血管内皮祖细胞与冠心病

<正>冠心病是病死率极高的疾病之一,其发病率仍在显著升高。通常,冠心病的治疗包括药物、介入和手术。虽然这些治疗也在不断发展,能够改善心肌缺血和心力衰竭的症状,使闭塞的血管再通,但均有其局限性。近年来的研究又发现骨髓、脐血和外周血中存在能分化为内皮细胞并参与血管新生的血管内皮祖细胞,于是在20世纪末,人们提出了用血管内皮祖细胞(EPC)治疗缺血性心脏病的构想。     

脐血内皮祖细胞梗塞心肌移植参与血管再生

目的 观察犬脐血内皮祖细胞(EPCs)参与梗死心肌血管再生.方法 从妊娠犬脐血提取EPCs,免疫组化鉴定,建立成年杂种犬冠状动脉梗死模型,将1,1-二(十八烷基)-3,3,3′, 3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(Dil)标记的EPCs移植入梗死区域,1、4、8周后于冠脉灌注Ⅰ型荆豆凝集素(UEA-1)标记EPCs,处死动物.取心肌标本HE染色确认梗死模型,并在荧光显微镜下观察Dil和UEA-1标记确认EPCs参与梗死心肌血管再生.结果 EPCs呈"铺路石"样外观,细胞标记白细胞分化抗原31阳性(CD31 ),血管性假血友病因子阳性(vWF ),胎肝激酶1阳性(FLK-1 ),白细胞分化抗原34阳性(CD34 );心肌梗死区可见有大量的瘢痕组织、成纤维细胞以及小血管再生;实验组梗死心肌区域标本内小血管上见Dil和UEA-1标记阳性细胞,对照组仅见UEA-1标记细胞.结论 犬脐血EPCs梗死心肌移植可参与血管再生.     

诺帝对人恶性胶质瘤细胞U87甲酰化肽受体功能的影响

探讨手性化合物诺帝对人恶性胶质瘤细胞甲酰化肽受体(formylpeptide receptor，FPR)功能的影响及其意义。以培养的人恶性胶质瘤细胞U87为研究对象，用FPR激动剂fMLF(n-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine)刺激细胞，以双室跨膜迁移模型检测细胞的迁移能力、计数法测定细胞的增殖能力、分光光度法测定细胞内钙流、RT-PCR方法测定血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA表达，以ELISA方法检测VEGF蛋白水平，并测定诺帝(25～100 μmol·L^-1)处理瘤细胞后上述功能指标的变化。50 μmol·L^-1诺帝能有效抑制fMLF诱导的细胞增殖、迁移(P<0.05)和细胞内钙流，100 μmol·L^-1诺帝能抑制VEGF mRNA表达，降低VEGF水平(P<0.05)。诺帝能抑制FPR介导的人恶性胶质瘤细胞增殖、迁移和VEGF产生，提示其具有抗肿瘤活性。     

慢性肾衰大鼠血管中VEGFa及内皮祖细胞标志物表达变化

目的研究大鼠5/6肾切除后引起慢性肾衰,进而诱发的大鼠胸主动脉血管内皮损伤随病程的进展,观察血管内皮细胞生长因子a（VEGFa）及内皮祖细胞标志物在血管组织中的表达变化。方法行5/6肾切除术制作大鼠血管活性损伤模型,自动生化测定仪测定血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平,体外灌流法测定胸主动脉舒张活性,real ti me PCR法测定mRNA的表达。结果大鼠血肌酐和尿素氮水平随病程进展显著升高,慢性肾衰形成;6周时乙酰胆碱刺激引起的血管舒张活性显著下降,提示血管内皮损伤,10周和14周时损伤进一步加重;血管中CD34,CD133,VEGFR2,VEGFa表达下调。结论 5/6肾切除可引起大鼠慢性肾衰,诱发大鼠胸主动脉血管内皮损伤;血管内皮生长因子表达下调,内皮祖细胞减少可能是血管随病程持续损伤的机制之一。     

