HCT116细胞后,观察miR-133a低表达对10μg/mL丙泊酚作用下HCT116细胞增殖、凋亡和SOX4蛋白表达的影响。结果丙泊酚呈浓度-时间依赖性抑制HCT116细胞增殖,丙泊酚显著促进HCT116细胞凋亡和miR-133a表达并抑制SOX4蛋白的表达,且表现为浓度依赖性。双荧光素酶基因报告实验证实SOX4是miR-133a的靶基因。与对照组相比,丙泊酚组、丙泊酚+anti-miR-NC组和丙泊酚+anti-miR-133a组细胞中miR-133a表达显著升高,而SOX4蛋白的表达水平显著降低,细胞增殖能力显著受到抑制,而细胞凋亡显著增强,差异均有统计学意义(P<0.05);与丙泊酚组相比,丙泊酚+anti-miR-133a组中miR-133a表达水平显著降低,而SOX4蛋白的表达水平显著升高,细胞的增殖能力显著增强,而细胞凋亡能力显著减弱,差异均有统计学意义(P<0.05);而丙泊酚+anti-miR-NC组细胞中miR-133a和SOX4蛋白的表达以及细胞的增殖和凋亡能力均无显著改变,差异无统计学意义(P>0.05)。结论丙泊酚可通过调控miR-133a/SOX4表达抑制HCT116细胞增殖并促进细胞凋亡。     

微小RNA-155、微小RNA-146a在早产儿革兰氏阴性菌易感性中的作用

目的探索微小RNA-155(miR-155)、微小RNA-146a(miR-146a)在早产儿革兰氏阴性菌易感性中作用。方法分别分离培养早产儿及对照组足月儿的脐血单核巨噬细胞,给予革兰氏阴性菌胞壁成分脂多糖(LPS)刺激,实时定量PCR检测两组炎性因子白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平,以及正性炎性调控因子miR-155、负性炎性调控因子miR-146a的表达水平差异。同时通过蛋白印记实验,分别检测两组miR-146a、miR-155靶分子IRAK1、SOCS1蛋白水平差异。结果与对照组足月儿相比,LPS刺激后早产儿组脐血单核巨噬细胞IL-6、TNF-α、miR-155、IRAK1表达水平升高的更为明显,而其miR-146a、SOCS1表达水平较足月儿组降低,两组差异均有统计学意义(P0.05)。结论早产儿与足月儿相比,miR-155、miR-146a可能分别通过抑制靶分子IRAK1、SOCS1的表达,继而增加炎性因子IL-6、TNF-α的产生,其可能是早产儿对革兰氏阴性菌易感的重要分子机制。     

潜伏结核感染者CD4+T细胞miR-29家族、靶基因IFN-γ的表达及生物信息学分析

目的 探讨潜伏结核感染和活动性肺结核感染对患者外周血CD4+T细胞内miR-29家族及其靶基因IFN-γ表达的影响.方法 于2012年3-12月,在山东省潍坊市某两家医院选取调查对象并分为3组:活动性肺结核组(30例)、潜伏结核感染(LTBI)组(25例)和健康对照组(30名).分离纯化3组受试者外周血中的CD4+T细胞;用核酸杂交与荧光定量PCR检测CD4+T细胞内miR-29a、miR-29b和miR-29c的表达;用定量PCR检测miR-29靶基因IFN-γ的表达;用TargetScan与PicTar联合预测miR-29家族的靶基因;用David数据库和Cytoscape软件对miR-29家族的预测靶基因进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)生物通路富集分析.结果 miR-29a、miR-29b和miR-29c在活动性肺结核组、LTBI组和健康对照组CD4+T细胞中的表达水平均不同(P ＜0.05):miR-29b和miR-29c在活动性肺结核组的表达(561.63±65.36,281.85±42.78)高于健康对照组(260.74±38.69,128.21±19.98),低于LTBI组(2030.29±321.68,620.93±79.14);miR-29a在对照组的表达水平(913.95±104.73)高于活动性结核组(323.37±54.38),低于LTBI组(4782.13±567.81).靶基因IFN-γ在3组之间的表达水平亦不同(P ＜0.05):LTBI组(0.45±0.09)低于健康对照组(1.00),而高于活动性结核组(0.11±0.03).miRNA-29家族的预测靶基因的GO功能富集于细胞外基质结构成分、转录调节活性等分子功能方面;在KEGG的通路数据库中,miR-29家族预测靶基因集合显著富集于局部黏附信号通路、调节细胞骨架与mTOR信号通路等方面.结论 LTBI和活动性结核感染明显增加了患者外周血CD4+T细胞内miR-29家族的表达,降低了其靶基因IFN-γ的表达,从而影响了信号通路等生物学过程.     

