华支睾吸虫Rap2B样基因的生物信息学分析及其克隆、表达

目的从华支睾吸虫cDNA文库中筛选Rap2B样基因并分析其结构和功能,初步进行克隆和表达纯化,为进一步研究其功能奠定基础。方法利用多种生物信息学分析软件,分析华支睾吸虫Rap2B蛋白的拓扑学结构、生物学和免疫学功能特征。设计引物,从华支睾cDNA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,构建原核重组质粒并初步表达纯化。结果华支睾吸虫Rap2B样基因长度为847bp,其全长编码序列为426bp,编码141个氨基酸,理论分子量是15851.1。重组的原核表达质粒pET-28a(+)-Rap2B经PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒构建成功。该基因在大肠杆菌中能高效表达。经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实Rap2B重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫Rap2B蛋白经生物信息学预测为ras原癌基因家族成员,可能在华支睾吸虫致癌过程中有一定作用。该基因可在原核表达系统中高效表达,并得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能以及在致病尤其是可能促发肿瘤的作用方面奠定一定基础。     

亚洲牛带绦虫36kDa胞浆型苹果酸脱氢酶基因的表达、纯化及免疫学分析

目的对亚洲牛带绦虫胞浆型苹果酸脱氢酶基因(malate dehydrogenase,MDH)进行克隆、表达和免疫学研究。方法将亚洲牛带绦虫成虫MDH克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-30a(+)-TaMDH重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能识别感染了亚洲牛带绦虫的猪血清,表明其具有免疫反应性。结论亚洲牛带绦虫苹果酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

华支睾吸虫Rho GTPase样基因的识别、克隆表达与免疫鉴定

目的 对新发现的华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）的Rho GTPase样基因进行克隆、表达和免疫学鉴定。方法 将用生物信息学方法识别的华支睾吸虫cDNA质粒文库中的Rho GTPase样基因的完整编码序列（CDS）克隆到原核表达质粒pET-30a（＋）中，在大肠埃希菌BL21中用IPTG诱导表达。表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白印迹（Western blotting）进行分析，并用镍离子金属螯合亲和层析柱进行纯化。结果 华支睾吸虫的Rho GTPase样基因的完整阅读框含576个碱基，编码192个氨基酸，理论分子量为21．7kDa。PCR、双酶切及DNA测序的结果均表明重组质粒pET-30a（＋）-Rho GTPase构建成功。SDS-PAGE结果表明Rho GTPase基因在大肠埃希菌BL21中获得了高效表达，重组蛋白可被感染华支睾吸虫的猫血清识别，表明其具有免疫反应性。亲和层析获得了高纯度的蛋白。结论 华支睾吸虫的Rho GTPase样基因可在原核系统中获得有免疫学活性的高效表达，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

华支睾吸虫一个谷胱甘肽转移酶新基因的克隆与表达

目的 克隆华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,Cs)谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase,GST)的一个新基因,并在大肠杆菌中表达。方法 用PCR方法从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库中扩增新基因CsGST1,对DNA及其推导的氨基酸进行序列分析。将CsGST1克隆到原核表达载体pET-30a(+),在大肠杆菌BL21/DE3表达,用SDS-PAGE鉴定重组蛋白。结果 从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库扩增出642 bp的CsGSTl,序列分析显示它所编码的氨基酸序列与麝猫后睾吸虫GST的同源性最高(88％),并具有GST N-末端和C-末端的保守功能域。构建了重组质粒pET-30a(+)-CsGST1,SDS-PAGE显示CsGST1在大肠杆菌中得到了高效表达,pET-30a(+)-CsGST1的蛋白条带的分子量约为30 kDa。结论成功构建了CsGST1的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究该基因的功能打下了基础。     

华支睾吸虫CsSCCRO基因的克隆表达和蛋白纯化

目的原核表达华支睾吸虫鳞状上皮癌相关肿瘤基因(SCCRO)全长编码区序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做好准备。方法用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA文库中识别出与人鳞状上皮癌相关基因的同源序列及其全长编码区,将其编码区序列克隆到原核表达载体PET-30a(+),测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,重组产物用His-镍蛋白纯化柱纯化。结果华支睾吸虫鳞状上皮癌相关基因长度为1 218bp,其全长编码序列长度为780bp,编码259个氨基酸,1-22位为分泌信号肽,在羧基端有一个高度保守的区域。该基因在大肠杆菌中得到了高效的可溶性表达,重组蛋白达总蛋白的39%,纯化后的重组蛋白纯度可达98%。结论鳞状上皮癌相关基因的PET-30a(+)原核重组质粒在大肠杆菌BL-21/DE3中可以稳定高效地表达可溶性蛋白。     