熊果酸对兔外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

目的观察熊果酸对兔外周血内皮祖细胞(EPC)数量和功能的影响并探讨其可能的作用机制。方法以密度梯度离心法分离兔外周血单个核细胞,并接种于纤连蛋白包被的培养板上,予含内皮细胞生长添加剂(ECGS)的M199培养基培养14天,应用免疫荧光染色及流式细胞仪检测、鉴定内皮祖细胞,分别以MTT法、改良的Boyden小室、黏附能力测试、ELISA法观察不同浓度(5,10,50,100mmol/L)熊果酸对培养的EPC增殖、迁移、黏附及分泌功能的影响;同时观察糖皮质激素受体拮抗剂RU486预作用的效果。结果熊果酸可浓度依赖性减少兔EPC的数量,并减弱其增殖、迁移、黏附和分泌能力;RU486可部分逆转熊果酸的上述抑制作用。结论熊果酸可能部分通过糖皮质激素受体的介导影响EPC的数量和功能,而这种抑制作用可能使其在抗动脉粥样硬化和抗再狭窄的应用中受限。     

兔骨髓源血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定

目的 体外分离、培养、扩增血管内皮祖细胞(EPCs),观察EPCs生长分化过程并对其生物学特性进行鉴定.方法 采用密度梯度离心法从兔骨髓中提取单个核细胞,贴壁筛选法分离EPCs,于添加了Singlequotes的EBM-2培养液中扩增培养,对培养10d的细胞进行免疫荧光及免疫组织化学分析.结果 培养4 d,光电显微镜可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长;培养7～10 d,细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观;2周左右可见细胞排列成条索状结构.贴壁细胞呈DIL-ac-LDL及FITC-UEA-1双荧光阳性,阳性率为(65.0±4.0)%;贴壁细胞表达vWF,VEGFR-2和VE-cadherin的阳性率分别为(90.0±2.1)%,(77.0±4.1)%和(78.1±8.2)%.结论 骨髓中富含EPCs,成功建立了一整套骨髓源EPCs的分离、体外扩增培养的方法,且操作简便具有较好的可重复性.     

血管内皮生长因子基因对内皮细胞功能的影响

目的观察携带VEGF基因的腺病毒在成功转染内皮细胞后,转染的VEGF基因对内皮细胞功能的影响。方法用携带VEGF165腺病毒转染内皮细胞,分成VEGF,空病毒,PTK787及对照组,分别用ELIsA法检测细胞培养上清中的t-PA蛋白的含量,观察其对内皮细胞分泌t-PA蛋白的影响。结果携带VEGF165腺病毒人工血管促进内皮细胞分泌t-PA蛋白,而添加了PTK787组则显著抑制蛋白分泌,与对照组相比均有显著性差异（P〈0．05）。结论证实了携带含VEGF基因腺病毒可以转染内皮细胞并对内皮细胞的分泌功能产生影响。     

内皮祖细胞移植对缺血性血管新生的作用

广义的血管新生(neovascularization)是指产生新的血管或从已存在的血管形成毛细血管的过程.1997年Asaharad等[1]首次发现成体外周血循环中存在血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC),证实出生后的成体存在有血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis).两种生成血管机制,揭示了EPC参与机体内缺血性血管新生过程,从此拉开了EPC研究的序幕.     

血管内皮生长因子

血管内皮生长因子是一类能够特异地作用于血管内皮细胞,通过特异性受体发挥生物学作用的血管生长调控因子。促进内皮细胞增生;增加细胞质钙离子浓度;增加血管渗透性,改变细胞外基质,促进血管生成,其中一些因子还在淋巴管生成中起作用。本文对血管内皮生长因子的特征、生物学作用等进行了综述。     

