空肠弯曲菌peblA基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的：克隆空肠弯曲菌peblA基因，构建其原核表达载体；鉴定重组表达产物的免疫原性。方法：PCR扩增空肠弯曲菌peblA基因，构建pET-28a（＋）-peblA表达载体。转化E coli BL21（DE3）后诱导表达，用SDS—PAGE鉴定表达产物。采用Ni—NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEBl。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEBl免疫反应性，双向免疫扩散试验鉴定rPEBl免疫家兔的抗血清效价。结果：所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99．9％，转化E coli BL21（DE3）后，表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33％左右，纯化后获得纯度为96％的重组蛋白。Western blot证实rPEBl能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEBl血清的双向免疫扩散效价为1：16。结论：成功地构建了高效表达载体pET-28a（＋）-peblA，并获得rPEBl，所表达的rPEBl具有良好的免疫原性和免疫反应性，为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体体外表达鉴定

目的　从构建的A型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein)噬菌体单链抗体库中筛选阳性克隆,在大肠杆菌HB2 15 1中表达流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体,为研究A型流感病毒免疫渗漏试剂盒建立基础。方法　经过连续三轮固相“亲和-洗脱-富集”筛选,丰富噬菌体抗体库中阳性克隆的比例,采用ELISA、SDS PAGE和Western blot方法对大肠杆菌培养上清液和细菌周质腔蛋白进行分析目的产物。采用亲和层析方法对细菌周质腔蛋白进行分离纯化并进行单链抗体滴度分析。结果　从96个克隆中筛选到10个阳性克隆,其中三个阳性信号较强,分别为A1、E1和G3。其A4 50 分别达到0 . 4 6 9、0 . 5 82和0 . 5 0 7。A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体主要表达于细菌周质腔中,亲和纯化产物稀释4 0 .96倍,ELISA结果仍为阳性。结论　利用噬菌体抗体库技术,初步在大肠杆菌中表达了A型流感病毒噬菌体单链抗体。     

结核分枝杆菌Lsr2蛋白原核重组表达及其多克隆抗体制备

目的 利用原核系统获得重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备抗Lsr2多克隆抗体。 方法 以临床标准株 H37Rv DNA为模板,合成引物PCR扩增Lsr2核酸序列,插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,柱上复性纯化后,重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备并纯化抗Lsr2多克隆抗体,采用间接ELISA和Western-blotting实验对抗体进行验证。 结果 成功构建pET28a-Lsr2表达质粒,重组蛋白Lsr2经SDS-PAGE电泳鉴定分子量为14 kD。亲和层析及柱上复性后,纯化的重组蛋白纯度在95%左右。制备的抗Lsr2多克隆抗体效价在1:5.5×10⁶以上,并能特异性识别纯化的重组蛋白和结核分枝杆菌菌体蛋白。 结论 成功在原核系统内表达并纯化了重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备了高效价的抗Lsr2多克隆抗体,为进一步研究Lsr2蛋白的功能,筛选其下游相互作用蛋白以及相关分子机制研究奠定了基础。     

埃可病毒9型VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的原核表达并纯化埃可病毒9型(ECHO9)VP1蛋白,免疫兔子制备多克隆抗体,鉴定重组蛋白的免疫活性,为ECHO9血清学检测试剂和疫苗研究提供依据。方法 PCR方法扩增VP1基因,构建原核表达质粒p ET28a-VP1并转化到大肠杆菌(E.coli BL21),诱导表达并纯化VP1重组蛋白,免疫兔子制备抗VP1多克隆抗体,ELISA检测抗VP1抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性。病毒中和试验鉴定抗体中和ECHO9病毒的能力。结果 VP1重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP1抗体效价为1∶105。Western blot检测结果显示,抗VP1多克隆抗体可以识别原核表达的VP1蛋白。中和试验显示抗体对ECHO9病毒有中和作用,其效价为1∶10。结论本研究成功原核表达了ECHO9的VP1蛋白并制备出抗VP1多克隆抗体,有助于ECHO9的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究。     

基于单表达质粒的T7噬菌体病毒样颗粒制备、纯化及形态鉴定

目的 提供一种基于单表达质粒制备T7噬菌体病毒样颗粒（Virus-like particles, VLPs）的新策略,为后续构建基于T7噬菌体病毒样颗粒的载体疫苗或靶向药物奠定基础。方法 将T7噬菌体衣壳蛋白基因gp10A及支架蛋白基因gp9分别克隆至质粒pRSFDuet-1的MCS1及MCS2位点,转入大肠杆菌BL21(DE3)后进行诱导、表达及自主装,采用超高速离心及尺寸排除色谱对T7 VLPs进行纯化,利用 SDS-PAGE、透射电镜和动态光散射技术,对纯化后的T7 VLPs进行形态、结构、表型及粒径分析。结果 琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明成功构建pRSFDuet-1-gp9-gp10A质粒,SDS-PAGE电泳表明该质粒能在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达T7噬菌体衣壳蛋白Gp10A及支架蛋白Gp9,经尺寸排除色谱纯化后的纯度较高;通过透射电镜观察其自主装形成大小均一的VLPs结构,该VLPs平均粒径为70 nm,形态似T7噬菌体原衣壳结构。结论 利用pRSFDuet-1质粒同时表达T7噬菌体衣壳蛋白Gp10A和支架蛋白Gp9,能在大肠杆菌BL21(DE3)中自主装形成VLPs。     

