大鼠黏结蛋白聚糖1基因重组腺病毒载体的构建及感染效率☆

背景：重组腺病毒质粒的构建方法主要有体外连接法和同源重组法。同源重组法有操作复杂、耗时长、效率低、纯化难的缺点。体外连接法又不可避免非特异性的基因重组及基因突变。 目的：应用改良体外连接法构建携带黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体，测定其在心肌成纤维细胞中的感染效率。 设计、时间及地点：单一样本实验，于2007-08/2008-02在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。 材料：穿梭载体pShuttle-CMV（含绿色荧光报告基因）和腺病毒骨架质粒pAdxsi购自诺赛基因组研究中心有限公司。 方法：核苷酸序列鉴定pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒；用KpnⅠ + XhoⅠ从质粒pCMV-Sport6.1-Sdc1切出黏结蛋白聚糖1基因片段，亚克隆至pShuttle-CMV中，形成重组穿梭质粒。用I-CeuI + I-SceI双酶切出重组穿梭质粒中CMV-Sdc1片段，亚克隆至腺病毒基因组质粒中，得到重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVSdc1，转化体外培养的心肌成纤维细胞。 主要观察指标：用DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒，并测定重组腺病毒的滴度和感染效率。 结果：①核苷酸序列分析表明，pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒正确携带大鼠黏结蛋白聚糖1 cDNA；黏结蛋白聚糖1基因被克隆于载体pShuttle-CMV上，以KpnⅠ + XhoⅠ双酶切可回收3 kb的克隆片段和5.1 kb的载体片段；重组腺病毒质粒用XhoⅠ酶切得到7个片段而空载体仅得到6个片段。②重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用；提取病毒DNA行聚合酶链反应鉴定可扩增出1.13 kb的特异性片段；用病毒上清多次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后，病毒滴度检测达2.0×1011 PFU/mL。③用纯化浓缩后的重组腺病毒以感染复数为100感染心肌成纤维细胞，24 h后所有细胞均表达绿色荧光。 结论：成功构建了携带大鼠黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体，经纯化浓缩后具有较高的滴度，能有效转染心肌成纤维细胞。     

超极化激活环化核苷酸门控通道基因转染猪骨髓间充质干细胞

背景：研究证实超极化激活环化核苷酸门控通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN）电流在调控心脏的自发搏动中起着非常重要的作用。 目的：观察HCN2基因重组腺病毒转染后猪骨髓间充质干细胞目的基因的表达及电生理特征。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外观察,于2007-07/2008-03在解放军第二军医大学胸心外科实验室完成。 材料：Yorkshire猪由解放军第二军医大学动物所提供,HCN2质粒由意大利Dario DiFrancesco教授惠赠,重组腺病毒Ad.HCN2由本实验室采用Ad5系统构建并保存。 方法：Percoll密度梯度离心+贴壁法体外分离纯化猪骨髓间充质干细胞,以感染复数=50进行Ad.HCN2转染,同时设立未转染组和转染Ad.Null组。 主要观察指标：通过RT-PCR、免疫荧光染色检测各组细胞HCN2 mRNA和蛋白的表达,用全细胞膜片钳检测各组细胞电生理学变化。 结果：未转染组和转染Ad.Null组均未见扩增片段,而Ad.HCN2扩增后在250~500 bp可见扩增片段,与携带HCN2基因的质粒扩增出的片段位置相同。转染后细胞核染色强度明显弱于胞膜和胞浆,与HCN2蛋白的分布相符合,未转染组及转染Ad.Null组无HCN2蛋白阳性表达。全细胞膜片钳可记录到起搏电流,其激活电位约为-60 mV,完全激活电位-140 mV,呈电压依赖性,当给予4 mmol/L CsCl后,内向的起搏电流即被明显抑制;未转染组及转染Ad.Null组细胞均无起搏电流。 结论：通过起搏基因HCN2重组腺病毒载体可成功转染猪骨髓间充质干细胞,使其能够表达HCN2通道蛋白,全细胞膜片钳可检测到起搏电流。     