华支睾吸虫3个半胱氨酸蛋白酶N端短片段原核表达及其抗原性分析

目的 通过克隆和表达获得华支睾吸虫3个半胱氨酸蛋白酶N端短片段重组蛋白并分析其抗原性。方法 以pET-28a-CsCP1-3重组质粒为模板进行目的片段CsCP1a-3a PCR扩增,构建pET28a-CsCP1a-3a表达载体,并转化至BL21(DE3)大肠埃希菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE分析;表达产物经变性、纯化及复性,与华支睾吸虫感染大鼠血清行Western blot分析。结果 成功构建pET28a-CsCP1a-3a重组质粒;SDS-PAGE分析显示,重组蛋白CsCP1a-3a以包涵体形式表达;重组蛋白CsCP1a-3a可被华支睾吸虫感染后第4、5周大鼠血清识别。结论 重组蛋白CsCP1a-3a具有较好抗原性,可作为华支睾吸虫感染诊断候选分子。     

亚洲牛带绦虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因(Ta PITPα),探索其应用前景。方法将亚洲牛带绦虫成虫PITPα克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-Ta PITPα重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清和感染了亚洲牛带绦虫的猪血清识别,表明其具有免疫活性。结论亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因可在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得具有免疫活性的高效表达,为进一步的功能研究奠定了基础。     

华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基基因的克隆表达和重组蛋白的免疫原性分析

目的 对华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基（CsF₀-ATP-synt_B）基因进行克隆、表达及重组蛋白的免疫原性分析。 方法 以华支睾吸虫成虫cDNA文库中含有F₀-ATP合酶b亚基基因的质粒为模板，扩增该基因（去除线粒体靶向序列的成熟肽基因），将其克隆到原核表达质粒pET-28a（+）中，转化大肠埃希菌BL21（DE3），异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，经亲和层析获得的纯化表达产物免疫SD大鼠，制备抗血清。蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白的免疫原性。 结果 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基成熟肽基因的编码区含813个碱基，编码271个氨基酸，相对分子质量（Mr）为31 171.9。经亲和层析获得的重组蛋白可被其免疫的大鼠血清识别。 结论 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶两种表达方式的比较

目的 比较原核和真核2种表达系统重组表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶方法的优劣和目的产物的血清免疫学检测效果。方法 根据已知的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶序列分别设计引物扩增目的基因, 与相应的表达载体相连分别构建原核表达质粒pET28a?CP和真核表达质粒pPIC9K?CP, 双酶切及测序鉴定后, 将正确的重组质粒分别转入大肠埃希菌（E. coli） BL21 （DE3） 和毕赤酵母GS115中诱导表达、 纯化; 将获得的纯化蛋白采用ELISA方法检测华支睾吸虫病人血清和正常人血清, 比较诊断效果。结果 原核表达系统表达的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶以包涵体形式存在, 表达量为6.84 mg/L; 真核表达系统表达量达到65.00 mg/L, 且为可溶性蛋白; 两者检测华支睾吸虫病的敏感性分别为95.00%（57/60） 和 93.30% （56/60）, 特异性分别为91.67% （77/84） 和94.10% （79/84）, 差异均无统计学意义 （P均 > 0.05）。结论 真核表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶较原核表达系统具有更高的应用价值。     

华支睾吸虫19kDa分泌型蛋白(CsSP19)基因的克隆、表达与免疫学功能研究

目的对一个新发现的华支睾吸虫分泌型蛋白的未知基因,进行克隆表达和重组产物的免疫学鉴定,确定其免疫学功能。方法利用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA质粒文库中发现一个编码分泌型蛋白的新基因（克隆号Cs004f03）,将去除信号肽序列的编码序列克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,IPTG诱导表达,产物经亲和层析纯化,并制备大鼠免疫血清,Western-blot方法分析其抗原性和分泌性。结果CsSP19开放阅读框（ORF）有564bp,编码188个氨基酸,理论分子量为21.2kDa,成熟肽的理论分子量为19kDa。该基因的成熟肽编码区在大肠杆菌中可获得高表达,重组蛋白能被华支睾吸虫病人血清所识别,同时,重组蛋白免疫血清也能识别华支睾吸虫分泌排泄抗原中分子量约19kDa的蛋白条带。结论CsSP19蛋白是华支睾吸虫分泌排泄抗原中一个有潜在诊断价值的分泌蛋白。     