血管内皮祖细胞与婴幼儿血管瘤

婴幼儿血管瘤是一种好发于婴幼儿的良性血管源性肿瘤,其种类多样,病因、病理、生长机制和生物学特性均尚未完全清楚;EPCs是血管内皮细胞的前体细胞,即能够增殖、迁移并分化为血管内皮细胞的祖细胞,相关的研究成果为有关血管源性肿瘤的基础研究打开了新的视角。近年来国内外在该领域的基础研究进展迅速,本文就成体EPCs的来源、特征、功能及其在血管瘤中研究等方面的研究现状进行综述。     

2型糖尿病对脑梗死患者血小板衍生内皮细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子的影响

目的观察2型糖尿病对急性脑梗死患者血清血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的影响。方法入选急性脑梗死患者73例(其中非伴随糖尿病患者32例设为A组,伴随糖尿病患者41例设为B组)、同期住院的合并2型糖尿病的非脑血管病患者30例(C组),以及不伴糖尿病的非脑血管病患者30例(D组)为研究对象。用双抗体夹心酶联免疫吸附实验法检测A组和B组患者在发病后第1,3,7,10~14天时的血清PD-ECGF、VEGF浓度,C组和D组患者检测入院第1天的血清PD-ECGF、VEGF浓度。用美国国立卫生院神经功能缺损评分(NIHSS)量表对A组和B组进行NIHSS评分。结果发病后1,3,7,10~14 d,A组的PD-ECGF分别为(5.93±1.25),(5.93±1.25),(4.19±1.23)和(3.67±1.06)μg·m L^-1,B组的PD-ECGF分别为(2.88±0.54),(2.84±0.53),(2.81±0.41)和(2.86±0.49)μg·m L^-1;A组的VEGF分别为(172.32±31.91),(254.36±49.56),(321.80±52.20)和(195.91±40.25)pg·m L^-1,B组的VEGF分别为(154.91±31.84),(158.69±29.27),(156.92±38.16)和(159.64±27.21)pg·m L^-1,2组各个时间点比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。入院第1天,C组和D组的PD-ECGF分别为(2.25±0.49)和(2.79±0.51)μg·m L^-1,VEGF分别为(94.90±19.85)和(151.11±30.33)pg·m L^-1,差异均有统计学意义(均P<0.05)。发病后第1天,A组和B组的NIHSS评分分别为(12.52±3.25)和(12.89±2.56)分,差异无统计学意义(P>0.05);发病后第10~14天,A组和B组的NIHSS评分分别为(4.24±1.87)和(6.48±2.15)分,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 2型糖尿病可通过降低脑梗死患者血清PD-ECGF和VEGF表达水平,影响患者的预后。     

欧芹素乙对人脐静脉内皮细胞的保护作用及对血管内皮生长因子表达的影响

目的:研究欧芹素乙对内皮细胞的保护作用;溶血磷脂酰胆碱(LPC)对人脐静脉内皮细胞株HUVEC细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响以及欧芹素乙的影响.方法:应用四唑盐(MTT)法检测溶血磷脂酰胆碱对HUVEC细胞的毒性作用及欧芹素乙的保护作用;应用基础酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组条件培养基中VEGF蛋白含量;采用RT-PCR法及Reahime PCR方法检测溶血磷脂酰胆碱对VEGF mRNA的表达及欧芹素乙的影响.结果:MTT检测结果显示,溶血磷脂酰胆碱对HUVEC细胞具有较强的生长抑制作用,而欧芹素乙对溶血磷脂酰胆碱所致的细胞增殖抑制具有较好的保护作用.ELISA结果显示,HUVEC细胞暴露于溶血磷脂酰胆碱后,VEGF蛋白含量明显升高;加入欧芹素乙后剂量依赖性地降低VEGF蛋白的表达.RT-PCR结果显示,溶血磷脂酰胆碱可以增加3种VEGF异构体的转录水平,其中VEGF165的表达显著增加,欧芹素乙可剂量依赖性地抑制溶血磷脂酰胆碱引起的VEGF mRNA的高表达.结论:欧芹素乙对溶血磷脂酰胆碱引起的细胞损伤有明显的保护作用;欧芹素乙可抑制溶血磷脂酰胆碱所诱导的HUVEC细胞中VEGF蛋白及VEGF mRNA的高表达,对内皮细胞起到保护作用.     

