脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化

目的研究脂肪间充质干细胞(MSCs）在特定培养条件下向成骨细胞分化，探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫，消化法获得脂肪MSCs，用成骨诱导培养基诱导其向成骨细胞分化，组织化学染色、免疫细胞化学染色和Western blotting检测细胞分化的情况。结果从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪MSCs，能大量稳定增殖传代。在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导下，脂肪MSCs的ALP活性增高，Von Kossa染色出现钙结节，OPN、BMP-2免疫细胞化学染色阳性．Western blotting检测到诱导后细胞OPN、BMP-2的表达，且随诱导时间延长表达增强。结论从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的MSCs，并能在体外稳定增殖传代，经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞，有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一。     

脂肪间充质干细胞成神经元诱导分化研究进展

增加具有完整功能的种子细胞数目及提高其定向分化能力一直是组织工程研究的重要课题。脂肪间充质干细胞(ADSC)诸多优点在成体干细胞研究中备受青睐,有望成为组织工程种子细胞的新成员。该文就神经组织工程中ADSC生物学特性、获取与培养、成神经元分化能力及其与生物支架的相容性等方面的研究进展,作一综述。     

促进脂肪来源间充质干细胞成骨分化的诱导方法研究进展

脂肪来源间充质干细胞(ASCs)是一种多能成体干细胞,因安全、含量丰富、易于获取等优点而有望成为理想的骨组织工程(BTE)种子细胞。然而,相较于骨髓间充质干细胞,ASCs的成骨分化能力有限,往往需要进一步诱导。该文从优化支架、添加生物活性因子或促成骨药物、非编码RNA调控和物理刺激几个方面,对促进ASCs成骨分化的诱导方法的研究进展进行综述,以期为BTE研究提供参考。     

葛根素诱导脂肪干细胞成骨分化的实验研究

目的观察葛根素诱导卵巢切除后骨质疏松大鼠模型的脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)成骨分化的能力。方法分离、培养、传代及鉴定去卵巢骨质疏松模型大鼠ADSCs;含葛根素培养基诱导去卵巢骨质疏松大鼠ADSCs成骨分化,并测定最大有效浓度。结果去卵巢骨质疏松大鼠ADSCs成骨分化能力与加入含葛根素培养基的时间和培养基中葛根素的浓度呈正向相关,浓度为12 mmol/L时呈现无毒剂量下促进成骨分化最显著作用。结论葛根素具有较强促进去卵巢骨质疏松大鼠ADSCs成骨分化的诱导能力。     

不同浓度地塞米松诱导脂肪干细胞成骨分化的实验研究

目的地塞米松是MSCs成骨诱导分化的基础试剂,探讨诱导脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)成骨分化过程中地塞米松的优选浓度,为进一步骨组织工程研究提供理论依据。方法 3月龄清洁级健康新西兰大白兔5只,雌雄不限,体重2～3 kg。取腹股沟区皮下脂肪4～6 mL,采用胶原酶消化离心贴壁法分离培养ADSCs,取第3代细胞进行实验。倒置相差显微镜观察细胞形态变化;联合CD44、CD106免疫荧光染色和成脂诱导分化鉴定ADSCs。调整细胞密度为1×105个/mL,分别用普通培养液(A组)及含0(B组)、1×10-9(C组)、1×10-8(D组)、1×10-7(E组)、1×10-6(F组)、1×10-5 mol/L(G组)地塞米松的成骨诱导培养液对ADSCs进行培养。MTT法检测细胞增殖情况;RT-PCR检测诱导细胞骨钙素(osteocalcin,OC)和核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)的表达;测定ALP活性及矿化面积百分率;对矿化结节行茜素红染色。结果 ADSCs形态多为梭形、多角形,呈"漩涡状"排列;表面抗原分子CD44呈阳性,CD106呈阴性,成脂诱导后可观察到细胞内有脂滴形成,油红O染色呈阳性。MTT检测显示随地塞米松浓度升高,吸光度(A)值呈下降趋势;其中成骨诱导5、7 d时,D、E组A值比较差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测示,成骨诱导7 d OC和Cbfα1 mRNA的表达分别在E组和D组达高峰;成骨诱导14 d ALP活性和矿化面积百分率均在D组达高峰,随后逐渐下降。D、E组间OC和Cbfα1 mRNA的表达量、ALP活性及矿化面积百分率比较差异均无统计学意义(P>0.05),与其余各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。成骨诱导14 d,G组细胞均死亡;茜素红染色除A、G组外均呈阳性。结论成骨培养液中地塞米松浓度为1×10-8 mol/L时,能在减少对细胞增殖抑制的同时,更有效地诱导ADSCs成骨分化。     