牛带绦虫亚洲亚种乳酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫原性分析

目的 对牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因（LDH）进行克隆、表达和免疫原性分析。 方法 将牛带绦虫亚洲亚种成虫TaLDH克隆到原核表达质粒pET-30a（+）中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH用蛋白质印迹（Western blotting）分析其免疫原性。 结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均显示重组质粒pET-30a（+）-TaLDH构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白,浓度为0.9 mg/ml。Western blotting分析结果显示,重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH能识别感染牛带绦虫亚洲亚种的猪血清和患者血清,在相对分子质量(Mr)35 000处有一清晰条带,表明其具有免疫反应性。 结论 牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达。     

亚洲带绦虫60S核糖体蛋白L8基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲带绦虫成虫60S核糖体蛋白L8基因（TaRPI。8）,探索其应用前景。方法用RT—PCR方法从亚洲带绦虫成虫cDNA中获取RPI．8基因,克隆到原核表达质粒pET一28a（＋）中,在大肠埃希茵BL21／DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a（＋）一TaRPL8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21／DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论亚洲带绦虫成虫TaRPI．8基因可在大肠埃希菌BL21／DE3中获得具有免疫原性的表达,为进一步的功能研究奠定了基础。     

亚洲带绦虫六钩蚴Ta 8基因的克隆表达及免疫原性分析

【摘要】 目的 原核克隆表达亚洲带绦虫六钩蚴8kDa基因(Ta 8),探索其表达蛋白在检测亚洲带绦虫感染中的应用价值。 方法 用RT-PCR方法从亚洲带绦虫六钩蚴cDNA中获取Ta 8基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。 结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-Ta 8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。 结论 本研究成功地构建了亚洲带绦虫六钩蚴8kDa基因重组质粒,在大肠埃希菌BL21/DE3中获得了成功表达;证明了8kDa基因表达产物具有免疫原性;还发现该绦虫成虫的头节、成节、孕节中也存在8kDa基因。     

广州管圆线虫ASP基因的克隆及原核表达

目的对广州管圆线虫ASP基因的完整开放读码框进行克隆、表达及重组蛋白的免疫性分析。方法以广州管圆线虫幼虫cDNA文库中含有ASP基因的质粒为模板,扩增目的基因,进一步将其克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-IDA亲和层析纯化表达产物。免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫性。结果广州管圆线虫ASP基因的编码区含有366个碱基,编码121个氨基酸,相对分子量(Mt)为13398.26Da。重组质粒pET-30a(+)-ASP构建成功,IPTG诱导获得可溶性表达的重组蛋白,经亲和层析获得的纯化蛋白可被广州管圆线虫病人血清识别。结论广州管圆线虫ASP基因可在原核表达系统中获得具有免疫性的高效表达。     

广州管圆线虫雌性成虫肌蛋白-1基因的克隆表达及免疫学效应分析

目的 对广州管圆线虫雌性成虫肌蛋白-1(Ac-fmp-1)基因的开放读码框进行克隆、表达及重组蛋白的免疫学效应分析,评价其重组蛋白在免疫学诊断中的应用前景。方法 逆转录聚合酶链反应扩增目的基因,克隆至原核表达载体pET-30a-c(+),重组质粒转化至大肠埃希菌E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍离子亲和层析(Ni-IDA)纯化分离表达产物。免疫印记(Western-blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析重组蛋白的免疫性。结果 广州管圆线虫Ac-fmp-1基因的编码区有1 251个碱基,编码417个氨基酸。原核表达载体pET-Ac-fmp-1构建成功,IPTG诱导表达获得了体外高效表达的重组融合蛋白,经亲和层析得到纯化蛋白。融合蛋白可被感染广州管圆线虫的SD大鼠血清及病人血清所识别;作为包被抗原用于ELISA检测大鼠血清其敏感性与特异性均为100%,与粗抗原无差别;检测广州管圆线虫病人血清敏感性为100%,与粗抗原有差别;检测其他寄生虫病人血清与正常病人血清其特异性为100%和98%,与粗抗原相比特异性较高。结论 广州管圆线虫Ac-fmp-1基因在原核表达系统获得高效表达,编码蛋白可能是虫体的重要抗原成分,在免疫学诊断方面有潜在的应用前景。