大鼠蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因靶向RNA干扰重组腺病毒的构建

背景：研究者们早已发现蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase，PTP1B）可负性调节胰岛素信号转导，但目前制约PTP1B功能研究的重要环节是缺乏有效的工具。 目的：拟构建PTP1B基因靶向RNA干扰重组腺病毒。 设计、时间及地点：体外细胞学基因转染实验，于2007-05/12在解放军第二军医大学长海医院中心实验室完成。 材料：293细胞由中科院上海细胞研究所提供，真核表达质粒psiRNA-PTP1B由上海吉凯生物公司合成，AdEasy-1菌、穿梭载体pAdTrack、大肠杆菌DH5α由本室保存，重组腺病毒PCR鉴定引物由上海生工生物公司设计合成。 方法：由生物公司合成针对大鼠PTP1B mRNA的特异性siRNA真核表达质粒psiRNA-PTP1B，双酶切得到siRNA-PTP1B表达片段，插入pAdTrack载体上，获得转移质粒pAdTrack-siRNA-PTP1B。后者经线性化后，转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组，PacⅠ酶切鉴定，筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-siRNA-PTP1B，酶切线性化后转染293细胞包装成重组病毒颗粒。通过反复感染扩增病毒，采用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒。 主要观察指标：荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，鉴定重组腺病毒穿梭载体及重组腺病毒是否构建成功。 结果：PacⅠ酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAd-siRNA-PTP1B构建成功，转染293细胞后有绿色荧光蛋白表达。PCR鉴定表明重组腺病毒中含有siRNA-PTP1B片断，成功构建了携带PTP1B干扰RNA的重组腺病毒Ad-siRNA-PTP1B，293细胞扩增纯化后，获得约3.6×109 efu/mL滴度的重组腺病毒。 结论：应用AdEasy-1系统可以高效快速制备表达PTP1B干扰RNA的重组腺病毒。     

重组腺病毒携带的人GHS-R1a基因在人胚肾293细胞中的表达(英文)

目的构建携带GHS-R1a基因的重组腺病毒,为转基因做准备。方法采用PCR法扩增GHS-R1a基因片段,随后亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,形成重组质粒pAdTrack-CMV-GHS-R1a。线性化的pAdTrack-CMV-GHS-R1a和腺病毒骨架质粒pAdEasy1在感受态大肠杆菌BJ5183内同源重组。将线性化重组质粒pAdGHS-R1a转染进HEK293细胞,并用激光共聚焦显微镜、RT-PCR和Western blot技术检测绿色荧光蛋白及GHS-R1a的表达。结果重组质粒pAdGHS-R1a经Pac I酶切后得到一个大于30kb的大片段和一个4.5 kb的小片段,证明重组腺病毒质粒pAdGHS-R1a构建成功。Ad-GHS-R1a转染293细胞后24h能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR和Westernblot均证实GHS-R1a基因能在293细胞中有效表达。结论携带GHS-R1a基因的重组腺病毒构建成功,为进一步研究GHS-R1a的功能提供了基础。     

构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因腺病毒表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

血管内皮生长因子具有促进血管生成的作用,在骨缺损的治疗研究中运用较多,但其异构体VEGF121的研究较少。 目的：构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体并观测其在骨髓基质干细胞中的表达。 方法：以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去除VEGF121基因中终止密码子,之后在基因序列前后分别加入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点,并将得到的基因亚克隆至pMD19-T质粒上,双酶切pMD19-T-VEGF121和pShuttle-CMV-IRES- hrGFP-1质粒,凝胶回收小片段和大片段,后进行连接反应,完成穿梭质粒的构建。重组病毒物理滴度测定后感染骨髓基质干细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度。 结果与结论：经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功, 荧光显微镜下观察表明, 感染重组腺病毒的骨髓基质干细胞有明显的绿色荧光表达。可见构建的携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达, 有可能用于缺血性疾患的基因治疗。     

pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ载体构建及在兔骨髓间充质干细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增殖物激活受体γ是细胞分化重要的调控因子,通过调节其他转录因子的表达,参与调节骨髓间充质干细胞的分化。 目的：构建pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ真核表达载体,体外转染兔骨髓间充质干细胞,为过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体功能和基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-09/2008-07在南华大学附属一医院临床研究所完成。 材料：选择雄性2~5月龄新西兰大白兔,用于分离培养骨髓间充质干细胞。 方法：应用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,贴壁法不断纯化。从正常小鼠的肝组织中提取总RNA,反转录-聚合酶链反应法获得过氧化物酶体增殖物激活受体γcDNA,经Xho Ⅰ,Apa Ⅰ双酶切,定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ。 主要观察指标：经酶切分析和测序鉴定重组质粒中过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的完整性和真实性,脂质体介导下体外转染骨髓间充质干细胞,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率,提取总RNA和总蛋白,进行反转录-聚合酶链反应和Western blot检测。 结果：获得的过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因片段经酶切和测序鉴定正确,重组质粒经酶切和测序鉴定证实构建正确,成功转染骨髓间充质干细胞,在其中检测到目的基因及蛋白表达。 结论：实验成功构建了pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ重组质粒,同时在转染的骨髓间充质干细胞中获得了过氧化物酶体增殖物激活受体γ的高效表达。     

细菌内重组法快速构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体

背景：腺病毒载体具有在哺乳动物及其多种细胞基因转移和蛋白表达的高效性,目前以细菌内重组法构建病毒载体成为常用方法。 目的：观察以细菌内重组法构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体的可行性。 设计、时间及地点：基因转染病毒载体的单一样本实验,于2007-10/2008-02在中山大学分子生物实验室完成。 材料：合成血管内皮生长因子165基因的引物合成和序列测定由上海生工公司提供。pDNR-1r质粒(已含有绿色荧光蛋白基因)、pInt.AV.spaT质粒、pInt.B.B质粒均购自广州拓普基因技术公司。 方法：通过动态模板PCR 基因合成法合成的血管内皮生长因子165基因克隆入pMD18-T载体获得pMD18-T-VEGF165。将pMD18-T-VEGF165和pDNR经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,构建pDNR-VEGF165载体,酶切鉴定后,pDNR-VEGF165与pInt.AV1.spat共转化BNN菌株的感受态细胞,构建pInt.AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体,将线性化的pInt.AV1.SpaT-VEGF165和pInt.B.B转染293细胞。 主要观察指标：以DNA 测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的感染效率。 结果：重组质粒用EcoR Ⅰ酶切后,切成2条片段,大小约为1 kb和6.9 kb,实际的酶切分析结果与理论分析相符,证明转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有血管内皮生长因子165基因的重组质粒。荧光显微镜下,8 h后即可见部分细胞发出荧光,24 h发荧光的细胞数及强度达到高峰,转染率超过80%。线性化的pInt.AV1.SpaT-VEGF165和pInt.B.B共转染293细胞,12~14 d后会出现细胞病变效应。分别提取病变293细胞、正常293细胞的DNA,PCR后,1%琼脂糖凝胶电泳,病变的293细胞在约500 bp处出现条带。 结论：以细菌内重组法获得了含有成熟血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒。     

大鼠GLUT3基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带大鼠葡萄糖转运体3（GLUT3）基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，为研究GLUT3的生物学功能提供工具。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法获取大鼠GLUT3基因全长cDNA片段，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-GLUT3，经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α，构建重组腺病毒质粒pAd-GLUT3，酶切线性化重组腺病毒质粒后转染293细胞包装成重组病毒颗粒，重组腺病毒在293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反应（PCR）及免疫印记法（western blot）的方法从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果经DNA测序和PCR分析显示GLUT3 cDNA序列正确。成功筛选出重组腺病毒质粒pAd-GLUT3后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包装后冻融细胞行PCR及western blot检测表明重组腺病毒包装成功。结论本研究成功构建了携带大鼠GLUT3基因的复制缺陷型重组腺病毒载体。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒★