兔脂肪干细胞的分离培养鉴定及成骨诱导分化研究

[目的]探讨在成骨诱导条件下兔脂肪干细胞的体外诱导分化情况：[方法]取3个月龄日本大耳白兔颈背部皮下脂肪，用Ⅰ型胶原酶消化获得细胞。Stro-1免疫细胞化学染色鉴定细胞性质；加入成骨诱导液后依次进行形态学、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积相关检测。[结果]（1）原代所获细胞Stro—1表达阳性？（2）在诱导条件下，Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积均呈阳性表达。[结论]脂肪干细胞来源广、易获取、对机体创伤小，与骨髓间充质干细胞类似，经体外诱导后可实现成骨分化，为骨组织工程提供了一种新的种子细胞：     

低氧对成骨生长肽诱导的小鼠间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨低氧对成骨生长肽(osteogenic growth peptide,OGP)诱导的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法将第三代小鼠BMSCs随机分为四组:对照组(A组,常氧条件下培养);1%O2组(B组,1%O2条件下培养);OGP组(C组,常氧条件下添加OGP培养)、1%O2联合OGP组(D组,1%O2条件下添加OGP)。分别于培养后1天、2天、3天、4天收集细胞,噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色法观察BMSCs增殖能力;培养7、14天后收集细胞,可见光比色法检测细胞碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase,ALP);培养1天后收集细胞,ELISA法检测低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)表达,培养3、7天后收集细胞,实时荧光定量PCR检测RUNX2、Osterix表达。结果 MTT结果显示,与C组相比,在培养第2、3、4天D组能明显促进BMSCs增殖(P0.05)。与C组相比,在培养第7、14天D组能明显上调ALP表达(P0.05)。与C组相比,在培养第3、7天D组能明显上调RUNX2、Osterix信使RNA表达(P0.05)。在培养后1天,A组及C组未能检测到HIF-1α蛋白,B组与D组HIF-1α表达明显增加(P0.001)。结论低氧明显增强了OGP促进BMSCs增殖及成骨分化的作用。     

真皮间充质干细胞成骨分化的研究进展

骨组织工程技术修复骨组织的缺损显示了广阔的应用前景.真皮间充质干细胞(Dermal mesenchymal stem cells,DMSCs)来源于皮肤组织,易大量获取,对供区损伤极小,具有包括成骨分化在内的多向分化潜能,有望成为骨组织工程研究合适的种子细胞.我们就真皮间充质干细胞成骨分化的研究进展进行综述.     

线粒体对间充质干细胞成骨分化功能的研究

间充质干细胞成骨分化能力异常减弱和成骨细胞数量异常下降都会导致生物体内骨代谢紊乱,诱导骨质疏松症的发生。线粒体在MSC多能性保持和成骨分化过程中具有十分重要的作用,通过能量代谢、抗氧化途径、代谢相关信号通路、线粒体生物发生、线粒体动力学和线粒体自噬等参与间充质干细胞成骨分化的调控,形成了复杂的调节网络。本文综述了MSC成骨分化中线粒体的重要功能和作用,以及部分通过调节线粒体功能发挥抗骨质疏松治疗的药物,为进一步探讨间充质干细胞成骨分化功能失调的机制提供新的思路,为临床治疗骨质疏松症提供新的靶点。     