新型隐球菌Cap10蛋白的重组表达及多克隆抗体制备

目的:重组表达新型隐球菌Cap10蛋白并制备特异抗体,为新型隐球菌的检测和诊断提供特异抗原和抗体。方法:选择CAP10基因开放阅读框架(ORF)抗原表位集中、保守性高的片段,经过大肠杆菌偏嗜的密码子优化后进行基因合成,将目的片段克隆至原核表达载体pQE30中构建重组蛋白表达载体pQE30-CAP10并鉴定,IPTG诱导重组蛋白在M15中表达,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定;镍柱纯化后,免疫家兔制备抗血清。结果:在大肠杆菌中成功表达Cap10,其纯度大于95%;二免后家兔血清抗体效价达到200万以上。结论:获得了高纯度的Cap10蛋白及高效价的多克隆抗体,为新型隐球菌的检测和致病机制研究奠定了基础。     

兔抗Cap43多克隆抗体制备和初步纯化

目的制备兔抗Cap43多克隆抗体。方法以30个氨基酸组成的多肽为半抗原与钥孔血蓝蛋白（mcKLH）通过碳化二亚胺（EDC）法化学偶联成完全抗原（多肽-mcKLH）免疫家兔；制备兔抗Cap4443多克隆抗体；斑点ELISA法检测抗体效价，经辛酸一硫酸铵法初步纯化抗体后，十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳考马斯亮蓝检测其纯化后的纯度。结果经免疫11周得到兔抗Cap43多克隆体，抗体效价为1：500。结论采用EDC化学偶联半抗原和大分子载体蛋白mcKLH，使其成为同时具有免疫原性与免疫反应性的完全抗原，用其免疫家兔获得多克隆抗体。     

抗日本血吸虫Sjp40鸡卵黄抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的制备抗日本血吸虫蛋白（sjp40）鸡卵黄抗体（eggyolkimmunoglobulinY,IgY）,以期为日本血吸虫病的免疫学诊断提供一种特异性强、灵敏度高的优势抗体。方法以纯化的sjp40抗原免疫健康SPF级产蛋鸡,初次免疫2周后开始每日收集的鸡蛋为样本,采用水稀释硫酸铵沉淀法从鸡蛋中初步提取抗sjp40IgY,进一步经透析袋、DEAE-FF阴离子交换柱纯化IgY。用SDS—PAGE、WesternBlot及ELISA对纯化后的抗sjp40IgY进行分析鉴定。结果纯化的特异性抗Sjp40IgY,抗体效价1：10。。相对分子质量为180kDa,SDS．PAGE可见有2条主要蛋白带,分别约为66kDa和35kDa。并可被sj040特异性识别。结论成功制备具有良好免疫反应性、特异性强、灵敏度高的抗Sip40特异性IgY抗体。     

GPC-3蛋白N端可溶性片段多克隆抗体的制备及鉴定

目的:通过原核表达并纯化GPC3-N端蛋白及根据分析GPC3-N端蛋白可能的抗原表位合成多肽,免疫家兔获得抗-GPC3多克隆抗体,为深入研究GPC3基因的功能及其临床应用奠定基础。方法:将GPC3-N端基因片段亚克隆至pQE30原核表达载体,表达带有6-His的GPC3的融合蛋白质,纯化蛋白后免疫家兔;同时应用Goldkey软件预测分析GPC3蛋白N端可能的抗原表位,根据分析结果合成多肽命名为lw1,免疫家兔,获得抗-GPC3多克隆抗体,并鉴定其特性。结果:成功表达出GPC3-N端蛋白,用纯化后的蛋白及合成的肽免疫家兔,获得特异性兔抗多克隆抗体,通过间接ELISA,Western blot和免疫荧光技术证实该多抗能识别原核表达的外源性及HepG2细胞内源性GPC3蛋白。结论:通过两种方法获得的蛋白免疫家兔都能获得能特异识别GPC3蛋白的多克隆抗体,将为GPC3基因的功能研究提供研究工具,并为临床原发性肝癌的血清学早期诊断提供新的标记物。     

人腺病毒7型DNA结合蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达人腺病毒（HAdV）7型DNA结合蛋白（DBP）,制备DBP蛋白多克隆抗体。方法:合成HAdV-7 DBP基因并克隆至pET30a载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导进行原核表达。经镍离子金属螯合层析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,使用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定该抗体效价...     