罗格列酮下调肺腺癌细胞血管内皮细胞生长因子的表达

目的探讨过氧化物酶增殖物活化受体γ(PPARγ)配体罗格列酮(RSG)对肺腺癌血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的调节作用,旨在进一步揭示PPARγ抑制肺腺癌血管生成的机制。方法体外培养人肺腺癌细胞株A549,给予不同浓度RSG作用24 h后,用免疫细胞化学检测VEGF蛋白的表达;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PPARγ、VEGF mRNA的表达。结果RT-PCR及免疫细胞化学结果显示A549细胞存在PPARγmRNA和蛋白的表达。RSG呈浓度依赖方式上调PPARγ的表达;1.25μmol.L-1RSG处理组VEGF mRNA表达明显下调,10μmol.L-1RSG下调作用最强,≥20μmol.L-1RSG下调作用减弱,100μmol.L-1RSG对VEGF mRNA表达下调与对照组比较无统计学意义;PPARγ阻断剂GW 9662明显减弱了RSG下调VEGF的作用(P<0.01或P<0.05,n=6)。结论PPARγ的活化可抑制肺腺肿瘤新生血管的生成,其机制可能是通过部分PPARγ途径下调VEGF的表达而实现的。提示PPARγ可能是肺腺癌血管生成治疗的1个新分子靶点。     

血管内皮生长因子受体-3在血管内皮细胞和平滑肌细胞中的表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子受体-3（VEGFR-3）在血管内皮细胞和平滑肌细胞中的表达。方法分离人脐带中的脐静脉和脐动脉,冰冻切片后以免疫荧光法检测VEGFR-3的表达。结果VEGFR-3荧光信号表达于脐静脉内皮细胞和平滑肌细胞,以及脐动脉内皮细胞、平滑肌细胞和外周细胞。结论血管内皮细胞和平滑肌细胞均表达VEGFR-3。     

益气养阴方对鸡胚尿囊膜移植瘤组织血管内皮生长因子表达的影响

目的：研究益气养阴方抗肿瘤诱导鸡胚尿囊膜（cAM）血管生成及对CAM移植瘤细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的效应。方法：制备接种肿瘤细胞的CAM模型,采用血清药理学方法制备含药血清。观察含药血清对肿瘤细胞诱导CAM血管生成的影响,并与生理盐水血清组对照。另外应用免疫组织化学及其组织形态学定量分析方法对VEGF在CAM移植瘤中的表达进行研究。结果：益气养阴方含药血清可抑制肿瘤细胞诱导CAM血管生成。益气养阴方组VEGF的表达均明显低于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：益气养阴方对肿瘤诱导的CAM血管生成有明显抑制作用,降低VEGF的表达可能是其抑制肿瘤血管生成的主要机制之一。     

重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的:观察重组人内抑素对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织血管内皮细胞生长因子(vascular endo-thelial cell growth factor,VEGF)的表达及其作用。方法:采用弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant,CFA)诱导的佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthri-tis,AA)大鼠模型,用足容积法测量关节肿胀度;免疫组织化学法检测血管内皮细胞生长因子的表达及其对微血管密度的影响。结果:弗氏完全佐剂致炎后d 10,佐剂性关节炎大鼠出现继发性炎症,皮下注射给予不同剂量的重组人内抑素(1.25、2.5、5 mg.kg-1),连续7 d,对照组于d 10给予氨甲喋呤(Methotrexate,MTX,1.0 mg.kg-1)。重组人内抑素各剂量组能明显抑制AA大鼠的继发性足肿胀,重组人内抑素各剂量组可不同程度减少AA大鼠关节滑膜组织高表达的VEGF,还可使滑膜组织的微血管密度减少。结论:重组人内抑素可显著抑制AA大鼠滑膜组织VEGF的表达及微血管密度,该作用可能与抑制血管翳的生成及减少滑膜细胞表面VEGF的表达有关。     