成骨诱导的兔骨髓基质干细胞成骨活性的表达及维持

目的观察成骨诱导的兔骨髓基质干细胞(BMSCs)体内、外环境下成骨活性的表达及维持。方法观察BMSCs在体外成骨诱导培养条件下的成骨分化特性;构建兔BMSCs与活骨组织共培养模型模拟体内“成骨环境”,将成骨诱导的MSCs置于共培养及普通传代培养条件下进行传代培养,观察经成骨诱导的BMSCs在体外及模拟体内的培养条件下细胞的表型维持情况。结果药物成骨诱导培养的BMSCs,其ALP活性及骨钙素均显著高于普通培养组(P<0.05);经过诱导培养的BMSCs,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性。RT-PCR法半定量测定Ⅰ型胶原mRNA,成骨诱导培养的Ⅰ型胶原mRNA表达量明显高于普通传代培养对照组。药物成骨诱导后的细胞在体外普通传代培养传5代后,细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素水平及Ⅰ型胶原表达稳定维持在较高水平,保持其成骨细胞的表型;在共培养条件下,ALP活性、骨钙素水平Ⅰ型胶原表达保持在高水平,且ALP活性、骨钙素水平在大部分时间点均高于普通传代培养。结论药物成骨诱导培养呈现促BMSCs向成骨方向转化的特点,能使ALP、骨钙素及Ⅰ型胶原表达短期内达到高水平;经成骨诱导的BMSCs在体外或模拟的体内传代培养条件下,均能维持成骨表型,保持成骨活力。     

miRNA在间充质干细胞成骨分化过程中的作用

间充质干细胞作为种子细胞在组织工程和再生医学领域有极大的应用前景,尤其是在骨组织工程中的应用受到了广泛关注。间充质干细胞的成骨分化机制复杂,受到多方面因素的影响,不同种类的mi RNA可分别参与抑制或促进间充质干细胞的成骨分化,在其分化过程中具有核心作用。本文对不同作用的mi RNA进行归类和总结,期待为未来的研究提供思路。     

冻存复苏人脐带间充质干细胞体外扩增和向脂肪细胞分化的研究

目的：分离培养人脐带间充质干细胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells hUCMSCs）,观察其冻存复苏后向脂肪细胞定向分化的能力。方法：将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞,观察细胞生长及检测其表面抗原。将第1代的hUCMSCs采用梯度冷冻技术冻存5个月,复苏后培养至第12代时,加入成脂诱导剂培养。当诱导至21天时行油红O染色,7天及14天时用RT—PCR技术分别检测成脂转化基因过氧化物酶增殖剂受体（PPAR γ-2）和脂蛋白酯酶（LPL）。结果：组织块培养法收获的单个核细胞培养传代后,能获得均一贴壁的间充质干细胞,hUCMSCs冻存复苏后,活细胞约为86％,流式细胞仪分析这些细胞表达CDI3、CD44和CD71等MSCs标志物,不表达CD14、CD34和HLA—DR表面抗原。复苏细胞在成脂诱导剂的作用下,细胞中有脂滴产生,通过油红0染色显示细胞核周围有脂滴聚集,通过RT—PCR检测有LPL及PPARγ2 mRNA的表达。结论：采用组织块贴壁培养法分离获得的人脐带间充质干细胞可冷冻保存。复苏后培养至第12代仍具有向脂肪细胞分化的潜能,可作为脂肪组织工程种子细胞来源。     

脂肪干细胞体外诱导分化的研究进展

脂肪干细胞(Adipose Derived Stem Cells,ADSC)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞,能分化成为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞等多种组织细胞,很多因素参与这一过程的发生发展,现就脂肪干细胞的生物学特性及体外诱导分化的条件及影响因素进行综述。     

同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨修复大鼠尺骨缺损

目的探讨同种异体脂肪干细胞修复管状骨缺损的可行性。方法获取SD大鼠的腹股沟处脂肪,分离培养脂肪干细胞（Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs）;鼠第3代ADSCs与脱钙骨复合,24 h后进行成骨诱导培养。检测细胞在材料表面的生长及成骨分化能力。建立鼠两侧尺骨缺损模型,分别植入鼠ADSCs-脱钙骨复合物（实验侧）和单纯脱钙骨材料（对照侧）;8周、24周后取样,行DR和组织学检测,观察成骨情况。结果 ADSCs能在脱钙骨上很好地黏附和生长,并维持成骨分化能力。细胞-材料复合物植入24周后,DR显示实验侧有新生骨基质长成,对照侧未见骨组织生成。组织学检测显示,实验侧缺损区被典型的骨组织取代,可见新生骨小梁附着于脱钙骨表面;对照侧只有少量的骨组织和纤维组织充填。结论 ADSCs-脱钙骨材料复合物植入,能成功修复临界大小的管状骨缺损。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力.方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,流式细胞仪进行内皮细胞特异性标志物鉴定,测定内皮细胞NO的释放量,电镜观测W-P小体.结果:MSCs在体外传代扩增后流式细胞仪检测结果显示CD29表达阳性,CD34、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征并具特异性W-P小体,可表达CD34,而不表达CD45,能释放NO.结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化.     