附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的原核表达及纯化

目的 构建人附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的重组质粒pET28a(+)-Eppin,并研究该质粒在原核细胞中的表达及纯化.方法 本研究以人睾丸组织cDNA为模板获得人Eppin基因片段,将其插入pET28a(+)载体His6-Tag上游,构建重组质粒pET28a(+)-Eppin,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IP...     

人胰岛素生长因子1的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化人胰岛素样生长因子1（hIGF-I）,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法通过RT-PCR方法从人体肝脏组织中扩增得到hIGF-I基因片段,构建重组原核表达质粒pET-28a（＋）/hIGF-I,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。将表达蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾脏和小鼠杂交瘤细胞融合制备针对hIGF-I的特异性单克隆抗体。结果成功表达出了hIGF-I蛋白。SDS-PAGE电泳显示所表达蛋白质的相对分子量（Mr）大小约为18 KD。获得了1株能够稳定表达抗hIGF-I抗体的杂交瘤细胞株（8F2）,其分泌的mAb的IgG亚类（型）为IgG2b,ELISA检测,对应腹水mAb的效价分别为1∶7.5×10^5。Western-blot结果显示抗hIGF-I mAb具有良好的特异性。结论成功制备了抗hIGF-I mAb,为进一步研究IGF-I在肿瘤治疗中的作用提供了有力的工具。     

穿透支原体主要外膜蛋白pET20b（＋）／p35重组载体的构建、表达及鉴定

目的构建高表达且稳定的pET20b( )/p35重载体,能在其中进行诱导高表达并得到纯化的p35蛋白.方法运用Blast、Pfam等生物信息学手段对穿透支原体(Mpe)p35基因序列结构与功能预测,将p35基因全长插入原核表达载体pET20b( )中,在BL21Star^TM(DE3)进行诱导表达、用Ni柱纯化,在GSH-GSSH体系中逐渐降低其变性剂的方法复性蛋白,Western-blot进行鉴定.结果成功的构建了pET20b( )/p35重组载体,并能在宿主菌中较高表达;此蛋白以包涵体的形式进行表达.结论得到了纯化的p35蛋白,为进一步研究其生物学功能及其空间结构奠定了基础.     

结核分枝杆菌CFP10 ESAT6重组融合蛋白抗原血清学诊断价值

目的研究重组CFP10 ESAT6蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,探寻更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rCFP10 ESAT6蛋白,通过酶联免疫吸附试验检测192例健康者和210例结核病患者血清与纯化rCFP10 ESAT6的抗体反应。结果 rCFP10 ESAT6蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量约占菌体总蛋白的25％,分子量约为28 kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rCFP10 ESAT6抗体的阳性率分别为30.10％(31/103)和28.97％(31/107),总的灵敏度为29.52%(62/210);在192例健康者血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗rCFP10 ESAT6抗体的阳性率分别为2.11%(2/95)和6.19%(6/97),总的特异性为95.83%(184/192)。结论rCFP10 ESAT6蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶Sap2多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶Sap2多克隆抗体,并对其进行鉴定。方法提取白假丝酵母菌基因组DNA为模板,经聚合酶链反应（PCR）获取SAP2目的基因;双酶切SAP2基因与原核表达载体pMAL c2x（+）,构建pMAL c2x/SAP2重组质粒;在大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达出可溶性的融合蛋白;用可溶性Sap2免疫小鼠制备抗血清,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗血清效价,亲和层析法纯化抗血清后,利用Western免疫印迹(Western Blot)检测抗体特异性。结果该研究成功制备了抗Sap2多克隆抗体,抗体效价＞1∶51 200;Western Blot检测结果表明,该抗体可特异性识别Sap2蛋白。结论纯化后的Sap2作为抗原免疫小鼠,有较好的抗原性和免疫原性,可成功制备多克隆抗体,并具有高特异性,为快速检测侵袭性白假丝酵母菌感染奠定了基础。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡配体克隆、表达及纯化

目的应用基因工程技术克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子胞外区(TRAIL)114~281片段的cDNA,构建其原核表达载体,建立原核表达体系。方法采用RT-PCR方法从外周血单个核细胞的总RNA中扩增TRAIL分子的cDNA,克隆入T载体,阳性克隆经过RT-PCR、酶切和测序鉴定。将阳性克隆中TRAIL再亚克隆至原核表达载体pET28a,构建的表达载体用RT-PCR和酶切来验证,IPTG诱导表达。融合表达蛋白复性后,再用层析纯化表达产物。结果电泳显示RT-PCR产物约500bp,与预期值一致。TA克隆RT-PCR和酶切鉴定时的片段大小也为500bp。阳性克隆测序结果与GeneBank报道一致。构建的原核表达载体经RT-PCR和酶切鉴定后用IPTG诱导后,得到大量的融合表达蛋白,此蛋白是以包涵体形式存在的,对表达的蛋白复性和纯化后,电泳显示得到一条约20kD的蛋白条带。结论成功地构建了人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子原核表达载体。