Homocysteine impaired endothelial function through compromised vascular endothelial growth factor/Akt/endothelial nitric oxide synthase signalling

1. Hyperhomocysteinaemia (HHcy) is associated with endothelial dysfunction and has been recognized as a risk factor of cardiovascular disease. The present study aimed to investigate the effect of homocysteine (Hcy) on endothelial function in vivo and in vitro, and the underlying signalling pathways. 2. The HHcy animal model was established by intragastric administration with l ‐methionine in rats. Plasma Hcy and nitric oxide (NO) concentration were measured by fluorescence immunoassay or nitrate reductase method, respectively. Vasorelaxation in response to acetylcholine and sodium nitroprusside were carried out on aortic rings. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were treated with indicated concentrations of Hcy in the in vitro experiments. Intracellular NO level and NO concentration in culture medium were assayed. The alterations of possible signalling proteins were detected by western blot analysis. 3. l ‐methionine administration induced a significant increase in plasma Hcy and decrease in plasma NO. Endothelium‐dependent relaxation of aortic rings in response to acetylcholine was impaired in l ‐methionine‐administrated rats. The in vitro study showed that Hcy reduced both intracellular and culture medium NO levels. Furthermore, Hcy decreased phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) at serine‐1177 and phosphorylation of Akt at serine‐473. Hcy‐induced dephosphorylation of eNOS at Ser‐1177 was partially reversed by insulin (Akt activator) and GF109203X (PKC inhibitor). Furthermore, Hcy reduced vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in a dose‐dependent manner. 4. In conclusion, Hcy impaired endothelial function through compromised VEGF/Akt/endothelial nitric oxide synthase signalling. These findings will be beneficial for further understanding the role of Hcy in cardiovascular disease.     

血管内皮生长因子对兔肾血管内皮细胞体外培养的影响

目的 探索血管内皮生长因子（VEGF）对兔肾血管内皮细胞（MVECs）体外培养的影响。方法采用三步梯度筛网法,获得纯度较高的肾血管球,0．5％胶原酶Ⅳ37℃消化15～20min,离心沉淀获取血管内皮细胞,分加与不加VEGF培养。对培养的细胞用倒置显微镜观察常规形态,用免疫组化法进行第Ⅷ因子相关抗原鉴定,用透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体,用间接免疫荧光法检测CD31、CD34及CD44的表达。结果加VEGF的MVECs原代3d铺满瓶底,3～4d传一代;不加VEGF的MVECs原代7～12d铺满瓶底,7～8d传一代。鉴定时两种培养的MVECs表达是一致的。倒置显微镜观察细胞铺满瓶底时呈典型的铺路卵石样结构,免疫组化法第Ⅷ因子相关抗原阳性,透射电镜观察到细胞浆中的Weibel-Palade小体,间接免疫荧光法检测CD31、CD34表达阳性,CD44阴性。结论VEGF对MVECs体外培养的影响无显著意义。     

Effects of puerarin on number and activity of endothelial progenitor cells from peripheral blood

AIM: To investigate whether puerarin can augment endothelial progenitor cells (EPCs) numbers, promote EPC proliferative, migratory, adhesive, and in vitro vasculogenesis capacity. METHODS: EPCs were characterized as adherent cells by double staining of DiLDL-uptake and lectin binding under a laser scanning confocal microscope. Expression of KDR, VEGFR-2, and AC 133 was detected by flow cytometry. EPCs proliferation, migration and in vitro vasculogenesis were determined with MTT assay, modified Boyden chamber assay, and in vitro vasculogenesis kit, respectively. EPCs adhesive assay was performed by replating those on fibronectin-coated dishes, then adherent cells were counted. RESULTS: Incubation of isolated human MNCs with puerarin 0.1-3 mmol/L increased the number of EPCs, EPC proliferative, migratory, adhesive, and in vitro vasculogenesis capacity in a concentration and time-dependent manner, which reached maximum at 3 mmol/L, 24 h (approximately 1-fold increase, P<0.01). CONCLUSION: Puerarin enhanced