帕米膦酸二钠对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的观察帕米膦酸二钠对人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)生物学特性的影响,以探索双磷酸盐导致骨组织损伤的机制。方法人骨髓MSC培养体系中加入不同浓度的帕米膦酸二钠,培养72 h后,MTT法测定490 nm光密度值,观察细胞增殖情况;培养1周后,流式细胞技术检测细胞表面分子表达。体外诱导MSC成骨分化,体系中加入1μg/mL帕米膦酸二钠,1周后PCR法测定细胞Runx-2表达水平,2周后组织化学法测定细胞内碱性磷酸酶活性,以细胞总蛋白量为参照,观察MSC成骨分化的差异。结果 MTT结果显示,在0.1~10μg/mL浓度范围内,帕米膦酸二钠抑制人骨髓MSC增殖,作用呈浓度依赖性,最低作用浓度为1μg/mL,72 h OD490显著低于对照组(P<0.01)。流式细胞检测显示,帕米膦酸二钠处理后,细胞仍均一表达CD44和CD73,不表达CD31和CD45。PCR及细胞化学结果显示,帕米膦酸二钠无促进MSC成骨分化作用,也未提高成骨诱导体系促分化效果。结论帕米膦酸二钠可抑制MSC增殖,不促进其体外成骨能力,可能是长期使用双磷酸盐导致骨损伤的机制之一。     

骨髓干细胞和脂肪干细胞对纳米磁铁颗粒的摄取性能研究

目的 研究两种纳米磁性氧化铁颗粒分别与骨髓干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)和脂肪干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)共培养时细胞对磁铁颗粒的摄取情况,以初步探讨其作为磁共振成像(MRI)对比剂去标记组织工程种子细胞而进行MRI示踪的可行性.方法 制备粒径为6 nm的Fe3O4磁性颗粒及经聚L-乳酸(PLLA)表面修饰的Fe3O4磁性颗粒(200 nm),分别在细胞接种时及接种后24小时两种方式加入.使用电感耦合等离子体质谱(ICP-OES)检测细胞对铁颗粒的摄取量.结果 细胞对铁颗粒的摄取量受纳米磁铁颗粒的种类,加入方式和细胞类型的影响.BMSCs和ADSCs对6 nm粒径磁铁颗粒的摄取量显著高于对200 nm铁颗粒的摄取量,而ADSCs摄取的量又高于BMSCs.结论 6 nm粒径的磁性氧化铁颗粒可以较好的被BMSCs和ADSCs吸收,具有良好的生物相容性,有望成为组织工程种子细胞的标记物来进行MRI示踪.     

Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum, and Adipose Tissue

Mesenchymal stem cells (MSCs) reside in many types of tissue and are able to differentiate into various functional cells including osteoblasts. Recently, adipose tissue–derived MSCs (AMSCs) have been shown to differentiate into many lineages, and they are considered a source for tissue regeneration. The purpose of this study was to compare the osteogenic differentiation capability of MSCs from bone marrow (BMSCs), MSCs from periosteum (PMSCs), and AMSCs using in vitro culture and in vivo implantation experiments. We harvested these MSCs from 7-week-old rats. The cells were seeded and cultured for 7 days in primary culture to assay a colony-forming unit. The frequency of the unit was the smallest in the BMSCs (P < 0.001). After primary culture, subculture was performed under osteogenic differentiation conditions for 1 and 2 weeks to detect mineralization as well as the bone-specific proteins of alkaline phosphatase and osteocalcin as osteogenic markers. BMSCs and PMSCs showed distinct osteogenic differentiation capability in comparison with other MSCs (P < 0.001). For the in vivo assay, composites of these cells and hydroxyapatite ceramics were subcutaneously implanted into syngeneic rats and harvested after 6 weeks. Micro-computed tomographic (CT) and histological analyses demonstrated that new bone formation was detected in the composites using BMSCs and PMSCs, although it was hard to detect in other composites. The CT analyses also demonstrated that the bone volume of BMSC composites was more than that of AMSC composites (P < 0.001). These results indicate that BMSCs and PMSCs could be ideal candidates for utilization in practical bone tissue regeneration.