甲基汞通过miRNA对人胚胎神经干细胞细胞周期相关基因表达的调控

[目的]通过研究甲基汞对人胚胎神经干细胞miRNA表达的影响,探讨低剂量甲基汞对神经干细胞细胞周期调控基因的调节作用. [方法]以0、10、50 nmol/L甲基汞染毒人胚胎神经干细胞24h后,用MTT法测定甲基汞对细胞活力影响,应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测甲基汞对细胞周期调控基因(p16、p21)的mRNA的表达水平影响,利用实时荧光定量多聚酶链反应技术检测调控p16、p21的miRNA(miR-24、miR-106a)的表达情况. [结果]50 nmol/L甲基汞染毒组细胞活力降低为对照组的53.5％,差异有统计学意义(P＜0.05);p16与p21基因的mRNA表达水平随着甲基汞染毒浓度的升高而升高,差异均有统计学意义(P＜0.05),但10 nmol/L与50 nmol/L组的p16基因表达差异无统计学意义.miR-24、miR-106a的表达水平随着甲基汞染毒浓度的升高而降低,差异有统计学意义(P＜0.05). [结论]50 nmol/L的甲基汞可以引起人胚胎神经干细胞增殖抑制,并可能通过miRNA调节细胞周期调控基因的表达.     

miR-137靶向下调SETD7表达对缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化应激的影响研究

目的探讨miR-137对缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤的作用及其机制。方法心肌细胞H9C2分为空白组、缺氧复氧组、缺氧复氧组+miR-con、缺氧复氧+miR-137组、缺氧复氧+miR-137+pcDNA组、缺氧复氧+miR-137+pcDNA-SETD7组。qPCR检测H9C2细胞中miR-137和SETD7 mRNA表达,Western blot检测SETD7、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,比色法检测LDH、MDA水平,流式细胞仪检测细胞凋亡,TargetScan预测结合双荧光素酶报告实验分析miR-137和SETD7的靶向关系。结果缺氧复氧明显降低H9C2细胞中miR-137、Cyclin D1表达量和细胞存活率(P<0.05),显著提高SETD7 mRNA及蛋白水平、LDH活性、MDA含量、Cleaved Caspase-3蛋白水平和细胞凋亡率(P<0.05)。上调miR-137表达促进缺氧复氧处理H9C2细胞内miR-137、Cyclin D1表达量和细胞存活率(P<0.05),明显降低SETD7蛋白、LDH、MDA、Cleaved Caspase-3水平和细胞凋亡率(P<0.05)。miR-137靶向调控SETD7表达。过表达SETD7部分逆转miR-137保护缺氧复氧处理H9C2细胞的作用。结论 miR-137通过靶向下调SETD7表达来促进缺氧复氧处理的心肌细胞增殖并抑制细胞凋亡,保护缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化应激损伤。     

miR-183在HPV相关型宫颈腺癌中的表达及其对LRIG1蛋白的调节作用研究

目的 探讨miR-183在HPV相关型宫颈腺癌中的表达及与富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域基因1(LRIG1)的相互作用关系。方法 实时定量PCR法检测HPV相关型宫颈腺癌组织中miR-183及LRIG1 mRNA的表达水平，Western blot法检测腺癌组织中LRIG1蛋白的表达。将miR-183 inhibitors(抑制物)、miR-183 mimics(模拟物)应用阳离子脂质体Lipofectamine TM2000转染至宫颈腺癌Hela细胞，并设立空白对照组、各自的阴性对照组，采用实时定量PCR法检测各组细胞中miR-183及LRIG1 mRNA的表达水平，Western blot法检测宫颈各组细胞中LRIG1蛋白的表达水平。结果 miR-183 mRNA在HPV相关型宫颈腺癌组织中的表达(0.91±0.10)明显高于正常宫颈组织(0.52±0.06),差异有统计学意义(P<0.05),而LRIG1的mRNA(0.56±0.03)及蛋白(0.09±0.02)表达水平均明显低于正常宫颈组织(mRNA:1.12±0.08,蛋白：0.25±0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组(1.06±0.06)相比，转染miR-183抑制物的腺癌Hela细胞中miR-183 mRNA的表达水平(0.69±0.07)显著降低，差异有统计学意义(P<0.05),转染miR-183抑制物的腺癌Hela细胞和对照组中，LRIG1 mRNA(分别为1.75±0.10、0.71±0.09)及其蛋白(分别为1.16±0.09、0.76±0.04)的表达水平反而均明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组(0.99±0.05)相比，转染miR-183模拟物的宫颈腺癌Hela细胞中miR-183 mRNA的表达水平(2.55±0.25)显著增高(P<0.05),转染miR-183模拟物的腺癌Hela细胞和对照组中LRIG1 mRNA(分别为0.40±0.05、0.75±0.08)及其蛋白(分别为0.32±0.01、0.76±0.06)表达水平反而均明显降低(P<0.05)。结论 miR-183在HPV相关型宫颈腺癌中呈高表达，可能通过抑制LRIG1的表达参与宫颈腺癌的发生和发展。     

miRNA200a调控二氧化硅诱导小鼠肺上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路的相关基因表达

目的观察过表达miRNA200a（miR-200a）重组慢病毒对二氧化硅（SiO2）诱导的小鼠肺上皮细胞株MLE-12细胞中Wnt/β-catenin信号通路的相关基因表达的影响。方法实验分为SiO2对照组（SiO2）、病毒对照组（SiO2＋Lv-NC）、miR-200a病毒组（SiO2＋Lv-miR-200a组）。各组细胞均用终浓度为200 μg/ml的SiO2刺激,培养18 h后,用实时荧光定量PCR（realtime-PCR）和蛋白免疫印迹技术（western blot）检测各组细胞β-链蛋白（β-catenin）、基质金属蛋白酶（MMP）2、MMP9、T细胞因子4（TCF-4）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）mRNA和蛋白表达水平。结果miR-200a病毒组MLE-12细胞的miR-200a表达明显高于SiO2对照组和病毒对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。与SiO2对照组和病毒对照组比较,miR-200a病毒MLE-12细胞的β-catenin、MMP2、MMP9、TCF-4和Cyclin D1 mRNA和蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）。 结论过表达miR-200a能够抑制SiO2诱导的小鼠肺上皮细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达。