目的：AdEasy系统可在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组，经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞获得重组病毒，极大简化了载体的构建过程。实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒。 方法：实验于2006-08/2007-05在青岛大学医学院病毒学实验室完成。①实验材料：清洁级SD大鼠5只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，骨架质粒pAdeasy-1，大肠杆菌BJ5183和DH10B，人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物教研室罗兵教授惠赠。②实验方法：从脂多糖刺激培养的大鼠脾细胞中提取细胞总RNA，应用反转录多聚酶链反应技术扩增白细胞介素10 cDNA，定向亚克隆至pAdtrack-CMV中构建腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-IL-10，酶切线性化后转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌中，获得重组腺病毒质粒pAd-IL-10，Lipofectamin包装转染293细胞，获得重组腺病毒vAd-IL-10，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。将293细胞接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，浓缩后的病毒贮存液按不同比例稀释加至培养板中，测定重组腺病毒滴度。用重组腺病毒vAd-IL-10感染293细胞3 d后，以TRIzol一步法提取细胞总RNA，所获RNA加入DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后，PCR产物行琼脂糖电泳检测白细胞介素10 mRNA的表达。 结果：①重组腺病毒的包装及滴度测定：经限制性内切酶转染293细胞16 h后，荧光显微镜观察到细胞中有GFP荧光，可间接反映目的基因的表达。将病毒上清反复感染293细胞扩增重组腺病毒，通常传至第4~5代于接种病毒后24~48 h，几乎可观察到所有细胞出现荧光，此时收获病毒，重组病毒命名为vAd-IL-10。vAd-IL-10滴度为5.5×108 pfu/mL，vAd-GFP滴度为9.0×108 pfu/mL。②目的基因RT-PCR产物的鉴定：提取重组腺病毒感染293细胞总RNA，RT-PCR扩增后琼脂糖电泳显示特异性580 bp预计大小的片段，表明该重组腺病毒可在293细胞中有效转录。 结论：利用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了携带白细胞介素10基因的重组腺病毒载体，并制备出高滴度的重组腺病毒vAd-IL-10，可在293细胞中有效转录。     

白细胞介素12重组腺病毒质粒转染骨髓间充质干细胞

背景：有研究表明,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,强大的迁移力和趋瘤性,因而逐渐显露其具有作为抗肿瘤基因治疗负载体系的优越性。 目的：拟应用白细胞介素12重组腺病毒质粒AdEasy-白细胞介素12转染骨髓间充质干细胞,构建表达外源性白细胞介素12的骨髓间充质干细胞。 设计、时间及地点：以细胞为对象的开放性实验,于2008-06在辽宁医学院实验中心及中国医科大学实验中心完成。 材料：原代骨髓间充质干细胞由辽宁医学院外科学实验室构建,白细胞介素12重组腺病毒载体AdIL-12由辽宁医学院分子生物学实验室构建。 方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,免疫组织化学及流式细胞技术鉴定细胞表面标志物,应用腺病毒介导白细胞介素12基因转染大鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：以反转录-聚合酶链反应及Western Blotting技术检测转染后的骨髓间充质干细胞的白细胞介素12基因mRNA及蛋白表达。 结果：腺病毒介导白细胞介素12基因转染骨髓间充质干细胞后,通过反转录-聚合酶链反应及Western Blotting技术检测,结果证实白细胞介素12基因在mRNA及蛋白水平均有表达,而未经转染的骨髓间充质干细胞内无白细胞介素12基因及蛋白表达。 结论：应用白细胞介素12重组腺病毒质粒成功构建了在mRNA及蛋白水平表达外源性白细胞介素12基因的骨髓间充质干细胞。